Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＲｅｈａｂｉｌｉｔａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｊａｎ．２０１８，Ｖｏ１．３３，Ｎｏ．１ ·基础研究· 电针对脑卒中肢体痉挛大鼠 一氨基丁酸代谢酶的 影响 毛雪莲 秦摘要 思 金荣疆 。朱天民 沈小雨’冯丽娟 目的：探讨电针通过调控Ｙ一氨基丁酸代谢酶改善脑卒中肢体痉挛大鼠肌张力的作用机制。 方法：将２４只ｓＤ大鼠分为正常组、假手术组、模型组和电针组。用大脑中动脉栓塞法建立局灶性脑缺血模型。电 针组造模成功后第３天开始取申脉，照海针刺治疗６天，其余组在同等条件下饲养，不做其他处理。采用Ｂｅｄｅｒｓｏｎ 评定神经功能，Ａｓｈｗｏｒｔｈ分级评定肌张力，Ｆｅｅｎｅｙ平衡木评分标准评定运动功能，免疫组化染色ｓＰ法、实时定量 ＰＣＲ￣１］定各组标本中ＧＡＢＡ．Ｔ、ＳＳＡＤＨ的表达。 结果：与模型组相比，治疗后电针组神经功能缺损症状改善（Ｐ＜０．０５）；肌张力降低（Ｐ＜０．０５）；运动功能提高（Ｐ＜ ０．０５）。免疫组化染色ｓＰ法示ＧＡＢＡ．Ｔ平均光密度值电针组颈膨大（模型组：０．２２５６＋０．０１９０；电针组：０．２０９４＋ ０．００８３）和腰膨大中（模型组：０．２１６３￣０．００８８；电针组：０．１９８８￣０．００５４）较模型组明显下降（Ｐ＜０．０５）；而脑干中较模型 组表达也有下降趋势（模型组：０．２１２９￣０．００８６；电针组：０．２０７２￣０．０１１９）。实时定量ＰｃＲ测定ＳＳＡＤＨｍＲＮＡ结果与 模型组比较显示电针组脑干（模型组：１．６７￣０．３８；电针组：１．２２－４－０．０７）、颈膨大（模型组：１．２７士０．２８；电针组：０．９６士Ｏ．０９） 和腰膨大中（模型组：１．０７￣０．３２；电针组：１．０８￣０．０７）表达均降低（Ｐ＜０．０５）。 结论：电针阴阳跷脉腧穴通过降低中枢系统中ＧＡＢＡ．Ｔ和ＳＳＡＤＨ的释放使ＧＡＢＡ的降解速度减慢，从而增加突触 间隙的ＧＡＢＡ浓度，增强ＧＡＢＡ的抑制作用是改善偏瘫肢体痉挛的可能机制之一。 关键词脑卒中；肢体痉挛；电针；’，一氨基丁酸转氨酶；琥珀酸半醛脱氢酶 文献标识码：Ａ 文章编号：１００１．１２４２（２０１８）．０１－０２２—０７ 中图分类号：Ｒ７４３．３，Ｒ４９３ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｅｌｅｃｔｒｏ－ａｃｕｐｕｎｃｔｕｒｅ ｏｎ —ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｅｎｚｙｍｅｓ ｉｎ ｒａｔｓ ｗｉｔｈ ｓｔｒｏｋｅ—ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｐａｓｔｉｃｉｔｙ／ＭＡＯ Ｘｕｅｌｉａｎ，ＱＩＮ Ｓｉ，ＪＩＮ Ｒｏｎｇｊｉａｎｇ，ｅｔ ａ１．／／Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｒｅｈａｂｉｌｉｔａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１８，３３ （１）：２２—２８ Ａｂｓｔｒａｃｔ ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｅｌｅｃｔｒｏ—ａｃｕｐｕｎｃｔｕｒｅ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｓｐａｓｍ ｉｎ ｓ￣ｏｋｅ—ｉｎｄｕｃｅｄ ｒａｔｓ ｂｙ ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｅｎｚｙｍｅｓ ｏｆ Ｔ－ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ（ＧＡＢＡ）． Ｍｅｔｈｏｄ：Ｔｗｅｎｔｙ—ｆｏｕｒ ＳＤ ｒａｔｓ ｗｅｒｅ ｄｉｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏ ｎｏｒｍａｌ ｇｒｏｕｐ，ｓｈａｍ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ ｇｒｏｕｐ，ｍｏｄｅｌ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ｅｌｅｃｔｒｏ－ ａｃｕｐｕｎｃｔｕｒｅ ｇｒｏｕｐ．