多糖多酚植物基因组DNA提取CTAB方法的技术改进[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 109897849 A(43)申请公布日 2019.06.18

(21)申请号 201711343588.0(22)申请日 2017.12.07

(71)申请人 中禾生物种业集团有限公司

地址 518040 广东省深圳市福田区车公庙

高尔夫大厦11楼中禾生物种业集团(72)发明人 不公告发明人　(51)Int.Cl.

C12N 15/10(2006.01)

权利要求书1页 说明书3页 附图1页

(54)发明名称

多糖多酚植物基因组DNA提取CTAB方法的技术改进(57)摘要

本发明实现了一种多糖多酚类植物中DNA提取的方法改进。这种改进方法，在提取多糖多酚

会首先使用含有聚乙烯吡植物组织DNA的时候，

咯烷酮PVP K-90的CTAB缓冲液浸泡多糖多酚的植物组织，然后在植物组织DNA通过碱性氧化铝的柱子的时候，先利用氯化钙溶液浸泡碱性氧化铝柱子，最后一步沉淀洗涤的时候，再用含有聚乙烯吡咯烷酮PVP K-90的乙醇溶液沉淀浸洗提取的DNA，去除其它杂质。通过这些处理步骤提高了利用CTAB方法在多糖多酚植物中DNA提取的浓度和效率。CN 109897849 ACN 109897849 A

权　利　要　求　书

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1.一种改进的CTAB多糖多酚类植物DNA的提取方法，加入70％的乙醇配制的聚乙烯吡咯烷酮PVP K-9025％溶液配制溶液CTAB缓冲液来裂解细胞提取DNA，CTAB缓冲液中聚乙烯吡咯烷酮PVP K-90终浓度为5％。

2.根据权利书1的要求，该方法在提取DNA的过程中，对多糖多酚植物的DNA样品在提取前进行含有聚乙烯吡咯烷酮PVP K-90的CTAB缓冲液65度的预热浸泡震荡处理10分钟，然后再进行提取。

3.根据权利书2的要求，该方法在提取DNA的过程。提取的DNA溶液将会通过碱性氧化铝柱，推荐在过柱前，先对柱子进行3％氯化钙浸泡，以提高柱子对DNA的吸附能力。

4.根据权利书3的要求，该方法在提取DNA过程的最后，使用70％的乙醇配制聚乙烯吡咯烷酮PVP K-90，使得聚乙烯吡咯烷酮PVP K-90在70％乙醇中终浓度为5％，再利用这种溶液沉淀清洗提取的DNA溶液以得到更高质量的DNA。

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多糖多酚植物基因组DNA提取CTAB方法的技术改进

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技术领域

[0001]本发明涉及到一种CTAB的DNA提取方法，尤其是在多糖多酚植物中怎么样改善DNA提取效率的方法

背景技术

[0002]提取DNA是很多分子生物学实验技术的基础，是很多有关分子生物学实验的基础，怎么样能够高效率从样品中提取DNA，一直是分子生物学技术人员非常关心的话题。[0003]CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂，具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高离子强度的溶液中(＞0.7mol/L NaCl)，CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。大体上CTAB方法提取植物DNA的整个过程是，先采用机械破碎植物细胞，然后加入CTAB分离缓冲液将DNA溶解出来，再经氯仿-异戊醇抽提除去蛋白质，最后得到DNA。[0004]在提取DNA的过程中，多糖多酚类的物质会严重的阻扰DNA的提取。该类多糖多酚类物质主要是植物体内的复杂酚类次生代谢物，具有多元酚结构，主要存在于植物的皮、根、叶、果中。在植物中的含量仅次于纤维素。酚类是植物特有的一种次生代谢产物，是非常容易被氧化成为褐色的醌类次生代谢产物。某些植物和植物的某些特异组织含有较高量的酚类物质。植物多糖，又称植物多聚糖，是植物细胞代谢产生的聚合度超过10个的聚糖。而糖类也是植物次生代谢的重要产物，由于核酸都是由多糖类物质构成，提取的多糖成分经常混合在DNA提取的终产物的过程中，干扰核酸的提取纯化。[0005]在提取DNA的过程中，多糖多酚类物质会结合到DNA中，有的甚至形成不可逆的结合，并且难以去除，严重影响了DNA的浓度。而在一些植物中，多糖多酚类物质的含量高，在针对这些植物基因组DNA的提取过程中，传统DNA提取方法多糖多酚类物质会一直存续在溶液中，妨碍了DNA提取质量和纯度的提高。

[0006]传统的CTAB提取方法所需要提供的其它各种试剂和作用：Tris-HCl(pH8.0)提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl提供一个高盐环境，使DNA充分溶解，存在于液相中；β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除。

