(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 107338219 A(43)申请公布日 2017.11.10
(21)申请号 201710067278.4(22)申请日 2017.02.06
(71)申请人 贵州泛特尔细胞生物技术有限公司
地址 550081 贵州省贵阳市金阳高新区都
匀路109号(72)发明人 张凤宁
(74)专利代理机构 北京力量专利代理事务所
(特殊普通合伙) 11504
代理人 宋林清(51)Int.Cl.
C12N 5/0775(2010.01)C12N 5/0735(2010.01)
权利要求书2页 说明书4页 附图1页
(54)发明名称
一种胎盘间充质干细胞的分离及培养方法(57)摘要
本发明公开了一种胎盘间充质干细胞的分离及培养方法，属于间充质干细胞领域，所述分离及培养方法按如下步骤实施：原代组织剥取步骤、组织块消化步骤、接种处理步骤、原代细胞培养及收获步骤以及原代细胞传代步骤。本发明公开的胎盘间充质干细胞的分离及培养方法，其采用组织块法对胶体进行分离，能够获得数量可观的原代细胞，适合大规模工业化生产，胎盘间充质干细胞原代培养符合标准要求，能有效保证续代的遗传稳定性，为临床医学种子细胞的应用提供了良好的基础。
CN 107338219 ACN 107338219 A
权 利 要 求 书
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1.一种胎盘间充质干细胞的分离及培养方法，其特征在于，按如下步骤实施：SOO:原代组织剥取步骤：用酒精擦拭胎盘容器的外壁，从所述胎盘容器中取出胎盘组织，将所述胎盘组织置于无菌盘内，用生理盐水冲洗胎盘组织；从所述胎盘组织中分离出羊膜组织、绒毛膜组织以及蜕膜组织，并将所述羊膜组织、所述绒毛膜组织以及所述蜕膜组织置于不同的培养皿内；对所述羊膜组织、所述绒毛膜组织以及所述蜕膜组织进行洗涤及去杂质处理；将所述羊膜组织、所述绒毛膜组织以及所述蜕膜组织装入不同的离心管内，剪碎成为羊膜组织块、绒毛膜组织块以及蜕膜组织块；
S10：组织块消化步骤：在装有所述羊膜组织块的离心管、所述绒毛膜组织块的离心管以及所述蜕膜组织块的离心管中分别加入胶原酶II进行充分混合，将所述羊膜组织块、所述绒毛膜组织块以及所述蜕膜组织块分别置于不同的恒温振荡器进行消化反应；消化反应完成后，加入适量生理盐水充分混合，对所述羊膜组织块、所述绒毛膜组织块以及所述蜕膜组织块以及各个组织块产生的细胞悬液进行过滤；将所述羊膜组织块、所述绒毛膜组织块以及所述蜕膜组织块以及各个组织块产生的细胞悬液分别定容至不同的离心管中进行离心处理；
S20：接种处理步骤：去除上述不同所述离心管内的上清液后，在各个不同所述离心管内加入培养基，吹打后将不同所述离心管中的内容物转入不同培养瓶进行接种培养；
S30：原代细胞培养及收获步骤：将装有所述羊膜组织、所述绒毛膜组织以及所述蜕膜组织的组织块及细胞悬液的所述培养瓶置于培养箱内进行培养；原代培养预设时间后，对上述不同所述培养瓶分别进行换液处理；当不同所述培养瓶内部的原代培养的细胞克隆团的面积百分比与预设面积百分比一致时，对不同所述培养瓶内部的细胞克隆团进行消化处理，并收获P0细胞；
S40：原代细胞传代步骤：将用于传代的所述P0细胞置于离心管内进行离心处理，离心后取出上清液，并加入适当培养基，轻轻吹打重悬浮细胞，并对离心管内的悬浮细胞进行取样计数；将用于传代的所述P0细胞装入至培养瓶内，并置于培养箱内进行传代培养。当所述培养瓶内的细胞融合度与预设细胞融合度一致时，可以选择依据上述步骤继续传代处理或者对所述培养瓶内的细胞进行冻存。
2.根据权利要求1所述的胎盘间充质干细胞的分离及培养方法，其特征在于：在SOO步骤中，用75％浓度的酒精擦拭所述胎盘容器的外壁，用生理盐水冲洗3次胎盘组织；对所述羊膜组织、所述绒毛膜组织以及所述蜕膜组织进行3～5次洗涤及去杂质处理后，再用含有青霉素和链霉素以及两性霉素的生理盐水洗涤3次；将所述羊膜组织、所述绒毛膜组织以及所述蜕膜组织装入不同的离心管内，剪碎成为1～4mm3羊膜组织块、1～4mm3绒毛膜组织块以及1～4mm3蜕膜组织块。
