AFLP分子标记技术

AFLP分子标记技术及其应用

•一、什么叫AFLP？

•二、AFLP的基本原理是什么？ •三、AFLP的实验过程怎样？ •四、AFLP的应用研究如何？ •五、对AFLP的评价

分子标记的历史：

•第一代分子标记技术 RFLP （Restriction Fragment Length Polymorphism，限制性片段长度多态

性）

•第二代分子标记技术 RAPD（Random Amplified Polymorphic DNA，随机扩增多态性DNA ） AFLP （Amplified Fragment Length Polymorphism，扩增片断长度多态性）

•事实上，还有很多分子标记技术像SSR、ISSR、SRAP（相关序列扩增多态性）另外，还有现在号称

为第三代分子标记的SNP（ 单核苷酸多态性) 等

AFLP的基本原理

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•基因组DNA经两种限制性内切酶酶切，形成分子量大小不等的随机限制性酶切片段，将特定的人工

合成的短的双链接头连在这些片段的两端，形成一个带接头的特异片段，通过接头序列和PCR引物3ˊ端选择性碱基的识别，对特异性片段进行预扩增和选择性扩增。最后只有那些两端序列能与选择性碱基配对的限制性酶切片段才能被扩增；最后将选择性扩增产物在高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，寻找多态性扩增片段。

AFLP的实验流程

•模板制备

➢DNA的提取（SDS法和CTAB法） ➢酶切 ➢连接

PCR扩增(PCR AMPLIFIED )

➢预扩增(Pre-amplified) 选择性扩增(Elective amplified)

DNA的提取（SDS法和CTAB法）

•SDS是Sodium dodecyl sulfate的缩写称为十二烷基磺酸钠，

•CTAB是Cetyl trimethyl ammonium bromide的缩写十六烷基三甲基溴化氨，

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•两种都是去污剂，它们都能破坏细胞膜使膜蛋白变性沉淀，故而使核酸释放出来，另外，它还能保护

DNA不受内源核酸酶的降解。

酶切

•为了使酶切片段大小分布均匀，一般采用两个限制性内切酶，一个用6个碱基识别位点的限制性内切

酶(常用EcoRI,、PstI或SacI )，另一个用4个碱基识别位点的限制性内切酶(常用MseI 、TaqI)。采用双酶切的主要原因有：(1)多切点酶产生较小的DNA片段，而切数点较少的酶能够减少扩增片段的数目，因为扩增片段主要是多切点酶和切点数较少的酶组合产生的酶切片段，这样就可以减少选择扩增时所需要的选择碱基数。(2)双酶切可以进行单链标记，从而防止形成双链造成的干扰。(3)双酶切可以对扩增片段数进行灵活调节。(4)通过少数引物可产生许多不同的引物组合，从而产生大量的不同的AFLP指纹。这样，经过酶切后就形成了三种类型的酶切片段，如EcoRI/MseI酶切形成EcoRI一EcoRI片段、EcoRI一MseI片段、Mse工一MseI片段，由于AFLP技术革新成功的关键在于DNA的充分酶切，所以对模板质量要求很高，要注意避免其它DNA污染和抑制物质存在。

连接

•酶切后的DNA片段在T4 DNA连接酶作用下与两种内切酶相应的特定接头相连接，形成带接头的特

异性片段。接头为双链，由两部分组成，一部分是核心序列，一部分是酶特定序列(能与酶切片段粘端互补)，通常在酶特定序列中变换了一个内切酶识别位点的碱基，保证了连接片段不能再被酶切。只有遵循“引物扩增原则”设计的接头才能得到满意的扩增结果。

PCR扩增(PCR AMPLIFIED )

•应用与接头相识别的引物进行扩增。AFLP引物由三部分组成：（1）5′端的与人工接头序列互补的核

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心序列(core sequence)（2）限制性内切酶特定识别序列(enzyme-specific sequence) （3）3′端的带有选择性碱基的粘性末端(selective extension)，其中AFLP接头的设计(包括核心序列和酶特定序列)是关键之处，常用的多为EcoRI和MseI接头，接头和与接头相邻的酶切片段的碱基序列是引物的结合位点，合成的寡核苷酸接头经过94℃变性，37℃退火，4℃保存备用；理论上每增加一个选择性碱基，将只扩增限制性片段的1/4，而在两个引物上都有三个选择性碱基的情况下，则仅获得1/4096的片段；也就是说，只有那些两端序列能与选择碱基配对的限制酶切片段被扩增。所以选择性碱基是选择用于扩增的特定的限制性片段的一种精确而有效的方法；

预扩增(Pre-amplified)

➢扩增所用引物3′端有一个选择碱基，通过预扩增对扩增模板进行初步筛选，一方面可以避免直接扩

增造成的指纹带型背景拖尾现象，另一方面可以避免直接扩增由引物3′端3个选择碱基误配形成的扩增产物。

•选择性扩增(Elective amplified)