Ｔｈｅ ｆｏｃａｌ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｍｏｄｅｌ ｗａｓ ｂｕｉｌｔ ｂｙ ｍｉｄｄｌｅ ｃｅｒｅｂｒａｌ ａ￣ｅｒｙ ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ． Ｔｈｒｅｅ ｄａｙｓ ａｆｔｅｒ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｔｈｅ ｍｏｄｅｌ，ｗｅ ｎｅｅｄｌｅｄ ｔｈｅ ｅｌｅｃｔｒｏ—ａｃｕｐｕｎｃｔｕｒｅ ｇｒｏｕｐ ｏｎ ＢＬ６２ ａｎｄ ＫＩ ６ ｆｏｒ ６ ｄａｙｓ，ａｎｄ ｆｏｒ ｏｔｈｅｒ ｇｒｏｕｐｓ，ｗｅ ｄｉｄ ｎｏｔ ｐｅｒｆｏｒｍ ａｎｙ ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ．Ａｌｌ ｔｈｅ ｒａｔｓ ｉｎ ｇｒｏｕｐｓ ｗｅｒｅ ｆｅｄ ｔｈｅ ｓａｍｅ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｃａｌｅｓ ｓｕｃｈ ａｓ Ｂｅｄｅｒｓｏｎ ｓｃａｌｅ ｆｏｒ ｎｅｕｒａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ａｓｈｗｏｒｔｈ ｓｃａｌｅ ｆｏｒ ｍｕｓｃｌｅ ｔｅｎｓｉｏｎ，Ｆｅｅｎｅｙ’ Ｓ ｂｅａｍ—ｗａｌｋｉｎｇ ｓｃａｌｅ ｆｏｒ ｍｏｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ｅｍｐｌｏｙｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｉａ１．Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ—ＳＰ ｓｔａｉｎ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ｍｅｔｈｏｄ ｗｅｒｅ ｅｍｐｌｏｙｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＧＡＢＡ－Ｔ ａｓ ｗｅｌｌ ａｓ ＳＳＡＤＨ． Ｒｅｓｕｌｔ：Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｍｏｄｅｌ ｇｒｏｕｐ，ｅｌｅｃｔｒｏ—ａｃｕｐｕｎｃｔｕｒｅ ｇｒｏｕｐ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｉｃａｎｔｌｆｙ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｉｎ ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｄｅｆｉｃｉｔ ＤＯＩ：１０．３９６９￣．ｉｓｓｎ．１００１—１２４２．２０１８．Ｏ１．００５ 基金项目：国家自然科学基金资助项目（８１２７３８５２） １成都中医药大学康复教研室，成都，６１００７５；２通讯作者 作者简介：毛雪莲，女，硕士，讲师；收稿日期：２０１６—０７—１１ ２２ ＷＷＷ．ｒｅｈａｂｉ．ｃｏｒｒｔ．ｃｎ 中｛回旆重匮学骠忐 ２ｏ１８年，第３３卷，第１期 （Ｐ＜０．０５）ａｎｄ ｍｕｓｃｌｅ ｔｅｎｓｉｏｎ（Ｐ＜０．０５）ａｓ ｗｅｌｌ ａｓ ｍｏｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ（Ｐ＜０．０５）．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ＳＰ ｍｅｔｈｏｄ ｓｈｏｗｅｄ ａ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｍｅａｎ ｏｐｔｉｃａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ ｏｆ ＧＡＢＡ—Ｔ ｉｎ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｅｎｌａｒｇｅｍｅｎｔ（ｔｈｅ ｍｏｄｅｌ ｇｒｏｕｐ： ０．２２５６士０．０１９０；ｔｈｅ ｅｌｅｃｔｒｏ－ａｃｕｐｕｎｃｔｕｒｅ ｇｒｏｕｐ：０．