（江南大学食品学院，无锡２１４０３６）工芝技夜４０嗽解 万方数据摘要：比较了五种蛋白酶对大豆蛋白质的水解能力，并从中选出了两个对大豆蛋白具有较强水解能力且价格相对便宜 的酶： Ａｌｃａｌａｓｅ和ＡＳ１．３９８。通过正交实验确定了二者的最 适反应条件，Ａｌｃａｌａｓｅ最适条件为：Ａ度５５９０ ， ｐＨ８．５，底物／酶量比为８０ （ｇ／ｍＬ），４ｈ后水解度可达２０．４２％ ；ＡＳ１ ．３９８酶的最佳条件：温度４０＇Ｃ， ｐＨ７．０， ＣａＣ１２０．００１％，底物／酶量比为４０（ ｇ／ｇ），４ｈ后水解度可达２５．４９％．关．月：醉解，大豆蛋白Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｆｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ ｔｏ ｈｙｄｒｏｌｙｚｅ ｓｏｙｐｒ ｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｓａｍｅ Ｅ／Ｓ ｒａｔｉｏ，ａｎｄ ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｅｃｏｎｏｍｉｃａｌ ｏｎｅｓ ｗｅｒｅ Ａｌｃａｌａｓｅ ａｎｄ ＡＳ１．３９８． Ｔｈｒｏｕｇｈ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｅｘｐｅｒ ｉｍｅｎｔｓ， ｏｐｔｉｍａｌ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅｔ ｗｏ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ． Ｆｏｒ Ａｌｃａｌａｓｅ： ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ５５０Ｃ， ｐＨ ８．５， ｓｕｂｓｔｒａｔｅ／ｅｎｚｙｍｅ ｒａｔｉｏ８０ （ｇ／ｍＬ）， ａｎｄ ｆｏｒ ＡＳ１．３９８： ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ４０℃，ｐＨ ７．０， ＣａＣｌ刃．００１％， ｓｕｂｓｔｒａｔｅ／ｅｎｚｙｍｅ ｒａｔｉｏ ４０（ ｇ／ｇ）． Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ａｂｏｖｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ， ａｆｔｅｒ ４ ｈｏｕｒｓ，ｔ ｈｅ ＤＨ ｏｆ ｓｏｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅｓ ａｔｔａｉｎｅｄ２０． ４２％ ａｎｄ ２５．４９％， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ； ｓｏｙｂｅａｎ ｐｒｏｔｅｉｎ中图分类号：ＴＳ２０１．２＇１文献标识码：Ａ文章编号：１００２－０３０６（２００３）０９－００４０－０３目前市场上出售的大豆肤多是粗水解产物，而 没有进行分离、纯化，另外其水解度及生理活性也不明确。本研究的最终目的就是通过酶水解制备具有降血压、降胆固醇、防止骨质疏松和抗氧化活性的肤，然后分离纯化制得精品。由于大多活性肤都是寡肤（一般几个氨基酸），因此要在工业上生产具有生理活性的肤段就要求我们对酶进行筛选时要尽可能选用水解速度快、水解能力强的酶类，另外考虑到经济因素，还要求酶的价格要相对便宜。本文的目的就是选出水解反应所需的酶类，并通过正交实验确定其最适作用条件。１材料与方法１．１实验材料大豆分离蛋白 黑龙江省三江食品公司；胰蛋收稿日期：２００２－１２－２６作者简介：王吉庄（１９７９－），男，在读硕士，研究方向：生物技术在食品中的应用。 ＊ｗｓ白酶华美生物工程公司，上海；胃蛋白酶华美生物工程公司，上海；木瓜蛋白酶广西化工学院；Ａｌｃａｌａｓｅ ＮＯＶＯ公司；ＡＳ １．３９８中性蛋白酶无锡酶制剂厂；其它化学试剂均为分析纯。１．２实验方法１．２．１酶活的测定ｎ，２１采用改进的福林酚法。各个酶在推荐的最适条件下（见表１），以酪蛋白为底物（胃蛋白酶用牛血清蛋白做底物）进行测定。