微生物知识培训资料

基本知识：

1、 微生物限度检查法概念：系指检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物

污染程度的方法。检查项目包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌检查。 2、 微生物限度检查应在环境洁净度10 000级下的局部100级的单向流空气区域

进行。检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染。单向流空气区域、工作台面和环境应定期按《医药洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。

3、 供试品检查时，如果使用了表面活性剂、中和剂或灭活剂。应证明其有效性

及对微生物的成长和存活无影响。

4、 除另有规定外，本检查法中细菌培养温度为30~35℃。霉菌、酵母菌培养温

度为23~28℃。控制菌培养温度为35~37℃。 5、 检验结果以1g 1ml 10g 10ml或10cm2为单位报告。

检验量：即一次实验所用的供试品量（g ml或cm2）。除另有规定外，一般供试品的检验量为10g或10ml。膜剂为100 cm2 、贵重物品、微量包装药品的检验量可以酌减，要求检查沙门菌的供试品，其检验量应增加20g或20ml（其中10g或10ml用于阳性对照试验）。

检验时，应从2个以上最小包装单位中抽取供试品。一般应随机抽取不少于检验用量（两个以上最小包装单位）的3倍量供试品。 6、 培养基的配制和灭菌：

培养基的配制按使用说明书上配制。灭菌用手提式高压灭菌锅，灭菌温度及时间：营养琼脂pH7.0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液等不含糖的培养基、稀释瓶、稀释管等灭菌温度是121℃，时间为20min。虎红琼脂、乳糖胆盐培养基等含糖的培养基灭菌温度为115℃，时间为20min.

培养皿及吸管的灭菌用电热恒温干燥箱，温度为160℃以上2小时。吸管为防止污染应在管口塞入棉花后灭菌。 7、微生物限度标准：

非无菌药品的微生物限度标准是基于药品的给药途径和对患者健康潜在的危害以及中药的特殊性而制订的。我公司产品为口服给药制剂，其微生物限度

标准为： 7.1不含药材原粉的制剂：细菌数 每1g不得过1000cfu。每1ml不得过100cfu。

霉菌和酵母菌数 每1g或1ml不得过100cfu。 大肠埃希菌 每1g或1ml不得检出。

7.2含药材原粉的制剂：细菌数 每1g不得过10 000cfu。每1ml不得过500cfu。

霉菌和酵母菌数 每1g或1ml不得过100cfu。 大肠埃希菌 每1g或1ml不得检出。

大肠菌群 每1g应小于100个。每1ml应小于100个。 基本操作知识：

1、 供试液的制备：根据供试品的理化特征与生物学特性。采取适宜的方法制备供试液。供试液制备若需要用水浴加温时，温度不应超过45℃，供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小时。

（1）液体供试品：取供试品10ml，加pH7.0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为1：10供试液，油剂可加入适量的无菌聚山梨酯80使供试品均匀分散。水溶性液剂也可用混合的供试品原液作为供试液。

（2）固体、半固体或粘稠性供试品：取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液至100ml，用匀浆仪或其他适宜的方法，混匀。作为1：10供试液。必要时加适量的无菌聚山梨脂80，并置水浴中适当加温使供试品分散均匀。 2、供试品检查法

（1）平皿法：采用平皿法进行菌数测定时，应取适宜的连续2~3个稀释级的供试液。取供试液1ml置直径90mm的无菌平皿中，注入15~20ml温度不超过45℃的熔化的培养基，混匀，凝固。倒置培养，每稀释级每种培养至少制备2个平板。

（2）阴性对照实验：取实验用稀释液1ml，置无菌培养基，凝固，倒置培养。每种计数用的培养基各制备2个平板，均不得有菌生长。

（3）培养和计数：除另有规定外，细菌培养3天，霉菌，酵母菌培养5天，逐日观察菌落生长情况，点计菌落数，必要时，可以适当延长培养时间至7天进

行菌落计数报告。菌落蔓延生长成片的平板不宜计数。点计菌落数后，计算各稀释级供试品的平均菌落数。按菌落报告规则报告菌数。若稀释级两个平板的菌落平均不小于15，则两个平板的菌落数不能相差1倍或以上。