２０９４－４－０．００８３），ａｎｄ ｉｎ ｌｕｍｂａｒ ｅｎｌｒｇｅｍｅｎｔ（ａｔｈｅ ｍｏｄｅｌ ｇｒｏｕｐ： ０．２ １ ６３ ４－０．００８８；ｔｈｅ ｅｌｅｃｔｒｏ—ａｃｕｐｕｎｃｔｕｒｅ ｇｒｏｕｐ：０．１ ９８８－４－０．００５４）（Ｐ＜０．０５）．Ａ ｄｅｃｌｉｎｉｎｇ ｔｅｎｄｅｎｃｙ ｗａｓ ｎｏｔｉｃｅｄ ｉｎ ｅｌｅｃｔｒｏ—ａｃｕｐｕｎｃｔｕｒｅ ｇｒｏｕｐ ｉｎ ａｖｅｒａｇｅ ｏｐｔｉｃａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ ｏｆ ＧＡＢＡ—Ｔ ｉｎ ｔｈｅ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｓｔｅｍ（ｔｈｅ ｍｏｄｅｌ ｇｒｏｕｐ：０．２ １ ２９４－ ０．００８６；ｔｈｅ ｅｌｅｃｔｒｏ－ａｃｕｐｕｎｃｔｕｒｅ ｇｒｏｕｐ：０．２０７２４－０．０１ １９）．Ａｌｓｏ．ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ａ ｄｅｃｌｉｎｅ ｉｎ ＳＳＡＤＨｍＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｅｌｅｃｔｒｏ—ａｃｕｐｕｎｃｔｕｒｅ ｇｒｏｕｐ ｉｎ ｔｈｅ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｓｔｅｍ（ｈｅ ｍｏｄｅｌｔ ｇｒｏｕｐ： １．６７４－０．３８；ｔｈｅ ｅｌｅｃｔｒｏ—ａｃｕｐｕｎｃｔｕｒｅ ｇｒｏｕｐ：１．２２￣０．０７），ｃｅｒｖｉｃａｌ ｅｎｌａｒｇｅｍｅｎｔ（ｔｈｅ ｍｏｄｅｌ ｇｒｏｕｐ：１．２７４－０．２８；ｔｈｅ ｅｌｅｃ— ｒｔｏ—ａｃｕｐｕｎｃｔｕｒｅ ｇｒｏｕｐ：Ｏ．９６４－０．０９）．ａｎｄ ｔｈｅ ｌｕｍｂａｒ ｅｎｌａｒｇｅｍｅｎｔ（ｔｈｅ ｍｏｄｅｌ ｇｒｏｕｐ：１．０７￣０．３２；ｔｈｅ ｅｌｅｃｔｒｏ－ａｃｕｐｕｎｃ— ｔｔｔｒｅ ｇｒｏｕｐ：１．０８４－０．０７）（Ｐ＜０．０５）． Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｉｔ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｏｎｅ ｏｆ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｔｈａｔ ｅｌｅｃｔｒｏ—ａｃｕｐｕｎｃｔｕｒｅ ｏｎ ｔｈｅ ａｃｕｐｏｉｎｔｓ ａｌｏｎｇ ｙｉｎ ａｎｄ ｙａｎｇ ｈｅｅｌ ｖｅｓｓｅｌｓ ｃａｎ ｉｍｐｒｏｖｅ ｓｔｒｏｋｅ·－ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｐａｓｔｉｃｉｔｙ ｂｙ ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｔｈｅ ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ＧＡＢＡ·－Ｔ ａｎｄ ＳＳＡＤＨ ｉｎ ｔｈｅ ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ，ｗｈｉｃｈ ｃｏｕｌｄ ｅｌｅｖａｔｅ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ＧＡＢＡ ｉｎ ｔｈｅ ｓｙｎａｐｔｉｃ ｃｌｅｆ ｔｏ ｅｎｈａｎｃｅ ｔｈｅ ｉｈｉｎ— ｂｉｔｉｏｎ ｅｆｒｅｃｔ ｏｆ ＧＡＢＡ． Ａｕｔｈｏｒ‘Ｓ ａｄｄｒｅｓｓ Ｔｅａｃｈｉｎｇ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｈａｂｉｌｉｔａｔｉｏｎ，Ｃｈｅｎｇｄｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｃｈｅｎｇｄｕ，６ １ ００７５ Ｋｅｙ ｗｏｒｄ ｓｔｒｏｋｅ；ｌｉｍｂ ｓｐａｓｔｉｃｉｔｙ；ｅｌｅｃｔｒｏ·－ａｃｕｐｕｎｃｔｕｒｅ；，／—·ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃａｃｉｄ ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ；ｓｕｃｃｉｎｉｃｓｅｍｉａｌｄｅｈｙｄｅｄｅ·· ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ 针刺疗法是治脑卒中后肢体痉挛性瘫痪的主要 治疗方法，疗效确切。