酶活力单位定义为在特定的实验条件下，每ｍｉｎ水解酪蛋白产生１ Ｉ－．ｇ氨基酸的酶量为一个酶活单位。１．２．２大豆蛋白溶液的配制及预热处理［３］将大豆蛋白溶于水，配成８％的溶液，并调整其ｐＨ至７．０，然后在９０℃预热处理３０ｍｉｎ ｏ１．２．３大豆蛋白质的水解将经过预热处理的大豆蛋白溶液的ｐＨ（用２ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ或ＨＣｌ调节）和温度调至酶作用的最适条件（如表１所示），加入蛋白酶进行水解，并采用ｐＨ－ｓｔａｔ法控制体系的ｐＨ，待反应结束后在１００℃水浴中灭酶ｌ Ｏｍｉｎ ｏ１．２．４酶解蛋白质水解度的测定在中性和碱性条件下采用ｐＨ－ｓｔａｔ法叭在酸性条件下采用ＴＮＢＳ法叽２结果与讨论２．１五种蛋白酶对大豆蛋白的水解作用（享）侧坡书时间（ｍｉ ｎ）图１四种酶的水解进程曲线 为了筛选出适宜于制备高水解度大豆短肤的蛋 白酶，本研究首先考察了在相同的酶／底物比的条件下，五种蛋白酶对大豆蛋白的水解进程曲线，结果见图１。由图１可见，胰蛋白酶对大豆蛋白的水解能力极差，而通过对标准底物的酶活测定证明，酶是有活力的（约１６万），这说明从专一性来说，大豆蛋白是万方数据Ｖｏ１，２４，Ｎｏ．９，２００３表１酶类 ＡＳ１．３９８酶Ａｌｃａｌａｓｅ ｐＨ７．５温度（℃）４０表２酶种类ＡＳ１．３９８酶酶活（１０９９２２．５价格（Ｕ／ｇ或Ｕ／ｍＬ）元／９，元／ｍＬ ）０． ２７其不良底物，另外其价格也比较昂贵，因此，胰蛋白酶不足以作为制备高水解度大豆肤的理想酶制剂。ＡＳ１．３９８和木瓜蛋白酶价格相对便宜，酶活又很接近，４ｈ后单位酶活对大豆蛋白质的水解能力（水解度）分别约为：０．０００１３１％ ， ０．００００４６７％。可见，ＡＳ １．３９８对大豆蛋白的作用能力要强于木瓜蛋白酶。在所试用的五种蛋白酶中，Ａｌｃａｌａｓｅ单位价格的酶活最高，水解能力最强。胃蛋白酶的作用情况没有出现在图中，用ＴＮＢＳ法测定，在２ｈ和５ｈ时它的水解度都是２．６１％，可见它水解能力也很差，这一方面可能是因为其酶活比较低，可以通过增加酶量的方法给予提高，但这会大大提高生产成本；另一方面可能是因为大豆蛋白是其不良底物。综合以上各个因素，决定选用水解能力强而又价格相对便宜的Ａｌｃａｌａｓｅ和ＡＳ １．３９８两种酶作为制备高水解度大豆肤的制剂。之所以要选用两种酶，是因为二者作用的肤键性质不同，如Ａｌｃａｌａｓｅ是内切肤酶，水解的肤键是竣基端含有介ｒ，Ｐｈｅ，肠ｒ等残基，而ＡＳ １．３９８水解的肤键却具有广泛的专一性［４１，因此在相同的水解度情况下，两种酶的水解产物可能具有不同的功能性质。２．２ Ａｌｃａｌａｓｅ水解大豆蛋白质最佳条件的确定由于同种蛋白酶对不同的底物具有不同的最适 温度和ｐＨ，因此有必要对酶作用于大豆蛋白时的最适作用条件进行讨论。本文采用了正交试验，试验方法和结果见表３，反应时底物浓度是８％，底物／酶比为８０（ｇ ／ｍＬ），反应时间为４ｈ，正交表中的水解度即为４ｈ的水解度。表３正交实验表实验号Ａ ｐＨＢ温度（℃）水解度（％）１（７．５）１（５０）１６．８７１ ２（５５）１７．９７内、￣１ ３（６０）１８．２８４２（８．０）１ １８．５８口ｆ｝ ２２ １９．１４６２ ３ １８．７６７３（８．５）１ １９．５０８３ ２ ２０．４２９３ ３１９．６９筑５３．１２５４．９５凡５６．４８５７．５３Ｅ水解度二Ｋ３５９．６１５６．７３１６９．２１极差６．４９２．５８的值低，因此我们可以说在ｐＨ８．５时水解度取得最大值，所以确定最适ｐＨ为８．５．在确定的最适温度和ｐＨ下，保持底物浓度、 底物总量（８０ｇ）不变，改变酶的使用量，分别加人０．５，１．０，１．５和２ｍＬ酶，得到水解进程曲线如图２所示。２８２６２４２２ ２０ （享１８）侧１６ １４盛 １２书 １０５ ６ ４ ２０－－２－－４时间（ｍｉ ｎ）图２酶的添加量对水解度的影响从图中可以看出，随着酶量的增加，水解度是上 升的，但酶的添加量从１ｍＬ增加到２ｍＬ时，最终水解度增加不是太大；加酶量从０．５ｍＬ增加到１ｍＬ时，酶反应速度增加明显，因此，从经济上考虑选用酶的最佳添加量为８０ｇ底物蛋白中加入１ｍＬ的酶液，即底物／酶量比为８０：１ ０２．３ ＡＳ１．