3.根据权利要求1所述的胎盘间充质干细胞的分离及培养方法，其特征在于：在S1O步骤中，所述胶原酶II的浓度配置为2mg/ml；每1ml所述羊膜组织块、每1ml所述绒毛膜组织块以及每1ml所述蜕膜组织块均与3ml所述胶原酶II尽心充分混合；消化反应完成后，加入3～5倍体积的生理盐水充分混合；通过100um的细胞过滤器对所述羊膜组织块、所述绒毛膜组织块以及所述蜕膜组织块以及各个组织块产生的细胞悬液进行过滤；将所述羊膜组织块、所述绒毛膜组织块以及所述蜕膜组织块以及各个组织块产生的细胞悬液分别定容至不同的离心管中进行离心处理，离心管定容为50ml，离心处理参数为1500rpm，
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权 利 要 求 书
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10min。
4.根据权利要求1所述的胎盘间充质干细胞的分离及培养方法，其特征在于：在S2O步骤中，对于羊膜组织及蜕膜组织，每1～1.5ml组织块对应接种1个T75的培养瓶；对于绒毛膜组织，每3～4ml组织块对应接种1个T75的培养瓶；在原代细胞的培养基内加入青霉素、链霉素和两性霉素B。
5.根据权利要求1所述的胎盘间充质干细胞的分离及培养方法，其特征在于：在S3O步骤中，原代培养预设时间为23～25小时，每隔3天对上述不同所述培养瓶分别进行全量换液处理；所述细胞克隆团的预设面积百分比配置为85％～90％；对于羊膜组织及蜕膜组织，所述P0细胞的收获时间为7～10天；对于绒毛膜组织，所述P0细胞的收获时间为12～15天。
6.根据权利要求1或5所述的胎盘间充质干细胞的分离及培养方法，其特征在于：在S3O步骤中，对所述细胞克隆团进行消化处理，得到所述P0细胞，所述消化处理步骤包括用生理盐水洗涤所述细胞克隆团2遍、每T75培养瓶加入2ml0.125％胰酶，消化处理时长为2～3min，消化处理完成后进行离心处理。
7.根据权利要求1或5所述的胎盘间充质干细胞的分离及培养方法，其特征在于：在S4O步骤中，所述预设细胞融合度配置为80～90％；所述P0细胞获取后，所述培养基中不再加入抗生素。
8.根据权利要求1至7任一项所述的胎盘间充质干细胞的分离及培养方法，其特征在于：
所述培养箱内部的二氧化碳体积分数为5±0.2％，所述培养箱内部的培养温度为37±0.5℃。
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说 明 书
一种胎盘间充质干细胞的分离及培养方法
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技术领域[0001]本发明涉及间充质干细胞领域，更具体的，涉及一种胎盘间充质干细胞的分离及培养方法。
背景技术[0002]间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是一种能够自我更新，具有多向分化潜能的祖细胞。在成骨不全、造血功能不全、骨组织的再生等疾病的治疗中，均可分化为相应终端分化细胞。在再生医学治疗领域，以间充质干细胞为基础的细胞治疗方法由于其自我更新和多向分化的潜能，越来越受到人们的青睐。从脐带中也可以分离MSCs很早就已经被J.W.Kim等人证明，带标本中不仅能够分离得到了MSCs，而且也通过成脂诱导，成骨诱导验证了MSCs具有分化潜能，对MSCs的分离及培养是脐带间充质干细胞得以良好应用的重要保证，目前大多数MSCs的分离及培养方法难以实现规模化生产。[0003]中国专利文献公开号CN103451150A公开了一种胎盘源母体间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：(1)胎盘源母体间充质干细胞的分离；和(2)胎盘源母体间充质干细胞的培养。其中，步骤(1)使用了trypLETM酶溶液分两步处理胎盘组织；步骤(2)使用无血清培养基。本发明的方法能够实现充质干细胞的制备，但其培养方式简单，不适合大规模生产，工业化生产前景局限。