脑卒中后肢体痉挛机制目前 认为是兴奋性神经递质相对增加，抑制性氨基酸类 神经递质相对或绝对减少，导致突触前抑制作用的 １．１实验动物及分组 健康成年ＳＤ大鼠２４只，清洁级，雌雄各半，体 重２６０－－３２０ｇ，简阳达硕生物有限公司提供，许可 证：ｓｃｘｋ（ｍ）２０１３．２４。大鼠适应性喂养１周，将大鼠 分为：空白组、假手术组、模型组、电针组，每组６只。 下降 。１，一氨基丁酸（丫一ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃａｃｉｄ，ＧＡＢＡ）作 为中枢神经系统中最主要的抑制性神经递质，是突 触前抑制的媒介物，介导大部分快速抑制性突触传 递 。前期研究Ｈ 证实针刺可以通过调高神经组织 中ＧＡＢＡＩ３受体ｍＲＮＡ表达，发挥ＧＡＢＡ突触前后 的抑制作用，从而缓解脑卒中后肢体痉挛的症状。 本研究以ＧＡＢＡ分解代谢相关酶为主要靶点，将跷 １．２主要实验试剂及材料设备 ＭＣＡＯ线栓（规格：２６３６．５０、２８３８。５Ｏ：北京沙东 生物技术有限公司）；１，一氨基丁酸转氨酶抗体（ＧＡ． ＢＡ—Ｔ），总ＲＮＡ提取试剂ｆ１００Ｐｒｅｐｓ；美国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ 公司）；ＲＮＡｉｓｏ ｐｌｕｓ ｋｉｔ、Ｐｒｉｍｅ Ｓｃｒｉｐｔ ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ ｋｉｔ、ＳＹＢＲ ＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑ １１ Ｋｉｔ（大连宝生物工程有 脉“阴阳缓急”的致病特点与现代医学痉挛的产生及 缓解作用机制相结合，抓住针刺“调和阴阳”的功能， 采用免疫组化染色ｓＰ法、实时定量ＰＣＲ技术，观察 电针跷脉穴位对脑干网状结构和脊髓颈、腰膨大组 织ＧＡＢＡ转氨酶（ＧＡＢＡｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ，ＧＡＢＡ．Ｔ）和 限公司）；Ｇ６８０５—１１型多通道电针治疗仪（青岛鑫升 实业有限公司）。 １．３方法 １．３．１模型制作及评价方法：模型组、电针组参照改 琥珀酸半醛脱氢酶（ｓｕｃｃｉｎｉｃｓｅｍｉａｌ ｄｅｈｙｄｅｄｅｈｙ— ｄｒｏｇｅｎａｓｅ．ＳＳＡＤＨ）的影响，探讨电针阴阳跷脉穴位 良ＺｅａＬｏｎｇａｔ 法制作右侧大脑中动脉栓塞（ｍｉｄ． ｄｉｅ ｃｅｒｅｂｒａｌ ａａｅｒｙ ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ，ＭＣＡＯ）模型。造模完 成后腹腔注射庆大霉素２万ｕ，连续注射３ｄ；术后按 ０．１ｍｇ／ｋｇ￣１］量注射速尿，防止脑水肿；灯照保暖保持 肛温３７℃左右。假手术组只切开皮肤，分离出颈总、 颈内、颈外动脉，不予结扎和插入线栓，然后消毒缝 改善脑卒中后阴阳缓急失衡，缓解痉挛的分子生物 学机制，也为传统中医理论指导临床治疗探索新的 结合点。 １材料与方法 合。空白组不做任何处理。于术后２ｈ进行神经功 能缺损评定ｐ 。０分：无神经功能症状；１分：不能完 Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＲｅｈａｂｉｌｉｔａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｊａｎ．２０１ ８，Ｖｏ１．３３，Ｎｏ．１ 全伸展手术对侧前爪；２分：行走时，向手术对侧转 圈；３分：行走时，向手术对侧倾倒；４分：不能自发行 走，意识丧失。术后第３天采用Ａｓｈｗｏｒｔｈ分级标 准吲评定肌张力。０级：被动活动偏瘫侧肢体时，大 鼠活动自如，无肌张力增高；１级：在屈伸过程中出 现一过性停顿，轻度肌张力增高；２级：被动活动困 难但肢体尚易屈伸，肌张力明显增高；３级：被动活 动困难；４级：肢体屈伸受限。神经功能缺损评分为 ｌ＿４分，Ａｓｈｗｏｒｔｈ分级１级及以上提示造模成功。 评分为０分及术中、术后死亡者予以剔除，用同一批 次的造模成功大鼠补足数量。 １．３．２治疗方法：电针组造模成功后３天开始，参照 《实验针灸学》ｐ 取穴，在偏瘫后肢外踝正下方凹陷 中取申脉，直刺０．