饲料中沙门氏菌的污染现状及检测方法探究

高丽娜 马丹

农业部渔业环境及水产品质量监督检验测试中心（天津）300221

中国天津市南路442号 邮编：300221

摘要：沙门氏菌是一类革兰氏阴性、长有鞭毛的兼性需氧菌，多数存在于动物的排泄物中，其引起食物中毒的发病率极高。本文对沙门氏菌的三种主要检测方法：微生物学检测法、酶联免疫吸附法、PCR快速检测技术的实验方法、注意事项以及优缺点进行探究，对于更为准确快速鉴定沙门氏菌，防止沙门氏菌进一步蔓延具有一定的意义。

关键词：饲料、沙门氏菌、检测方法

The Present Situation of Pollution and the Investigate of the Testing method in the Salmonella of the Fodder

Gao Li-na ,Ma-dan

(The department of the Agriculture , Fishery environment and the Aquatic Product’s quality Supervise Center , Tian jin ,300221,China)

Abstract:Salmonella was the kind of facultative aerobe which was a feminin gram and had flagellum, most of them were in the agesta of animals, the incidence of the food poisoning which caused by the Salmonella was very high. The article maily investigated the experiment method、considerations、advantage and disadvantage of microorganism testiny method 、enzyme linked immunosorbent 、PCR quick test .It would have important significance to indentificate the Salmonella, and prevent the Salmonella from spreading.

Key words:Fodder、Salmonella、Testing method

沙门氏菌是一类革兰氏阴性、长有鞭毛的兼性需氧菌，包括波哥沙门菌属和肠炎沙门氏菌属。它是一种饲料中常见的主要肠道杆菌，能够引起食源性动物败血症[1]。沙门氏菌还是一种人和动物的重要致病菌，人的大多数沙门氏菌感染直接或间接地与动物性食品有关，而动物的沙门氏菌感染和带菌与所食用的动物性饲料中的沙门氏菌污染有直接关系[2]。由于沙门氏菌很容易在自然环境及动物体内存活和增殖,而且饲料原料（包括动物性及植物性原料）、饲料的粉碎加工及打包过程中都会引进沙门氏菌而污染饲料。因此准确快速地检测饲料中的沙门氏菌，对于畜禽健康、食品安全以及公共卫生都具有重

作者简介：高丽娜（1982- ），女，天津市人，助理工程师，研究方向为饲料微生物检测 Email:linagao@163.com

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要的意义。

根据沙门氏菌的特征，其检验方法及鉴定方法需经较为复杂的手段才能确切的识别。就目前检测技术来讲，主要有三种检测方法，传统的微生物学检测法，直接ELISA检测法以及PCR检测法。本文主要就这三种检测方法的实验方法、注意事项以及优缺点进行探究，对于更为准确快速地鉴定沙门氏菌，防止沙门氏菌进一步蔓延具有一定意义。

一、微生物学检测法 1.1 前增菌

将25g样品放入盛有225mlBPW（缓冲蛋白胨水）的无菌均质杯中，以8000r/min~10000 r/min均质1min~2min，于36℃±1℃培养8h~18h。 1.2 增菌

将1ml样品混合物转种于10mlTTB（四硫磺酸钠煌绿增菌液），于42℃±1℃培养18h~24h。同时，另取1ml样品混合物于10mlSC(亚硒酸盐胱氨酸增菌液)，于36℃±1℃培养18h~24h。 1.3 菌落分离

取上述两种增菌液划线接种于BS琼脂平板、HE 琼脂平板以及XLD琼脂平板上 ,置 37 ℃温箱中 ，BS琼脂平板培养48小时，HE 琼脂平板以及XLD琼脂平板上培养24小时。

表1 沙门氏菌属在不同选择性琼脂板上的菌落特征

(table 1 :The bacteria colonies characteristic of Salmonella on different selective medium boards )

选择性琼脂面板

BS琼脂 HE 琼脂 XLD琼脂 沙门氏菌显色培养基

沙门氏菌

菌落为黑色，有金属光泽、棕褐色或灰色，菌落周围培养基可呈黑色或棕色；有些菌株形成灰绿色的菌落，周围培养基不变。

蓝绿色或蓝色，多数菌落中心黑色或几乎全黑色；有些菌株为黄色，中心黑色或几乎全黑色。

菌落呈粉红色，带或不带黑色中心，有些菌株可呈现大的带光泽的黑色中心，或呈现全部黑色的菌落；有些菌株为黄色菌落，带或不带黑色中心。 按照显色培养基的说明进行判定。

1.4 生化试验[3]

自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落，接种三糖铁琼脂，接种针不要灭菌，直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板，于36℃±1℃培养18h~24h。沙门氏菌的反应结果见表2

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表2 沙门氏菌属在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内的反应结果

(Table 2:The reaction of the Salmonella in triple sugar iron agar and Lysine-decarboxylase culture medium)

三糖铁琼脂

赖氨酸脱羧酶试验培养基

斜面 K K A A K

底层 A A A A K

产气

硫化氢

初步判断

﹢（﹣） ﹢（﹣） ﹢（﹣） ﹢（﹣） ﹢（﹣） ﹢（﹣） ﹢/﹣ ﹢/﹣

﹢/﹣ ﹢/﹣

﹢

﹣

可疑沙门氏菌属 可疑沙门氏菌属 可疑沙门氏菌属 非沙门氏菌 非沙门氏菌

﹢

﹣

﹢/﹣

注：K：产碱，A：产酸；﹢：阳性，﹣：阴性；﹢（﹣）：多数阳性，少数阴性；﹢/﹣：阳性或阴性

可选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统，根据表2的初步判定结果，从营养琼脂平板上挑取可疑菌落，用生理盐水制备成浊度适当的菌悬液，使用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统进行鉴定。 1.5 血清学鉴定

