1. 学习碱裂解法提取质粒的原理和方法； 2. 学习DNA琼脂糖凝胶电泳的原理和方法。
二． 实验原理
1. 质粒 (Plasmid)：
一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1-200kb不等，为双链、闭环的DNA分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，常常编码一些对宿主有利的酶的基因，这些基因的表型包括抗生素抗性，产生抗生素、限制酶、修饰酶等。
2.载体(Vector)：
要把一个有用的外源基因通过基因工程手段，转化到细胞中去进行繁殖和表达，需要运
载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体。目前除了大肠杆菌中的质粒、λ噬菌体、M13噬菌体、噬菌粒外，还有酵母人工染色体载体以及动、植物病毒载体等。
3.分离质粒DNA：
（1）培养细菌使质粒扩增； （2）收集和碱裂解细菌； （3）分离和纯化质粒DNA。
4.碱裂解法
（1）溶液Ⅰ：50mmol/L葡萄糖，10mmol/EDTA-Na，25mmol/LTris-HCl 作用：分散细胞，螯合金属离子使酶失活，防止DNA的降解
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（2）溶液Ⅱ：L NaOH，2% SDS，临用前1：1配制
作用：细胞在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与染色体DNA发生变性 （3）溶液 Ⅲ ：5mol/L 醋酸钾60ml，冰醋酸，双蒸水
作用：酸性条件上质粒DNA复性，留在上清液。大肠杆菌DNA和蛋白质-SDS复合物等发生沉淀。
5.电泳
带电荷的物质，在电场中的趋向运动称为电泳。DNA的琼脂糖凝胶电泳可以分离长度为200bp至近50kb的DNA分子。DNA的迁移率（U）的对数与凝胶浓度（T）之间存在反平行线性关系。因此，要有效地分离不同大小的DNA片段，选用适当的琼脂糖凝胶浓度是非常重要的。
6.提取质粒
在质粒提取的过程中，由于操作原因，提取的质粒可能有三种：线性DNA、开环DNA 、闭环超螺旋DNA 。当提取的质粒DNA电泳时,同一质粒 DNA泳动速度：闭环超螺旋〉线状〉开环。但有时也有也会出现相反情况，因为与琼脂糖浓度、电流强度、离子强度及核酸染料含量有关。
三． 实验材料及设备
1. 实验材料：
（1）含质粒pUC18大肠杆菌，塑料离心管，EP管架，微量取液器和取液器吸头，常用玻璃器皿（如三角瓶、量筒、试剂瓶等）； （2）提取的pUC18，琼脂糖，锥形瓶，一次性手套，胶铲，封口膜，剪刀，取液器吸头。实验设备：
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2. 实验仪器：
（1）恒温摇床，高压灭菌锅，超净工作台，10、100、1000μL取液器各一支，台式高速离心机，制冰机，漩涡器；
（2）电泳仪，电泳槽，样品槽模板（梳子），有机玻璃内槽，水平仪，取液器，微波炉，凝胶成像系统。
3. 实验试剂：
（1）质粒的提取
培养液:胰蛋白胨（Tryptone）10g，酵母提取物（Yeast extract）5g，NaCl5g，琼脂（固体培养基）15g，用1N NaOH调; b.溶液Ⅰ，溶液Ⅱ，溶液Ⅲ； c.氨苄青霉素(50mg/mL)；
d.抽提液（饱和酚：氯仿：异戊醇=25:24:1）
作用：氯仿可使蛋白质变性，有助于液相与有机相的分离。平衡酚密度大，可是DNA在上清中。异戊醇防止抽提液起泡。 e.无水乙醇 作用：除去DNA水化层，使DNA沉淀。 %乙醇 作用：纯化质粒DNA。 缓冲液或ddH2O 作用：溶解DNA
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（2）DNA琼脂糖凝胶电泳检测 a. Gold view（DNA染料） ×TAE缓冲液 c.上样缓冲液（6×）
四． 实验方法及步骤
1. 质粒DNA的提取
a) 将带有质粒pUC18的大肠杆菌接种在液体培养基中（加氨苄青霉素50μg/mL），370C培养过夜；
b) 取培养菌液置Eppendorf小管中，10000rpm×2min，弃上清液； c) 加入100μL溶液I，漩涡器上充分混匀，在室温下放置10 min； d) 加入200μL新配制的溶液Ⅱ，轻轻翻转2~3次，使之混匀，冰上放置5 min；
e) 加入150μL冰冷的溶液Ⅲ，盖紧后，温和颠倒3-5次使混匀，产生白色絮状物，冰上放置15 min；
f) 10000rpm× 5 min，取上清液于另一干净的离心管中； g) 向上清液中加入等体积（约400μL）酚：氯仿/异戊醇（25：24:1，v/v），振荡混匀，10000rpm × 10 min，将上清液转移至新的离心管中；
h) 加入等体积（约370μL）氯仿/异戊醇（24:1），混匀，10000rpm × 2min ,取上清液于新离心管中；
