第４８卷第６期 南开大学学报（自然科学版） Ａｃｔａ Ｓｃｉｅｎｌｉａｒｕｍ Ｎａｔｕｒａｌｉｕｍ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｔｉｓ Ｎａｎｋａｉｅｎｓｉｓ ２０１５年ｌ２月 Ｖｏ１．４８ Ｎｏ６ Ｄｅｃ．２０１５ 文章编号：０４６５—７９４２（２０１５）０６—００８６～０６ 近红外在线监测谷氨酸脱羧酶酶法转化制备丫．氨基丁酸 陈 龙， 丁国钰， 侯媛媛， 白 钢 （南开大学药学院，天津３０００７１） 摘要：以Ｌ一谷氨酸（Ｌ—Ｇｌｕ）为底物经谷氨酸脱羧酶（ＧＡＤ）酶法转化制备丫一氨基丁酸（ ～ＧＡＢＡ），经固定 化后的ＧＡＤ可以连续使用．为了在线监测酶促转化反应过程，引入近红外光谱分析技术（ＮＩＲＳ）结合最小偏二 乘法（ＰＬＳ）建立定量分析模型，对ＧＡＤ酶法转化制备 —ＧＡＢＡ的过程进行在线监测．建模所使用的数据来自４ 个批次发酵过程不同时间收集得到的１４８个样品，其中３组数据用于建模，组内数据用于内部验证，最后ｌ组数据 用于外部验证．采用ＯＰＵＳ ７．０处理数据优化模型，结果显示，选用一阶导数光谱预处理方法，当选定波长为 １５６７～１７８９ ｎｍ时，对于Ｌ—Ｇｌｕ外部验证的预测标准偏差为１．７０ ｇ／Ｌ，决定系数为９５．６７；对于７－ＧＡＢＡ外部验 证的预测标准偏差为５．１４ ｇ／Ｌ，决定系数为８６．３２．实验表明建立的Ｌ－Ｇｌｕ和７－ＧＡＢＡ多元校准模型可用于预测 监控酶促转化过程中底物与产物的相对含量的变化，从而为ＧＡＤ酶法转化制备７－ＧＡＢＡ的生产在线监控提供 理论基础． 关键词：近红外光谱；固定化酶；谷氨酸脱羧酶；．ｙ－氨基丁酸；Ｌ－谷氨酸 中图分类号：Ｑ９３９．９７ 文献标识码：Ａ ０ 引言 Ｙ一氨基丁酸（ 一ＧＡＢＡ）是一种存在于自然界中，并被广泛用于药品和食品的氨基酸 ，由于７一 ＧＡＢＡ需求的增加，对其进行了广泛的生产研究，目的在于缩短成本和增加生产速度，谷氨酸是经微生物 发酵生产的大宗发酵产品，也是微生物发酵产业中的重要原料，从＿Ｔ业和经济的角度来看，采用谷氨酸生 物发酵的方法生成７－ＧＡＢＡ是完全合理和有价值的．由磷酸吡哆醛（Ｐｈｏｓｐｈｏｐｙｒｉｄｏｘａｌ，ＰＩ Ｐ）依赖的 氨酸脱羧酶（ＧＡＤ，ＥＣ ４．１．１．１５）可以不可逆地催化Ｌ一谷氨酸（Ｌ—Ｇｌｕ）释放ＣＯ 产生 —ＧＡＢＡ，这种催化 反应广泛的分 图１酶促反应原理图 Ｆｉｇ．１ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ ｏｆ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｒｅａｃｔｉｏｎ 为了提高转化率，改进生物反应器生产效率，目前采用多种方法监测和控制发酵过程 ．实时地获得 底物浓度，产品浓度，以及产生的副产品是非常重要的．传统技术，如气相色谱、液相色谱和传感器的发酵 过程可以用于分析样品，然而，这些技术费钱费时，无法实现在线监控的目的．近红外（Ｎｅａｒ ｉｎｆｒａｒｅｄ， ＮＩＲ）区域是介于可见光和红外区之间的电磁频谱区，波长范围为７００～２ ５００ ｎｍ Ｉｓ］．ＮＩＲ区域主要反映ｒ 中红外区域含Ｈ基团的倍频和组合频吸收，因此，这一波段非常适合有机化合物的理化参数测定，可以用 来进行定性定量分析 ］．过去的３０年中，ＮＩＲＳ已被广泛应用于许多领域，如食品 ］，制药 ，石化，矿业和生 物产业．