发明内容[0004]为了克服现有技术的缺陷，本发明所要解决的技术问题在于提出一种胎盘间充质干细胞的分离及培养方法，其采用组织块法对胶体进行分离，能够获得数量可观的原代细胞，适合大规模工业化生产。[0005]为达此目的，本发明采用以下技术方案：[0006]本发明提供了一种胎盘间充质干细胞的分离及培养方法，按如下步骤实施：[0007]SOO:原代组织剥取步骤：用酒精擦拭胎盘容器的外壁，从所述胎盘容器中取出胎盘组织，将所述胎盘组织置于无菌盘内，用生理盐水冲洗胎盘组织；从所述胎盘组织中分离出羊膜组织、绒毛膜组织以及蜕膜组织，并将所述羊膜组织、所述绒毛膜组织以及所述蜕膜组织置于不同的培养皿内；对所述羊膜组织、所述绒毛膜组织以及所述蜕膜组织进行洗涤及去杂质处理；将所述羊膜组织、所述绒毛膜组织以及所述蜕膜组织装入不同的离心管内，剪碎成为羊膜组织块、绒毛膜组织块以及蜕膜组织块；[0008]S10：组织块消化步骤：在装有所述羊膜组织块的离心管、所述绒毛膜组织块的离心管以及所述蜕膜组织块的离心管中分别加入胶原酶II进行充分混合，将所述羊膜组织块、所述绒毛膜组织块以及所述蜕膜组织块分别置于不同的恒温振荡器进行消化反应；消化反应完成后，加入适量生理盐水充分混合，对所述羊膜组织块、所述绒毛膜组织块以及所述蜕膜组织块以及各个组织块产生的细胞悬液进行过滤；将所述羊膜组织块、所述绒毛膜组织块以及所述蜕膜组织块以及各个组织块产生的细胞悬液分别定容至不同的离心管中
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说 明 书
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进行离心处理；[0009]S20：接种处理步骤：去除上述不同所述离心管内的上清液后，在各个不同所述离心管内加入培养基，吹打后将不同所述离心管中的内容物转入不同培养瓶进行接种培养；[0010]S30：原代细胞培养及收获步骤：将装有所述羊膜组织、所述绒毛膜组织以及所述蜕膜组织的组织块及细胞悬液的所述培养瓶置于培养箱内进行培养；原代培养预设时间后，对上述不同所述培养瓶分别进行换液处理；当不同所述培养瓶内部的原代培养的细胞克隆团的面积百分比与预设面积百分比一致时，对不同所述培养瓶内部的细胞克隆团进行消化处理，并收获P0细胞；[0011]S40：原代细胞传代步骤：将用于传代的所述P0细胞置于离心管内进行离心处理，离心后取出上清液，并加入适当培养基，轻轻吹打重悬浮细胞，并对离心管内的悬浮细胞进行取样计数；将用于传代的所述P0细胞装入至培养瓶内，并置于培养箱内进行传代培养。当所述培养瓶内的细胞融合度与预设细胞融合度一致时，可以选择依据上述步骤继续传代处理或者对所述培养瓶内的细胞进行冻存。[0012]本发明地进一步技术方案，在SOO步骤中，用75％浓度的酒精擦拭所述胎盘容器的外壁，用生理盐水冲洗3次胎盘组织；对所述羊膜组织、所述绒毛膜组织以及所述蜕膜组织进行3～5次洗涤及去杂质处理后，再用含有青霉素和链霉素以及两性霉素的生理盐水洗涤3次；将所述羊膜组织、所述绒毛膜组织以及所述蜕膜组织装入不同的离心管内，剪碎成为1～4mm3羊膜组织块、1～4mm3绒毛膜组织块以及1～4mm3蜕膜组织块。[0013]本发明地进一步技术方案，在S1O步骤中，所述胶原酶II的浓度配置为2mg/ml；每1ml所述羊膜组织块、每1ml所述绒毛膜组织块以及每1ml所述蜕膜组织块均与3ml所述胶原酶II尽心充分混合；消化反应完成后，加入3～5倍体积的生理盐水充分混合；通过100um的细胞过滤器对所述羊膜组织块、所述绒毛膜组织块以及所述蜕膜组织块以及各个组织块产生的细胞悬液进行过滤；将所述羊膜组织块、所述绒毛膜组织块以及所述蜕膜组织块以及各个组织块产生的细胞悬液分别定容至不同的离心管中进行离心处理，离心管定容为50ml，离心处理参数为1500rpm，10min。