按沙门氏菌属诊断血清操作说明书进行反应。A-F多价血清菌体试验结果分类如下:

阳性反应:混合物试验凝集，而在盐水对照中不凝集; 阴性反应:混合物试验不凝集，而在盐水对照中也不凝集。 二、酶联免疫吸附法（ELISA）

酶联免疫吸附测定法（Enzyme-Linked Lmminosorbent Assay），简称ELISA，是从酶标记抗体技术发展起来的[4]。酶联免疫吸附技术（ELISA）作为一种先进的免疫化学检测技术正越来越广泛地应用于沙门氏菌检测中，它是一种将抗原抗体免疫反应的特异性和酶的高效催化作用有机地结合起来并用于检测的一种应用型技术。它的原理是把抗原或抗体在不损坏其免疫活性的条件下预先结合到某种固相载体表面；测定时，将受检样品（含待测抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按一定程序与结合在固相载体上的抗原或抗体起反应形成抗原或抗体复合物；反应终止时，固相载体上酶标抗原或抗体被结合量（免疫复合物）即与标本中待检抗体或抗原的量成一定比例；经洗涤去除反应液中其他物质，加入酶反应底物后，底物即被固相载体上的酶催化变为有色产物，最后通过定性或定量分析有色产物量即可确定样品中待测

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物质含量[5]。目前ELISA法在沙门氏菌检测中几种常用的方法主要有：直接ELISA法、竞争ELISA法、Dot-ELISA法、LPS-ELISA法和PCR-ELISA法，在沙门氏菌检测中，ELISA法具有良好的特异性和敏感性[6]，几乎所有可溶性的抗体、抗原反应系统均可检测，最小可测值能够达到ng甚至pg水平[7]。

酶联免疫吸附测定法结合了免疫荧光法和放射免疫测定法两种技术的优点，具

有可定量，反应灵敏准确、标记物稳定、适用范围宽、检测速度快以及费用低等特点。该方法在食品安全检测中有广泛的应用，可用于食品中农药残留的测定、动物食品兽药残留和违禁药物的测定、转基因食品的检测、食品中病原微生物的筛选、食品中生物毒素的检测、食品中重金属污染的检测等。

三、 PCR快速检测技术

聚合酶链式反应（PCR）技术（Polymerase Chain Reaction）是近代发展起来的一种体外扩增特异DNA片段的技术，可在短时间内将靶DNA（或RNA）扩增数百万倍。PCR和DNA探针杂交联合使用来检测食品中的沙门氏菌，具有简便、快速、敏感性高和特异性强的优点。Rahn等在1992年率先根据鼠伤寒沙门氏菌InvA基因设计出一对引物，可用于沙门氏菌的检测。

PCR技术的基本原理是利用Taq DNA 聚合酶（Taq酶）依赖DNA模板的特性，

利用PCR仪模仿生物体内DNA的复制过程。

PCR反应体系主要由引物、Dntps、DNA聚合酶、缓冲液、核酸模板及Mg2+ 组成。设计一对适宜的引物是应用PCR方法检测沙门氏菌的关键所在，该引物所介导的DNA扩增序列应是沙门氏菌独有的，且为保守序列，能保证检测结果的特异性。常见沙门氏菌靶序列及其引物主要有以下几种：

1、InvA、B、C、D：这组基因是目前报道的最多的一组靶基因，这组基因决定了沙

门氏菌进入上皮细胞的能力。 2、编码沙门氏菌鞭毛蛋白的基因序列。 3、编码菌毛的fimA基因序列。

在PCR技术中，变性一步也很重要，此步若不能使靶基因模板和PCR产物完全变性，就会导致PCR 失败。变性温度以及循环次数都会对PCR的变性结果产生影响。循环次数决定着扩增程度，过多的循环会增加非特异扩增产物的数量和复杂性；循环次数过少，PCR产物量就会很低。根据章新生、臧富妍等人的研究，在加Tap酶前，98℃水浴10min，在循环开始后，94℃变性1 min，循环32次，有利于PCR

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变性过程的完成[8]。

四、 小结：

微生物检验法、酶联免疫吸附法（ELISA）、聚合酶链式反应（PCR）三种检测技术各有利弊。微生物法由于采用细菌分离、生化鉴定等表型方法，过程繁琐、费时费力，在肠杆菌科细菌间的生化反应多有交叉，表型检测在快速、敏感与特异性等方面有自身的局限性[9-11]；ELISA法步骤繁琐，且需要特殊的仪器；PCR技术以其敏感性、特异性、简便、快速的优点，现已广泛应用于沙门氏菌的检测，尤其对培养困难的细菌检测和抗原结构复杂的细菌鉴定方面，具有常规方法无法比拟的优越性[12]。目前在沙门氏菌检测中，多采用一种联合检测技术，大量样品以直接ELISA法粗选、阳性者采用PCR法筛选，而对沙门氏菌血清型确定仍需要用微生物法加以鉴定，此种方法具有高度的特异性、敏感性和快速简便等优点，被广泛应用。

参考文献

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[12] 黄金林.直接ELISA和PCR相结合快速检测样品中的沙门氏菌[D].扬州：扬州大学，2004.

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