[0007]本实验室在传统的CTAB的DNA提取方法再进行了一些改进。通过比对传统的DNA提取方法，依据我们这些改进的方法，能够较高效的在植物基因组中进行多糖多酚类植物组织材料的DNA提取，对下一步的分子生物学实验非常有帮助。发明内容

[0008]目的是为了提取多糖多酚植物中基因组DNA，通过改进方法和步骤能够高效的通过CTAB方法，获取植物的基因组DNA结果

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附图说明

[0009]为了测定改进后DNA的提取效果，利用超微量分光光度计进行核酸浓度和纯度的检测。举例提取的基因组DNA为玉米，西瓜，葡萄，苹果多糖多酚植物基因组DNA。此样品含有大量的多糖多酚，会经常干扰 DNA的提取效果。

[0010]在超微量分光光度计中测定核酸浓度和比值，得到结果如表。在0.8％的琼脂糖凝胶EB电泳中加入通过传统CTAB方法和改进CTAB方法纯化得到的基因组DNA进行比对电泳，同时点加利用此方法纯化DNA所得到的PCR扩增内参片段的DNA电泳样进行分析判断，结果如图。

[0011]图1为提取DNA电泳图，1原始西瓜DNA提取电泳结果，2原始苹果DNA提取电泳结果，基因组DNA 降解严重，3原始玉米DNA提取电泳结果，4原始葡萄DNA提取电泳结果，5改进西瓜DNA提取电泳结果， 6改进苹果DNA提取电泳结果，7改进玉米DNA提取电泳结果，8改进葡萄DNA提取电泳结果。比对传统的CTAB多糖多酚植物基因组DNA的提取方法，改进后的CTAB提取方法，能够极大的增加植物DNA提取时的获得率。其获得DNA的量，还有纯度都有很大的提高。

[0012]提取DNA OD值表

[0013]

具体实施方式

[0014]我们推荐的方法步骤：[0015]提取之前，将碱性氧化铝称取5克，置于一个5ml过滤式亲和离心柱中。提取时，称取2g左右的多糖多酚植物样品，置于预冷的离心管中，加入液氮混合石英砂少许快速匀浆碾磨成粉。使用用乙醇70％的乙醇配制的聚乙烯吡咯烷酮PVP K-90 25％溶液，将其加入CTAB缓冲液中预先混合，使得聚乙烯吡咯烷酮 PVP K-90在CTAB缓冲液中的终浓度含量为5％左右。[0016]加入65度的预热的2×CTAB提取缓冲液，不断进行震荡摇动10分钟左右。再加入等体积的氯仿/异戊醇的混合液，颠倒离心管混匀，4度低温下离心12000r/min离心10分钟。转移上层水相到一个充满碱性氧化铝的柱子中，用碱性氧化铝的柱子吸附之前提取的核酸混合液。碱性氧化铝的柱子在吸附核酸前，需要经过3％氯化钙浸泡饱和至少5分钟。然后再加入30％氯化钙冲洗碱性氧化铝的柱子，同时也将核酸溶液冲洗下来。利用微量的分光光度

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计，随时记录每个柱子中的OD值，将最大OD值的管子拿出来下一步使用。碱性氧化铝的柱子不用时，也需要至于3％的叠氮钠中长期保存。

[0017]转移冲洗后的过滤液体到新的离心管中，加入一倍体积的异丙醇混匀，室温下放置30分钟。然后再将混合液4000r/min离心5-10min，去上清，这时候会有沉淀形成。将得到的沉淀使用聚乙烯吡咯烷酮PVP K-90 5％清洗一遍，然后4000r/min离心5-10min，去上清。再加70％的乙醇混匀清洗一遍，然后离心 4000r/min离心5min，去除上清乙醇。最后将试管中的留存沉淀风干。风干的溶液加入40μl的TE缓冲液进行保存。[0018]在传统提取的过程中，将PVP K-90在CTAB缓冲液中，能够更好的辅助裂解细胞，得到更好的分散性。将DNA通过一次碱性氧化铝柱，该碱性氧化铝柱可以吸附碱性的核糖核酸，而一般的多糖类物质，不呈现碱性，通过此方法，可以极大量的去除溶液中的多糖类物质，利于下一步的实验纯化。而且，在碱性氧化铝柱子吸附溶液中的核酸的之前，先用3％的氯化钙浸泡柱子，发现能够显著的提高DNA的产量。使用终浓度含有5％的聚乙烯吡咯烷酮PVP K-90的70％乙醇溶液沉淀清洗提取的DNA溶液，可以使得更多的残留多糖多酚类物质在溶液中，而不是最终的沉淀中。

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说　明　书　附　图

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图1

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