[0014]本发明地进一步技术方案，在S2O步骤中，对于羊膜组织及蜕膜组织，每1～1.5ml组织块对应接种1个T75的培养瓶；对于绒毛膜组织，每3～4ml组织块对应接种1个T75的培养瓶；在原代细胞的培养基内加入青霉素、链霉素和两性霉素B。[0015]本发明地进一步技术方案，在S3O步骤中，原代培养预设时间为23～25小时，每隔3天对上述不同所述培养瓶分别进行全量换液处理；所述细胞克隆团的预设面积百分比配置为85％～90％；对于羊膜组织及蜕膜组织，所述P0细胞的收获时间为7～10天；对于绒毛膜组织，所述P0细胞的收获时间为12～15天。[0016]本发明地进一步技术方案，在S3O步骤中，对所述细胞克隆团进行消化处理，得到所述P0细胞，所述消化处理步骤包括用生理盐水洗涤所述细胞克隆团2遍、每T75培养瓶加入2ml 0.125％胰酶，消化处理时长为2～3min，消化处理完成后进行离心处理。[0017]本发明地进一步技术方案，在S4O步骤中，所述预设细胞融合度配置为80～90％；所述P0细胞获取后，所述培养基中不再加入抗生素。[0018]本发明地进一步技术方案，所述培养箱内部的二氧化碳体积分数为5±0.2％，所述培养箱内部的培养温度为37±0.5℃。
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本发明的有益效果为：
[0020]本发明提供的胎盘间充质干细胞的分离及培养方法，其采用组织块法进行分离，能够获得原代间充质干细胞呈间充质干细胞的特征形态很均一，适合工业化大规模生产。另外，本发明提供的胎盘间充质干细胞的分离及培养方法经过多次试验验证，胎盘间充质干细胞原代培养符合标准要求，能有效保证续代的遗传稳定性，为临床医学种子细胞的应用提供了良好的基础。
附图说明[0021]图1是本发明具体实施方式提供的胎盘间充质干细胞的分离及培养方法的流程图。
具体实施方式[0022]下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。[0023]如图1所示，实施例中提供了一种胎盘间充质干细胞的分离及培养方法，按如下步骤实施：[0024]SOO步骤:原代组织剥取步骤：用75％浓度的酒精擦拭胎盘容器的外壁，从胎盘容器中取出胎盘组织，将胎盘组织置于无菌盘内，无菌盘配置为不锈钢材质，用生理盐水冲洗3次胎盘组织。从胎盘组织中分离出羊膜组织、绒毛膜组织以及蜕膜组织，并将羊膜组织、绒毛膜组织以及蜕膜组织置于不同的培养皿内。羊膜组织分离时，使得胎盘组织面部朝上，用齿镊子剥取5～10ml左右置于培养皿内，主要是对脐带周围的羊膜进行剥取，羊膜层是位于胎盘组织子面最表面的那层薄膜组织。绒毛膜组织分离时，用剪刀剪开胎盘组织子面的绒毛膜组织，夹起绒毛膜板，并用剪刀剪去绒毛膜下滋养层组织，置于培养皿内。蜕膜组织分离时，使得胎盘组织母面朝上，用镊子夹起胎膜，用剪刀小心地剥取胎膜母面的壁蜕膜组织，置于培养皿内，蜕膜组织是靠近胎盘母面的那层，颜色红红的，比较松散的肉组织。用齿镊子对羊膜组织、绒毛膜组织以及蜕膜组织进行3～5次洗涤及去杂质处理，每次洗涤必须换新的培养皿，并用有齿镊子刮去其他杂质，尤其绒毛膜组织需尽量去除滋养层组织，再用含有青霉素和链霉素以及两性霉素的生理盐水洗涤3次。将羊膜组织、绒毛膜组织以及蜕膜组织装入不同的离心管内，剪碎成为1～4mm3羊膜组织块、1～4mm3绒毛膜组织块以及1～4mm3蜕膜组织块。如果必要，可以在组织块剪碎前，将组织块一份为二，留一份加入生理盐水置于冰箱中，以防备用。[0025]S10步骤：组织块消化步骤：在装有羊膜组织块的离心管、绒毛膜组织块的离心管以及蜕膜组织块的离心管中分别加入胶原酶II进行充分混合，胶原酶II的浓度配置为2mg/ml，每1ml羊膜组织块、每1ml绒毛膜组织块以及每1ml蜕膜组织块均与3ml所述胶原酶II尽心充分混合。将羊膜组织块、绒毛膜组织块以及蜕膜组织块分别置于不同的恒温振荡器进行消化反应，振荡器的工作温度为37℃，转速为70rpm，在振荡器进行消化反应约1小时。消化反应完成后，加入3～5倍体积的生理盐水充分混合，充分混匀终止消化。通过100um的细胞过滤器对所述羊膜组织块、所述绒毛膜组织块以及所述蜕膜组织块以及各个组织块产生的细胞悬液进行过滤，为加快速度，可以同时几个过滤器分别一起过滤。将羊膜组织块、绒毛膜组织块以及蜕膜组织块以及各个组织块产生的细胞悬液分别定容至不同的离心管中