５ｃｍ；在偏瘫后肢内踝下ｌｍｍ取照 海，直刺０．５ｃｍ；选用苏州医疗用品生产的０．２５× １３ｍｍ的无菌针灸针；采用Ｇ６８０５．Ⅱ型多通道电针 仪，以频率１００Ｈｚ，波宽０．３ｍｓ的连续波刺激，刺激强 度以被刺激后肢出现有节律的收缩、颤动为度。 ３０ｍｉｎ／次，１次／ｄ，连续治疗６ｄ。空白组、假手术组和 模型组在同等条件下饲养，自由进食饮水，不做其他 处理。 １．３．３检测方法。 １．３．３．１ Ｂｅｄｅｒｓｏｎ评分评定神经功能 ：由不知分组 情况的实验人员于术后第ｌ天，第３天（治疗前）及第 ９天（治疗后）对大鼠进行评定，轻抓大鼠尾巴，提起 高于桌面１０ｃｍ，用手轻推大鼠肩部，直到前肢滑动 几厘米，这一动作在不同方向重复数次。正常大鼠， ２个前爪伸向桌面，会在不同方向以同样的力抵抗 推力，脑损伤大鼠其偏瘫侧前肢屈曲。０分：无神经 功能缺损；１分：前肢屈曲，即提尾实验阳性；２分：侧 推抵抗力下降，即侧向推力实验阳性，伴前肢屈曲， 无转圈行为；３分：同２分行为，伴自发性旋转，自由 活动时向偏瘫侧划圈。 １．３．３．２ Ａｓｈｗｏｒｔｈ分级评定肌张力：各组大鼠在术 后第３天（治疗前），第９天（治疗后）分别进行Ａｓｈ— ｗｏｒｔｈ分级测定治疗前后肌张力变化，Ａｓｈｗｏｒｔｈ分 级标准见模型成功判断。 １．３．３．３ Ｆｅｅｎｅｙ平衡木评分标准评定运动功能 ： 由不知分组情况的实验人员分别于术后第１天、第３ 天（治疗前）及第９天（治疗后）对大鼠进行评分。将 长８０ｃｍ宽２．５ｃｍ的平衡木平放在距离地面高１０ｃｍ 处，让大鼠在上面行走，评定其运动功能。０分：大 鼠能跳上平衡木，在上面行走不会跌倒；１分：大鼠 能跳上平衡木，在上面行走跌倒机会小于５０％；２ 分：大鼠能跳上平衡木，在上面行走跌倒机会大于 ５０％；３分：大鼠在健侧后肢帮助下能跳上平衡木，但 偏瘫侧后肢不能帮助向前移动；４分：大鼠在平衡木 上不能行走，但可坐在上面；５分：将大鼠放在平衡 木上会掉下来。得分越高，说明大鼠运动功能越差。 １．３．３．４免疫组化染色ｓＰ法、平均光密度测定ＧＡ． ＢＡ—Ｔ蛋白表达：治疗结束后，麻醉剪断股动脉处死， 取一部分脑干、颈膨大和腰膨大组织，４％多聚甲醛 固定，常规修剪、脱水、石蜡包埋、切片，染色。石蜡 切片微波修复抗原染色程序前ＡＰＥＳ防脱处理，捞 片后置烤箱６０℃６０ｍｉｎ以使切片紧密黏附；切片常 规脱蜡至水；用３０％Ｈ Ｏ １份加蒸馏水１Ｏ份混合，室 温１０ｍｉｎ以灭活内源性酶，蒸馏水洗３次，每次 ５ｍｉｎ；将切片浸入０．０１Ｍ柠檬酸盐缓冲液，微波炉中 高火加热至沸腾后断电，间隔５ｍｉｎ后，反复１次，冷 却后ＰＢＳ洗涤２次；滴加正常山羊血清封闭液，室温 ２０ｍｉｎ；滴加稀释的丫．氨基丁酸转氨酶抗体（ＧＡＢＡ— Ｔ），兔多克隆抗体，４℃过夜，ＰＢＳ洗３次；滴加生物 素化山羊抗兔ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ），３７ｏＣ ３０ｍｉｎ，ＰＢＳ洗３次； 滴加辣根过氧化酶标记链霉素卵蛋白试剂３０ｍｉｎ， ＰＢＳ洗４次；ＤＡＢ显色，蒸馏水洗涤；苏木素轻度复 染，脱水，中性树胶封片。用麦克奥迪实业集团有限 公司产ＢＡ２００Ｄｉｇｉｔａｌ数码三目摄像显微摄像系统进 行图像采集，每张切片先于１００倍下观察全部组织， 再根据组织大小及表达情况分别选取１—３个区域 ４００倍采集图像；颜色为浅黄色或棕黄色的为阳性， 主要表达在细胞浆、细胞膜和间质等。 １．３．３．５ 实时定量ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）测定ＳＳＡＤＨ基因 表达：治疗结束后，取一部分脑干、颈膨大和腰膨大 组织，放人液氮中低温保存用于ＲＴ＿ＰｃＲ测定，步骤 如下：①组织总ＲＮＡ的提取：按Ｔｒｉｚｏｌ试剂说明书 要求提取总ＲＮＡ。＠ｍｑＡ逆转录合成ｃＤＮＡ：按逆 转录试剂盒说明书要求操作，总反应体系２０ｇｌ，包括 ５×Ｐｒｉｍｅｓｃｒｉｐｔ Ｂｕｆｆｅｒ ２：４ｇ１．Ｐｒｉｍｅｓｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｅｎ－ ｚｙｍｅ Ｍｉｘ Ｉ：ｌｇｌ，ＲＴ Ｐｒｉｍｅｒ Ｍｉｘ：ｌｇｌ，ＲＮＡ：１０￣ｔｌ， ＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ ｄＨ２０：４ｐｌ。③ＳＳＡＤＨ引物及碱基序列 中圈腐重区学碧毒 ２ｏ１８￣，第３３卷，第１期 （表１）。