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i) 向上清液加入2倍体积无水乙醇，混匀， -200C放置1h； j) 12000rpm × 5 min，倒去上清液，吸干液体；
k) 加800μL70%乙醇，离心12000rpm × 1 min，倒尽上清液，吸水纸吸干液体，室温自然干燥30min，直至变得透明无乙醇味； l) 加20μL ddH2O ，混匀使DNA溶解完全，取5μL做电泳检测，剩余的溶液放置-200C保存备用。 2. DNA琼脂糖凝胶电泳检测 a) 琼脂糖凝胶板的制备
b) 称取琼脂糖，置于锥形瓶中，加入30mL1×TAE缓冲液，微波炉加热直至琼脂糖溶解;
c) 待胶液冷却到650C（不烫手为宜），加入1μL Gold view混匀，搅拌器上搅拌排除气泡，缓慢倒入事先准备的制胶有机玻璃槽（插入样品槽模板梳子 ）内 ,静置30min左右，轻轻晃动拔出梳子; 3. 加样
胶板放入电泳槽中（样品孔位于负极），注入1×TAE缓冲液淹没过胶板5mm，用取液器将提取的质粒DNA5μL与1μL上样缓冲液（ 6× ）混匀，加入胶板的样品小槽内。 4. 电泳
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将电泳槽与电泳仪接通，调节电压为100V左右，直至缓冲液的蓝色指示剂移动到距离胶板边沿约1~2cm处，停止电泳。 5. 观察和拍照
将胶板小心取出，放入凝胶成像系统中，调节位置居中，波长为254nm的紫外灯下，观察凝胶中DNA存在处显示出荧光条带。
五． 实验结果
A带：15000bp
Marker
B带10000bp
C带7500bp
pEGFP-N3 pET-28a-c
D带5000bp E带3000bp F带1000bp
G带250bp
图 1碱裂解法提取pEGFP-N3与pET-28A-c质粒凝胶电泳紫外荧光检测结果
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说明：从左到右依次为：pEGFP-N3、pET-28A-c、DL15000Maker
所提取的质粒DNA可通过琼脂凝胶电泳进行检测。一般情况下，提取的质粒为3条带。在细胞内，质粒DNA是共价闭合环状DNA，常以超螺旋形式存在；如果两条链中有一条链发生一处或多处缺刻，分子就能旋转而消除链的张力，这种松弛型的分子叫做开环DNA；若两条链在同一处或相近的部位断裂，则变成线性DNA分子。
在电泳时，同一质粒的电泳速度因DNA的构型不同而异，其速度从大到小的次序为：cccDNA>线性>ocDNA，共价闭环DNA的泳动速度最快，电泳速度最快的条带显色最深。但在优化条件下，如在冰浴中或使用试剂盒提取时，可以只出现一条带或主要出现一条带，即超螺旋带。
由图可知，本次实验结果出现了明显的三条带，表明该样品中同时出现共价闭合环状DNA、开环DNA和线性DNA分子。与Marker比照，分子量基本符合对应的分子量条带。实验结果较好。
六． 结果讨论与结论： 1. 实验结论：
通过碱裂解方法，我们将细菌的质粒变性提出，又通过多个洗涤、纯化步骤，得到了提纯的质粒，在最后的本次实验结果出现了明显的三条带，表明该样品中同时出现共价闭合环状DNA、开环DNA和线性DNA分子。与Marker比照，分子量基本符合对应的分子量条带,
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实验结果较好。
2. 讨论一：溶液II为什么现配现用而且需放置在常温下答：
溶液中NaOH放置过久会与空气中CO2反应变质，导致溶液ⅡpH下降，无法达到很好的裂解效果；溶液中SDS成分在温度较低环境下由于溶解度下降导致析出，溶液失去效果。
3. 讨论二：抽提液（饱和酚：氯仿：异戊醇）的作用。氯仿：异戊醇为什么加两次
作用：使样品中杂质蛋白变性析出，被抽提出样品；第二次加入异戊醇目的为洗净上一步抽提中样品残留的饱和酚。
4. 讨论三：实验中无水乙醇与70%乙醇的作用。
用无水乙醇沉淀DNA,这是实验中最常用的沉淀DNA的方法.乙醇的优点是可以任意比和水相混溶,乙醇与核酸不会起任何化学反应,对DNA很安全,因此是理想的沉淀剂. DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在,当加入乙醇时,乙醇会夺DNA周围的水分子,使DNA失水而易于聚合；70％乙醇的作用不是沉淀DNA，而是通过漂洗上一步得到的沉淀，使沉淀中的盐溶解，从而进一步纯化DNA。
5. 讨论四：电泳检测中忘加指示剂会出现什么情况拔梳子和点样步骤的注意事项。
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如果没有指示剂，则无法准确追踪电泳的进度。容易导致电泳不足或者过度。
拔梳子时，应当动作轻缓，轻微左右摇晃使梳子缓慢脱出。注意不要前后摇晃，导致跑胶起点不一或者胶板变形。
点样时，枪口要深入凹槽底部，但又不能使枪口触碰挤压胶板。
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