➢预扩增产物经稀释后进行选择性扩增，使所需模板量不受限制。所用引物3′端有3个选择碱基的延

伸，通过3个选择碱基的变换获得丰富的DNA片段。

AFLP技术的改良

•内切酶的应用

➢有多种内切酶组合如EcoRI、PstI、 SacI、 HindIII或Apal与MseI、 TaqI用于AFLP技术

➢只应用一种内切酶制备模板（单酶切）

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➢也有应用三种内切酶的报道（三酶切）TE-AFLP

•引物的标记及结果显示

➢引物标记已从同位素标记发展到目前的荧光标记，荧光标记减少了同位素对人体的损害，同时使结

果分析更加便利准确，但费用仍然很高，单酶切AFLP法的引物不需要标记，只需通过琼脂糖凝胶电泳、紫外透射仪观察结果，省时、方便，但溴化乙锭对人体有危害。现有一种银染法可以降低成本又对人体无害，但操作相对复杂繁琐又费时。

•其它类型

➢AFLP技术是基于对基因组DNA的分析而创建的，目前已有cDNA-AFLP，还有甲基化敏感-AFLP 。

AFLP的应用研究

•AFLP技术在植物研究上的应用

➢基因定位及构建遗传图谱

➢遗传多样性分析和种质资源鉴定

➢辅助育种

➢研究基因表达与调控

➢居群的遗传结构与保护生物学研究

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•其它方面的应用

•AFLP结合BSA(分群分析法，Bulk segregate analysis)可进行基因的快速定位；Ballvora利用AFLP

技术结合BSA法精确定位了马铃薯的根包囊线虫抗病基因Grol ；AFLP技术能找出因基因枪法或完整细胞电穿孔而产生的转基因大米中发生的隐藏的基因改变；对于构建遗传图谱，AFLP被认为是迄今最有效的分子标记技术；近几年来，利用AFLP技术已对桉树、杨树、松树、桃树进行了遗传图谱的构建并取得了长足的进展。

AFLP技术在植物遗传多样性分析和种质资源鉴定上的应用

•种质资源收集的遗传多样性可通过谱系记录与DNA指纹分析两条途径相结合，其目的是对种质资源

进行分类、描述杂合的类群与杂合式样、追索育种的历史；AFLP在鉴定与评估种质资源方面有广泛的应用前景；有人进行了花生多态标记的AFLP鉴定；有人用AFLP评估了太平洋西北小麦品种的遗传多样性；还有人用了6个AFLP引物组合得到359个AFLP扩增带，对24个向日葵优良品系的遗传多样性进行了分析。另周志勇等人采用双酶切的方法，将AFLP技术应用于人参、西洋参基因组指纹图谱，发现二者在遗传上有较近的亲缘关系，但引种到我国吉林的西洋参与西洋参基因组DNA相比有一定变异，证明了AFLP分子标记技术有望成为一种独立的、确实可行的手段，用于人参、西洋参等药用植物品种的鉴别。

AFLP技术在植物辅助育种研究上的应用

•在指纹图谱技术出现以前，基因图谱只能依靠植物的表现型和同工酶分析来建立DNA指纹图谱，特

别是AFLP技术的出现，使标志的数量大大增加，进而使分辨率大大提高；特定农业性状与标志连锁关系的建立在育种上有重大的经济价值，使得定向育种成为可能，不仅减少了育种的工作量，而且还使时间缩短，使人们能在植物生长早期就预知它的某些性状并加以筛选；Jonathan等人通过AFLP标志研究番茄，发现许多DNA标志与番茄抗叶霉病菌的基因相联系；同样，Christiane Gebhardts小组发现29条AFLP

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标志与马铃薯抗晚疫病菌的R1基因有关，2条与抗孢囊线虫的基因有关；用相同的方法Matthews等也发现与白杨抗叶锈病相关的标志；这种将传统育种与现代分子生物学结合的分子标记协助育种已被大量的采用。

AFLP技术在植物基因表达与调控研究上的应用

•Bachem等人采用AFLP技术检测了马铃薯块茎发育过程中基因表达情况，他们利用3个引物组合,

进行块茎发育不同时期的AFLP分析，得到了块茎特异转录的片段TDFS，2个TDFS片段与关键基因LOX高度同源，且二者在块茎的不同时期表达的量不一样；表明了AFLP是研究基因表达非常有效的方法，可同时比较植物不同时期以及分离某些重要基因。