￣ＰＣＲ反应体系：ＳＹＢＲ Ｐｒｉｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ ＩＩ （２×）：１０ ｌ，ＰＣＲ Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ（０．４ Ｍ）：０．８ｇｌ， ＰＣＲ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ（０．４ｇＭ）：０．８ｇｌ，ｃＤＮＡ：２．０ｇｌ， 扩增倍数＝２ 见表ｌ。 表示基因表达值。引物及碱基序列 １．４统计学分析 ｄｄＨ：０：６．４ｇｌ。⑤ＰＣＲ反应程序：９５℃预变性３０ｓ， ９５℃变性５ｓ，５５￣（２退火３０ｓ，７２ｏＣ充分延伸，采集荧光 ３０ｓ完成４Ｏ个循环。⑥产物分析：使用Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ软件１．２．３（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙ Ｓｔｅｍｓ）分析 ＰＣＲ过程各检测样本的ＣＴ（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｃｙｃｌｅ）值。用 实验数据应用ＳＰＳＳ２０进行统计分析，计量资料 采用均数４－标准差表示；组间资料比较采用单因素 方差分析；等级资料采用非参检验。Ｐ＜０．０５表示差 异具有显著性意义。 ２结果 模型组和治疗组相比，差异无显著性意义（Ｐ＞ ２．１ Ｂｅｄｅｒｓｏｎ￣Ｏ经功能评分结果 空白组和假手术组无神经功能缺损症状。术后 第１天，与空白组、假手术组比较，模型组和电针组 评分均显著升高，差异具有显著差异（Ｐ＜０．０１），提 示造模成功；模型组和电针组相比，无明显差异 （Ｐ＞０．０５）。术后第３天（治疗前），模型组和电针组 评分均有降低的趋势，但其差异无显著性意义（Ｐ＞ ０．０５）。术后第９天（治疗后），与模型组比较，电针组 评分降低（Ｐ＜０．０５），差异具有显著性意义，提示电 针有促进偏瘫肢体痉挛大鼠神经功能恢复的作用。 见表２。 ０．０５）。术后第３天，模型组与电针组大鼠平衡木行 走评分均有降低趋势，但差异无显著性意义（Ｐ＞ ０．０５）。术后第９天，与模型组比较，电针组平衡木行 走评分均显著降低，差异具有显著性意义（Ｐ＜ ０．０５），提示电针治疗可以提高大鼠运动功能作用。 见表４。 ２．４大鼠脑干、颈膨大、腰膨大组织中ＧＡＢＡ Ｔ蛋 白免疫组化染色ＳＰ法检测结果 与空白组和假手术组比较，模型组大鼠脑干、颈 膨大、腰膨大ＧＡＢＡ．Ｔ含量升高，具有显著性意义 （Ｐ＜０．０５）；与模型组比较，电针组大鼠脑干含量有 下降趋势，颈膨大、腰膨大含量降低，具有显著性意 义（Ｐ＜０．０５），提示：电针具有下调大鼠颈膨大、腰膨 大ＧＡＢＡ．Ｔ含量的作用。见表５，图１。 检测结果 ２．２ Ａｓｈｗｏｒｔｈ分级评定肌张力结果 造模后第３天（治疗前），模型组与空白组、假手 术组比较，）ｃ２＝１６．２４８，Ｐ＝０．０００＜０．Ｏ１，有显著性意 Ｐ＝０．３９８＞Ｏ．０５，没有显著性意义。造模后第９天（治 ５大鼠脑干、颈膨大、腰膨大组织中ＳＳＡＤＨ基因 义，提示造模成功；模型组与电针组比较ｆ＝１．８４３， ２．疗后），模型组与空白组、手术组比较，）ｃ２＝１６．３６８，ｐ＝－ ０．０００＜Ｏ．０１，有显著性意义；采用Ｍａｎｎ—ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ 两两比较，模型组与电针组相比，双侧近似Ｐ＝ Ｏ．０２５，有显著性意义，提示经电针治疗后肌张力降 低。见表３。 空白组与假手术组相比，ＳＳＡＤＨｍＲＮＡ表达没 有显著性意义（Ｐ＞０．０５）；模型组和空白组、假手术 组相比，表达明显增高，具有显著性意义（Ｐ＜０．０１）； 电针组与模型组比较，表达明显下降（Ｐ＜Ｏ．０１）。以 上结果提示：电针治疗有下调脑卒中后肢体痉挛大 鼠脑干、颈膨大、腰膨大组织中ＳＳＡＤＨｍＲＮＡ表达 的作用。见表６。 ３讨论 ２．３ Ｆｅｅｎｅｙ平衡木评分标准评定运动功能结果 不管是治疗前还是治疗后空白组和假手术组大 鼠平衡木行走评分为０分。术后第１天，与空白组、 假手术组比较，模型组和电针组大鼠平衡木行走评 分均显著升高，差异具有显著性意义（Ｐ＜０．０１），但 ３．１脑卒中肢体痉挛模型的制备及评定 ＷＷＷ．ｒｅｈａｂｉ．ｃｏｒｎ．