３９８酶水解大豆蛋白最佳条件的确定ＡＳ１． ３９８是中性蛋白酶，它可以被钙、镁离子激活，因此本实验在考察酶的最适温度和ｐＨ的同时，考察Ｃａｔ．添加量对水解进程的影响，正交实验结果见表４。实验时采用的底物浓度为８％，总量为８０ｇ Ｉ底物／酶比为４０（岁ｇ）．由正交表的极差分析可知，在其取值范围内Ａ 是主要的影响因素，而Ｂ和Ｃ是次要因素，因此从节省能源的角度考虑，取水解温度为４０９Ｃ； Ｃ因素在１ｍＬ添加时水解度取得最大值，可见Ｃａ ｚ＇对ＡＳ １．３９８有一定的激活作用。由于ｐＨ对水解的影响极大，所以在选定的温度和激活剂的情况下，继续考虑ｐＨ的影响。实验测定了ｐＨ为６．５和６．２的酶水解进程。结２ｏｍｔ－ｍｓｍ ４１工芝技雍工芝技夜４２ ＋黑 万方数据翻翰Ｆ ａｎｄ铂如比ｇｙ ｏｆ Ｆｏｏｄ由图３可以看到，酶水解度随着酶量的增大而 增大，在添加量为２ｇ时，酶的水解度有一个显著的升高，而低于此值（如从１到１．５ｇ）时则不够明显。从制取高水解度肤段考虑，决定取酶的最佳添加量为每８０ｇ底物添加２ｇ酶，即底物／酶比为４０：１ （ｇ／ｇ） ｏ３结论与展望本实验通过对各种酶反应进程的监测，适用于 制备高水解度大豆肤的蛋白酶为Ａｌｃａｌａｓｅ和ＡＳ１．３９８，并通过正交实验确定了它们的最适作用条件。Ａｌｃａｌａｓｅ的最适条件为：温度５５＇Ｃ， ｐＨ８．５，底物／酶量比为８０ （ｇ／ｍＬ ），在此条件下水解４ｈ后水解度可达２０．４２％ ； ＡＳ １．３９８的最适条件为：温度４０９Ｃ，ｐＨ７．０， ＣａＣ１２０．００１ ％，底物／酶量比为４０ （ｇ／ｇ ），在此条件下水解４ｈ后水解度可达２５．４９％。以上条件的果表明，水解４ｈ的水解度分别为１７．５５％和１２．９４％，确定为进一步水解制备高水解度和功能性的大豆肤可以确定在ｐＨ７．０水解４ｈ时的水解度取得了最大奠定了基础。值，从而确定最佳ｐＨ为７．０ ０在确定的温度、 ｐＨ和激活剂条件下，底物浓度、参考文献：总量（８０ｇ）不变，改变酶的添加量，分别加人酶０．５，；１］钱嘉川译，Ｂ施特尔马赫著．酶的浏定方法［Ｍ］．中国轻工１．０ ，１．５ ， ２．摊，作出酶反应曲线如图３所示。业出版社．２８「１２１张树政．酶制剂工业（下册）［Ｍ］．中国轻工业出版社．２８４０〔２一ｒ月尸Ｊ代二二二［３１汪庆辉，崔东善，林杨，等．大豆蛋白肤加工工艺技术概述［Ｊ１．（享６４大豆通报，，２００１，６．）侧２０准８酶的添加量０．酶的添加量５ｇ［４］ Ｊｅｎｓ Ａｄｌｅｒ－Ｎｉｓｓｅｎ． Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ书６４２酶的添加量０２０５ｇ［Ｍ］．Ｅｌｓｖｉｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｓｈｅｒｓ Ｌｏｎｄｏｉｎ ａｎｄ Ｎｅｗ．酶的ｉ ｌｆ加量２Ｌ１．ｏＹｏｒｋ．１２０ １８０ ２４０时间（ｍｉ ｎ）［５］ Ｊｅｎｓ Ａｄｌｅｒ－Ｎｉｓｓｅｎ． Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｄｅｇｒｅｅ ｏｆ Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ图３水解度与酶的添加量的关系ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｐｏｒｔｅｉｎ Ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅｓ场Ｔｒｉｎｉｔｒｏｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ田．Ａｇｒｉｃ ａｎｄ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ，１９７９，２７（６）．（上接第３９页）水分８． １８％；脂肪０．２５％；蛋白８０．１６％；碳水化饲料工业，２００２（２）：４１－４２．合物０．１３％；灰分６．２０％；白度（Ｈｕｎｔｅｒ） ７５ ０［４］汪家政，范明主编．蛋白质技术手册［［Ｍ］．北京：科学出版社，３结论２０００，８．７７－８９．根据对大米蛋白碱法提取工艺的研究，得到以 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