AFLP技术在植物居群的遗传结构与保护生物学研究研究上的应用

•Travis等1996年第一次将AFLP产生的220个多态标记用于评估一种临界于濒危的黄芪属

(Astragalus)植物（Astragalus cremnophylax var. cremnophylax）的3个已知居群的居群内与居群间的多态信息含量和遗传变异的分配，他们还用AMOVA分析了居群间的分化；这些结果指出在居群内存在空间上分离的组，与UPGMA聚类和主成分分析的结果一致；提出了保护这个物种的若干建议；Krauss和Peakell用AFLP对Persooniamollis的天然居群作了分析；Winfield 1988年研究了英国Sevem地区黑杨亚种Populasnigra subsp.Betulifolia的遗传多样性；Breyne等1997年将Arabidopsis thaliana作为模式物种，用AFLP技术评估了基因组的多样性；他们认为AFLP测十分相近的基因型之间的细微差异足够灵敏，非常适合于评估居群内与居群间的多样性水平和描述种下水平的遗传关系；他们也用AFLP测定天然居群和热带树种的遗传变异。

其它方面的应用

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•AFLP技术除可以用于植物方面外还可以用于动、微生物、寄生虫、昆虫、人群等方面。吴丰春等应

用AFLP技术采用单酶切对小鼠进行了遗传检测的研究，为小鼠从DNA上的遗传检测提供了一种新的技术手段； AFLP技术在微生物学领域的应用也相当广泛，在微生物分类、基因标定、亲缘关系及遗传多样性研究都有不俗的表现，特别是微生物的鉴定和品系分析方面更是成绩可佳。在流行病检测中AFLP标记已成为微生物病原体诊断的理想技术。在肿瘤发病机制的研究中，肿瘤易感基因的检测是首要任务，而AFLP标记为肿瘤基因组的检测带来了一种新的方法。是一种较为理想的技术。Fukuda T等用cDNA-AFLP法对大鼠高低转移性骨肉瘤基因组进行对比检测，得到43条差异片段，通过筛选，克隆出与大鼠骨肉瘤转移有关的4种差异表达基因；Majima S等应用同样的方法克隆出与肾癌发生相关的一种新基因—Niban；Yamamoto F应用甲基化敏感-AFLP技术检测了乳腺癌的基因变化。这些都会对以后研究肿瘤发病机制发挥重要作用。

五、对AFLP的评价

•AFLP技术特点

➢（1）所需DNA量少，扩增效率高，多态性强，易于分辨。

➢（2）AFLP'标记结果稳定可靠，重复性强，不受基因组来源和复杂度的影响，使不同时间、不同实

验室的结果可以进行比较，有利于进行回顾性研究，并促进信息与资料的交流，达到资源共享。

➢（3）AFLP标记呈典型的孟德尔遗传，可作为物理图谱和遗传图谱的联系桥梁，用于构建基因组高

密度连锁图谱。

➢（4）图谱构建聚类显著，定位专一。

➢（5）AFLP对模板浓度不敏感，允许一定强度的共扩增，样本DNA量相差1000倍仍可获得相同的

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结果。

作为DNA指纹技术的评价

众多研究者对RFLP及SSR, RAPD, AFLP四种分子标记技术进行了比较分析，综合考虑遗传稳定性

和标记系统机制(速度、费用、可靠性)，提出了标记指数MI(Marker index) ，MI是变异指数DI ( Diversity index)和有效复合比EMR( Effective multiplex ratio)两者的综合反应。DI是指信息含量即期望异质性(Expected Heterozygosity) ；EMR是指单位实验里能同时检测到的位点数，MI实际上还包含了鉴定亲缘关系的有效性这一层意思。应用这一评价体系，得出AFLP具有最高的EMR，SSR具有最高的DI，这一结论已在对菜豆及西北欧栽培马铃薯的研究中得到相互验证。同时还发现，在种间水平上，RFLP、SSR、AFLP具有很高的相关性，然而RAPD与三者相关性低。如果是在种内水平上，则所有标记系统相关性均低，1995年7月30日召开的美国园艺学会(ASHS)第92届年会上，与会专家一致认为四大标记系统综合效用大小应该是AFLP > SSR > RAPD>RFLP。

存在的问题极其对策

•AFLP技术虽然是对生物基因组进行分析的一种较为理想的方法，但任何分子标记都有其优缺点，

AFLP标记的不足之处在于步骤繁琐、费时、所需实验试剂及设备费用仍较高，操作技术难度大等，如AFLP技术和DNA纯度要求很高，需要高质量、高纯度的DNA，由于其灵敏度高，微量的DNA污染可以导致很大的偏差等；但AFLP标记无法比拟的优点,使其得到了快速的推广和应用。用AFLP标记进行研究的文献比率呈逐年上升趋势。随着AFLP操作步骤的简单化、规范化和自动化，AFLP分析的效率会进一步提高，应用范围会不断扩大，AFLP标记将成为生物学工作者手中强有力的研究工具。

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