ｃａ ２５ 中｛回腐要匿学骠未 ２０１８￣－，第３３卷，第１期 表６各组大鼠脑干、颈膨大、腰膨大组织中 ＳＳＡＤＨ基因表达值比较 （ ±ｓ） 射。ＧＡＢＡ能中间神经元与Ｉ ａ传人纤维末梢存在 轴突一轴突的连接，Ｉ ａ传人纤维细胞膜的超极化 可使其兴奋性降低，从而减少了从Ｉ ａ传人纤维向 运动神经元的递质释放，从而使ｃｃ运动神经元兴奋 性下降，使肌张力降低口 。中枢神经系统损伤后出 现肢体痉挛状态的患者有脑脊液中ＧＡＢＡ水平下 注：①与空白组比较Ｐ＜Ｏ．Ｏ１；②与空白组比较Ｐ＜０．０５；③与假手术 降口”。ＧＡＢＡ分解代谢首先由ＧＡＢＡ—Ｔ将氨基转移 组比较Ｐ＜Ｏ．０１；④与模型组比较Ｐ＜０．０１；⑤与模型组比较Ｐ＜ ０．０５。 目前关于脑卒中肢体痉挛模型的制备方法普遍 采用ＭＡＣＯ模型，也有电毁损内囊制作痉挛模型的 报道［１２１。ＭＡＣＯ模型稳定性较好，可以控制缺血时 间和实现再灌注，被认为是局灶性脑缺血的标准模 型 。本实验采取右侧ＭＡＣＯ制作模型，以往文献 报道多采用剪刀剪开血管以便线栓插人，在预实验 中发现用剪刀剪其血管切口较大，术中出血较多，在 模型制备时我们采用ｌｍｌ的注射器针头在距颈总动 脉分叉膨大５ｍｍ处做一针口，损伤和出血明显减 少，存活率提高，模型制备成功率为７２％。脑卒中大 鼠肢体痉挛评定方法主要有主观评定方法和客观评 定方法。主观评定方法如改良Ａｓｈｗｏｒｔｈ 、观察脑 损伤对侧屈曲的四肢等方法报道ｎ 。客观评定方法 如电生理描记肌张力法 及测定Ｈ反射｛１６１评定痉挛 的程度。主观评定方法操作简单，缺点是受检查者 经验等诸多因素的限制，欠缺客观性和精准性的评 判标 。有文献报道Ｈ反射、Ｈ／Ｍ比值是评估下 运动神经元兴奋性升高较为客观的指标 ，我们在 之前研究中运用Ｈ反射评定ＭＡＣＯ模型是否存在 肢体痉挛时发现瘫痪侧Ｈ波潜伏期明显缩短 ，波 幅亢进，提示模型大鼠脊髓运动神经元的兴奋性明 显增高。 ３．２电针对脑卒中肢体痉挛大鼠ＧＡＧＡ—Ｔ、ＳＳＡＤＨ 的影响 目前阐述比较清楚的脑卒中后肢体痉挛形成的 主要途径是突触前抑制作用的下降Ⅲ。ＧＡＢＡ是重 要突触前抑制的媒介物，是众多抗痉挛药物的作用 靶点，作为中枢神经系统中最主要的抑制性神经递 质，介导大部分快速抑制性突触传递。如临床常用 抗痉挛药物巴氯芬是一种ＧＡＢＡ类似物 。它在突 触前终端与ＧＡＢＡＩ３受体结合从而抑制肌肉牵张反 给０【一酮戊二酸，生成谷氨酸，同时产生相对不太稳定 的中间产物琥珀酸半醛，随后ＳＳＡＤＨ将琥珀酸半 醛转化成琥珀酸 。ＧＡＢＡ—Ｔ和ＳＳＡＤＨ是ＧＡＢＡ 分解代谢的最关键的两种酶【 ，ＧＡＢＡ含量的变化 受ＧＡＢＡ—Ｔ和ＳＳＡＤＨ调控。常染色体隐性疾病 ＧＡＢＡ—Ｔ和ＳＳＡＤＨ缺乏症患者典型的临床表现为 张力减退皿 ，表明肌张力与ＧＡＢＡ．Ｔ和ＳＳＡＤＨ密切 相关。 “痉挛”属于中医“筋病”、“痉证”的范畴。《难经· 二十九难》从病理角度阐释“痉挛”的发病：“阴跷为 病，阳缓而阴急；阳跷为病，阴缓而阳急”。跷脉通于 脑，中风后由于脑受损伤，致阴阳跷脉脉气不利，功 能失常，阴阳脉气不能相交，阴阳失衡，肢体内外侧 筋肉的阴阳脉气失衡，导致拮抗肌弛缓无力，原动肌 拘急痉挛，而致运动功能减退或丧失。阴阳跷脉理 论为针刺治疗脑卒中后肢体痉挛性功能障碍提供了 有力的论据，申脉通于阳跷脉、照海通于阴跷脉，为 八脉交会穴，主治跷脉病症。临床采用跷脉理论口 ， 针刺照海、申脉穴治疗痉挛，泻实补虚，调整肢体阴 急阳缓或阴缓阳急的病理状态取得了较好疗效。研 究发现ｕ ，脑卒中后痉挛期患者脑脊液中Ｇｌｕ水平 较高，而ＧＡＢＡ水平较低，针刺可以降低脑脊液中 Ｇｌｕ水平 ，升高ＧＡＢＡ水平 ”，缓解患者肢体肌张 力过高的症状。 本研究以ＧＡＢＡ降解途径为靶点，探讨电针阴 阳跷脉腧穴申脉、照海改善偏瘫肢体痉挛的分子机 制。结果显示，模型组肌张力增高，ＧＡＢＡ Ｔ和 ＳＳＡＤＨ表达升高，类似于中医理论中“阳”的特性。 电针组较模型组肌张力下降，ＧＡＢＡ—Ｔ和ＳＳＡＤＨ表 达降低，类似于中医理论中“阴”的特性。前期研究 从ＧＡＢＡ受体及转运机制证实针刺申脉、照海可以通 过调高神经组织中ＧＡＢＡＩ３受体ｍＲＮＡ表达 ，下调 脑干、脊髓颈膨大、腰膨大 氨基丁酸转运蛋白．１口 ， Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＲｅｈａｂｉｌｉｔａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｃｉｅ，Ｊａｎ．