（4）菌数报告规则：细菌，酵母菌宜选取平均菌落数小于300cfu、霉菌宜选取平均菌落数小于100cfu的稀释级，作为菌落数报告（取两位有效数字）的依据。以最高的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告1g、1ml或10cm2供试品中所含的菌数。

如各稀释级的平板均无菌落生长，或仅最低稀释级的平板有菌落生长，但平板菌落数小于1时，以<1乘以最低稀释级倍数的值报告。 3、 控制菌检查

（1）检查法：供试品的控制菌检查应按已验证的方法进行。

（2）阳性对照实验：阳性对照实验方法同供试品的控制菌检查，加菌量为10～100cfu，。阳性对照实验应检出相应的控制菌。

（3）阴性对照实验：取稀释液10ml照相应控制菌检查法检查，作为阴性对照。阴性对照应无菌生长。

大肠埃希菌：取供试液10ml（相当于供试品1g、1ml、10 cm2），直接或处理后接种至适量（不少于100ml）的胆盐乳糖培养基中，培养18～24小时。必要时可延长至48小时。取上述培养物0.2ml，接种至5mlMUG培养基试管内，培养。于5小时 24小时在366nm紫外光下观察。若管内培养物呈现荧光，为MUG阳性，不呈现荧光，为MUG阴性。观察后，沿培养管的管壁加入数滴靛基质试液。液面呈玫瑰红色，为靛基质阳性。呈试剂本色，为靛基质阴性。本底对照应为MUG阴性和靛基质阴性。

结果判断：如MUG阳性，靛基质阳性，判供试品检出大肠埃希菌。如MUG阴性，靛基质阴性，判供试品未检出大肠埃希菌。如MUG阳性，靛基质阴性，或MUG阴性，靛基质阳性，则应取胆盐乳糖培养基的培养物划线接种于曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基的平板上培养18~24小时。

若平板上无菌落生长或生长的菌落不具大肠埃希菌菌落形态特征，判供试品未检出大肠埃希菌。若平板上生长的菌落与大肠埃希菌菌落形态特征相符或疑似，应进行分离、纯化、染色镜检和适宜的鉴定试验，确认是否为大肠埃希菌。

大肠菌群：取含适量（不少于10ml）的乳糖胆盐发酵培养基管3支，分别加入1：10的供试液1ml（含供试品0.1g或0.1ml），1：100供试液1ml（含供试品0.01g或0.01ml），1：1000供试液1ml（含供试品0.001g或0.001ml）。另取一支乳糖胆盐发酵培养基管加入稀释液1ml作为阴性对照管。培养18～24小时。 结果判断：乳糖胆盐发酵管若无菌生长，或有菌生长但不产酸产气，判该管未检出大肠菌群。若产酸产气，将培养物分别划线接种于曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基的平板上，培养18～24小时。若平板上无菌落生长或生长的菌落非革兰阴性无芽孢杆菌，判未检出大肠菌群。若平板上生长的菌落形态疑似革兰阴性无芽孢杆菌，应进行确证实验。

确证实验：从上述分离平板上挑选4~5个疑似菌落，分别接种于乳糖发酵管中，培养24~48小时。若产酸产气，判该乳糖发酵管检出大肠菌群，否则判未检出大肠菌群。

报告数：根据大肠菌群的检出管数，按下表1报告1g或1ml供试品中的大肠菌群数。

表1可能的大肠菌群数

各供试品量的检出结果 0.1g或0.1ml + + + - 0.01g或0.01ml + + - -

可能的大肠菌群数N 0.001g或0.001ml + - - - (个/g或ml) >10 10