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进行离心处理，离心管定容为50ml，离心处理参数为1500rpm，10min(久保田8420)。加入生理盐水，将细胞悬液离心管定容为45ml，对细胞进行离心洗涤，离心洗涤参数为1000rpm，10min。[0026]S20步骤：接种处理步骤：去除上述不同所述离心管内的上清液后，在各个不同所述离心管内加入培养基，吹打后将不同所述离心管中的内容物转入不同培养瓶进行接种培养。优选的，对于羊膜组织及蜕膜组织，每1～1.5ml组织块对应接种1个T75的培养瓶；对于绒毛膜组织，每3～4ml组织块对应接种1个T75的培养瓶。在原代细胞的培养基内加入青霉素、链霉素和两性霉素B。[0027]S30步骤：原代细胞培养及收获步骤：将装有羊膜组织、绒毛膜组织以及蜕膜组织的组织块及细胞悬液的所述培养瓶置于培养箱内进行培养，培养箱内部的二氧化碳体积分数为5±0.2％，培养箱内部的培养温度为37±0.5℃。原代培养预设时间后，预设时间配置为23～25小时，优选为24小时，对上述不同培养瓶分别进行全量换液处理，此后每隔3天对上述不同培养瓶分别进行多次换液处理。当不同培养瓶内部的原代培养的细胞克隆团的面积百分比与预设面积百分比一致时，优选的，细胞克隆团的预设面积百分比配置为85％～90％。对不同培养瓶内部的细胞克隆团进行消化处理，并收获P0细胞。细胞克隆团的预设面积百分比配置为85％～90％；对于羊膜组织及蜕膜组织，P0细胞的收获时间为7～10天；对于绒毛膜组织，P0细胞的收获时间为12～15天。原代培养基中加入了青霉素、链霉素和两性霉素B，优选的，青霉素、链霉素双抗混合比例为1:100，两性霉素B的浓度为2.5ug/ml。[0028]在S3O步骤中，对细胞克隆团进行消化处理，得到所述P0细胞，消化处理步骤包括用生理盐水洗涤所述细胞克隆团2遍、每T75培养瓶加入2ml的0.125％胰酶，消化处理时长为2～3min。加入适量生理盐水终止消化，移入50ml离心管中，原培养瓶中加入4～5ml氯化钠注射液冲洗瓶壁，对50ml离心管进行离心洗涤处理，洗涤处理参数为1000rpm，10min。[0029]S40步骤：原代细胞传代步骤：将用于传代的P0细胞置于离心管内进行离心处理，离心后取出上清液，并加入适当培养基，轻轻吹打重悬浮细胞，并对离心管内的悬浮细胞进行取样计数，将用于传代的P0细胞装入至培养瓶内，并置于培养箱内进行传代培养，优选的，细胞传代密度为6～7×105个细胞/T75培养瓶。当培养瓶内的细胞融合度与预设细胞融合度一致时，可以选择依据上述步骤继续传代处理或者对培养瓶内的细胞进行冻存。优选的，预设细胞融合度配置为80～90％，P0细胞获取后，所述培养基中不再加入抗生素。[0030]本发明是通过优选实施例进行描述的，本领域技术人员知悉，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对这些特征和实施例进行各种改变或等效替换。本发明不受此处所公开的具体实施例的限制，其他落入本申请的权利要求内的实施例都属于本发明保护的范围。
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说 明 书 附 图
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