ｎ２０１８，Ｖｏ１．３３ Ｎｏ．１ 从而缓解脑卒中后肢体痉挛的症状。结合前期研 究，本研究结果提示电针阴阳跷脉腧穴改善脑卒中 大鼠肢体痉挛可能通过抑制中枢神经系统的ＧＡ— ＢＡ—Ｔ和ＳＳＡＤＨ，导致突触间隙的ＧＡＢＡ降解速度 减慢，突触间隙中ＧＡＢＡ浓度增加口 ，从而提高ＧＡ— ＢＡ系统突触前抑制作用口 ，降低ａ运动神经元兴奋 性，减低肌张力，这可能是电针跷脉腧穴调和阴阳、 缓解脑卒中肢体痉挛的机制之一。本研究及我们之 前的研究仅以抑制性的神经递质ＧＡＢＡ的调控为靶 点，针刺缓解肢体痉挛的机制是否与兴奋性神经递 质有关及其调控机制有待进一步研究证实。 参考文献 【１】 Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ Ａ，Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｙ Ａ．Ｓｐａｓｔｉｃｉｔｙ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ—ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｌｉｎｉｃｉａｎ［Ｊ］．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，２０１０，１（４９）：１—１０． ［２］Ｍｏｌａｒ ＪＰ．Ｓｔｒｏｋｅ：ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，ａｎｄ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ［Ｍ］．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓａｕｎｄｅｒｓ，２０１ １：３—５． ［３］Ｓｃｈｗａｂ Ｃ，Ｙｕ Ｓ，Ｗｏｎｇ、ｖ＇ｅｔ ａ１．ＧＡＤ６５，ＧＡＤ６７，ａｎｄ ＧＡ— ＢＡＴ ｉｍｍｕｎｏｓｔａｉｎｉｎｇ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｂｒａｉｎ ａｎｄ ａｐｐａｒｅｎｔ ＧＡＤ６５ ｌｏｓｓ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ＇ｓ ｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓ— ｅａｓｅ Ｊａｄ，２０１３，３３（４）：１０７３－－１０８８． ［４】金荣疆，朱天民，罗荣，等．电针对实验性脑梗死大鼠脑干脊髓组 织ＧＡＢＡＢ受体影响的研究［Ｊ］．中国老年学杂志，２００８，（２８）： ｌ５７３—１５７５． 【５］Ｚｈｕ Ｘ，Ｈｕ Ｈ，Ｌｉ ｚ，ｅｔ ａ１．Ｇｕａ Ｌｏｕ Ｇｕｉ Ｚｈｉ ｄｅｃｏｃｔｉｏｎ ａｔ— ｔｅｎｕａｔｅｓ ｐｏｓｔ ｓｔｒｏｋｅ ｓｐａｓｔｉｃｉｔｙ ｖｉａ ｔｈｅ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＧＡＢ— ＡＢ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ［Ｊ］．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０１５，１２（４）： ５９５７—５９６２． ［６】金荣疆，朱天民，罗荣，等．电针对实验性脑梗死大鼠Ｈ反射影响 的实验研究［Ｊ】．四川中医，２００７，２５（４）：１ ｌ—ｌ４． 【７】 Ｚｈａｎｇ Ｂ，Ｈｅ Ｑ，Ｌｉ Ｙ ｅｔ ａ１．Ｃｏｎｓｔｒａｉｎｔ—ｉｎｄｕｃｅｄ ｍｏｖｅｍｅｎｔ ｔｈｅｒａｐｙ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｍｏｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ ｄｏｗｒｔｒｅｇｕ— ｌａｔｅｓ ｐｈｏｓｈｏｒｙｌａｒｅｄ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｅｘ－ ｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｂｒａｉｎ 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