MM_FS_CNG_0268谷物 维生素B1 含量 荧光分光光度法
MM_FS_CNG_0268
谷物维生素B1测定方法
1.适用范围
本标准适用于测定谷物中维生素B1的含量。
2原理概要
维生素B1（即硫胺素C12H17ON4SCl·HCl）在碱性条件下被铁氰化钾氧化成荧光色素——硫色素，硫色素在正丁醇中的荧光强度与样品中维生素B1的含量成正比，依此进行维生素B1的定量测定。
3主要试剂和仪器
3.1.主要试剂
盐酸，0.1mol／L溶液，将8.5mL盐酸用水稀释至1000mL；
硫酸，0.05mol／L溶液。将2.8mL浓硫酸加入水中，稀释至1000mL；
乙酸钠，2.5mol／L水溶液。205g无水乙酸钠或345g结晶乙酸钠溶于水，稀释至1000mL；
淀粉酶（可选用Takadiastase，或接近其活性的其他磷酸酯酶），60g／L悬浮液：用2.5mol／L乙酸钠溶液悬浮6g淀粉酶制剂，稀释至100mL；
氯化钾，250g／L水溶液；
酸性氯化钾溶液：将8.5mL浓盐酸加入250g／L氯化钾溶液中，并稀释至1000mL；
氢氧化钠，150g／L水溶液；
铁氰化钾，10g／L水溶液；
碱性铁氰化钾溶液：10g／L铁氰化钾溶液与150g／L氢氧化钠溶液按1∶14容积比配制。现用现配；
冰乙酸，30mL／L水溶液；
人造沸石：使用前必需活化，方法如下：
将适量人造沸石置于大烧杯中，加入十倍其容积的3％热乙酸溶液，用玻棒均匀搅动10min，使沸石在乙酸溶液中悬浮，待沸石沉降后，弃去上层乙酸液。重复上述操作一次。换用五倍其容积的热氯化钾溶液搅动清洗两次，每次15min。再用热乙酸溶液洗10min。最后用热蒸馏水清沸浮石至无氯离子（用10g／L硝酸银水溶液检验）。用布氏漏斗抽滤，烘干，贮于磨口瓶中备用；
使用前，检查沸石对硫胺素标准溶液的回收率，如达不到92％，需重新活化沸石；
硫胺素标准溶液：
硫胺素贮备液Ⅰ：盐酸硫胺素，于五氧化二磷干燥器中干燥24h，称取0.0500g，溶解于25％（V／V）乙醇水溶液中并定容至500mL，盛于棕色瓶中低温保存；
该溶液每毫升含0.1mg硫胺素；
硫胺素贮备液Ⅱ：取硫胺素贮备液Ⅰ10mL用25％乙醇液定容至100mL，盛于棕色瓶中低温保存；
该溶液每毫升中含10μg硫胺素；
硫胺素标准工作液：取贮备液Ⅱ2mL，与75mL盐酸溶液和5mL乙酸钠溶液混合，用水定容至100mL。现用现配；
该溶液每毫升中含0.2μg硫胺素；
硫酸奎宁硫酸奎宁贮备液：称取硫酸奎宁0.1000g，用0.05mol／L硫酸溶解并定容至1000mL，贮于棕色瓶中低温保存。若溶液混浊则需重新配制；
该溶液每毫升中含0.1mg硫酸奎宁；
硫酸奎宁工作液：取贮备液3mL，用0.05mol／L硫酸定容至1000mL，盛于棕色瓶中，低温保存；
该溶液每毫升中含0.3μg硫酸奎宁；
正丁醇，其荧光强度不超过硫酸奎宁工作液的4％，否则需用全玻璃蒸馏器重新蒸馏，取114～118℃馏份；
无水硫酸钠。
3.2.仪器
容量瓶：100mL，25mL；
吸附分离柱（见图1）；
反应瓶（见图2）；
注射器，20mL；
电热恒温水浴；
电热恒温箱；
荧光分光光度计。
4.试样的选取和制备
选取有代表性的谷物样品（带壳籽粒需脱壳），拣净杂质，按四分法缩减取样。
将谷物样品在60～65℃烘干后粉碎，过60目筛，装入磨口瓶中备用。
5.过程简述
5.1.称样：称取试样2.500g（约含硫胺素4～20μg），置于100mL容量瓶中。
同时称样，按GB 3523—83《谷类、油料作物种子水分测定法》测定试样水分含量。
5.2.提取
水解：将0.1mol／L盐酸75mL加入试样瓶中，经沸水浴加热30min，开始加热的5～10min内不时摇动容量瓶，以防结块。
酶解：冷却容量瓶至50℃以下，加5mL淀粉酶悬浮液，摇匀。该试液的pH约4.2～4.5。将容量瓶于45～50℃恒温箱中保温3h，取出冷却，用水定容。
过滤：将试液通过滤纸过滤弃去最初的5mL滤液，再收集滤液于100mL锥形瓶中。
5.3.提纯
制备吸附柱：取1g活化人造沸石置于50mL小烧杯中，加3％乙酸溶液浸泡。将脱脂棉置于吸附柱底部，用玻棒轻压。然后将乙酸浸泡的沸石全部洗入柱中（避免吸附柱脱水）。再用约10mL近沸的水洗柱，重复两次。
吸25mL提取液，慢慢加入制备好的吸附柱中（样液通过沸石的速度以1mL／min为宜），弃去滤液。用近沸的水洗吸附柱三次，每次约10mL，弃去洗液。
用25mL热酸性氯化钾分三次连续加入吸附柱，收集洗脱液于25mL容量瓶中，冷却后定容，混匀。
同时用25mL硫胺素标准工作液，重复上述操作，作为外标。
5.4.氧化与萃取（以下操作避免紫外光照射）
于两只反应管中各吸入5mL洗脱液，记作A、B。
向A管加3mL碱性铁氰化钾溶液，向B管加3mL氢氧化钠溶液，略摇，各加入15mL正丁醇，用力摇90s静置分层。
用注射器吸去下层水相。往各反应管加入约2g无水硫酸钠，旋摇，待测。
同时将作为外标的洗脱液按前三步操作，两只反应管相应地记作C、D。
5.5.测定
用硫酸奎宁工作液调整荧光仪，使其稳定于一定数值，作为仪器工作的固定条件。
于激发波长365nm，发射波长435nm处测定各反应管中萃取液的荧光强度。
6.结果的计算
6.1.计算公式
硫胺素（μg／g，干基）＝ | T－TB | ×C× | V | ||
S－SB | W（1－X） | ||||
式中：T——A管试液的荧光强度； TB——B管试液空白的荧光强度； S——C管标准溶液的荧光强度； SB——D管标准溶液空白的荧光强度； C——硫胺素标准工作液浓度，μg／mL； V——提取液总容积，mL； W——试样质量，g； X——试样的水分百分率，％。 | |||||
6.2.平行测定的结果用算术平均值表示，保留小数后二位，第三位按GB 1.1—81《标准化工作导则.编写标准的一般规定》中附录C数字修约规则取舍。
6.3.平行测定的相对差不得超过5％。
7.来源：
GB 7628—87