ＮＩＲＳ与多元校正技术相结合，成为一种快速，简单的，非破坏性的，价格低廉，环保安全的检测技 收稿日期：２０１５－０４－１３ 作者简介：陈龙（１９８８～），男，河北廊坊人，硕士． 通讯作者：白钢（１９６７一），男，辽宁沈阳人，教授，研究方向：系统生物学与化学生物学．Ｅｍａｉｈ ｇａｎｇｂａｉ＠ｎａｎｋａｉ．ｅｄｕ．ＣＩＩ 第６期 陈龙等：近红外在线监测谷氨酸脱羧酶酶法转化制备Ｙ一氨基丁酸 ・８７・ 术，样品中的各个组分无需预处理即可精确的测定含量，并广泛应用于固态和液态样品 ．研究采用ＮＩＲＳ 技术对谷氨酸酶法制备７一ＧＡＢＡ的过程进行监控，旨在实现其生产过程的在线监控及智能． １材料与方法 １．１菌种与培养基 大肠杆菌ＢＬ２ｌ（ＤＥ３）一ｐｅｔ３５ｂ—ＧＡＤＢ，能够诱导得到含有ＣＢＤ（纤维素结合蛋白）标签的ＧＡＤ，该菌 株是实验室早期获得并保存，培养和诱导培养基均为ＬＢ培养基． １．２仪器与试剂 近红外光谱分析仪（ＴＥＮＳＯＲ３７，德国Ｂｒｕｋｅｒ公司）；Ｍｉｌｌｉ—Ｑ纯化水系统（美国Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ公司）；ＳＢＡ－ ４０Ｅ生物反应器（山东省科学院生物研究所）；高效液相色谱仪（ＬＣ～２０ＡＴ，日本Ｓｈｉｍａｄｚｕ公司）；ＫＱ－ ５００Ｅ超声波处理器（昆山超声设备有限公司）． Ｌ－Ｇｌｕ、ＰＬＰ、７一ＧＡＢＡ、巯基乙醇、邻苯二甲醛（Ｓｉｇｍａ—Ａｌｄｒｉｃｈ公司），乙腈、甲醇（色谱纯，天津市康科 德科技有限公司），其它试剂（分析纯，天津北方天医化学试剂厂）． １．３固定化酶的诱导和固定化处理 接种菌株到５ ｍＬ ＬＢ（含０．０５ ｍｇ／ｍＬ卡那霉素）培养基中，３７℃、２００ ｒ／ｍｉｎ，培养１２ ｈ，按照ｌ％接种 量接种到新鲜ＬＢ培养基中，３７ ｏｃ、２００ ｒ／ｍｉｎ，培养２ ｈ，ＯＤ 。。为０．６—０．８时，加入终浓度为０．５ ｍｍｏｌ ＩＰＴＧ，２８℃，２００ ｒ／ｍｉｎ，诱导４ ｈ．离心（６ ０００ ｒ／ｍｉｎ，４℃，５ ｍｉｎ）收集菌体，用磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ，ｐＨ ７．３）漂洗３次，并于－２０℃保存备用． 将２．５ ｇ的脱脂棉加到５０ ｍＬ的０．３ ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＩＯ 溶液中，置于３０℃避光反应８ ｈ，用５Ｏ ｍＬ冰 水洗涤３～５次，除去ＮａｌＯ ，加入２５ ｍＬ １００ ｇ／Ｌ ＢＬ２１－ｐｅｔ３５ｂ－ＧＡＤ超声破壁蛋白，４℃，振荡过夜，挤 出多余液体． １．４采样和分析方法 配制２００ ｍＬ，１００ ｇ／Ｌ谷氨酸溶液，１０ ｍｇ／Ｌ ＰＬＰ，按照图２方法与固定化酶连接，当固定化酶被 浸润后，立即取样（１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ，４℃，１ ｍｉｎ），０—３５０ ｍｉｎ每２０ ｍｉｎ取样一次，３６０～５４０ ｍｉｎ，每１０ ｍｉｎ取样一次，采用近红外光谱扫描样品采集原始数据，如图３，并用ＳＢＡ－４０Ｅ生物反应器测定Ｌ—Ｇｌｕ含 量，连续取样３７次，连续做４组监测反应过程． ＨＰＬＣ检测条件：Ａ相：配置Ｏ．０１ ｍｏｌ乙酸钠水溶液，甲酸调节ｐＨ至７．２；Ｂ相：乙酸钠水溶液：乙腈：甲醇： ｌ：２：２；衍生化试剂：称取邻苯二甲醛０．１ ｇ，加人１３０ ２Ｏ ，检测波长：３３８ ｎｎｌ，色谱条件如表１． 采用柱前衍生化法测定样本中的氨基酸含量：２Ｏ 酸缓冲液，静置２ ｍｉｎ后进样测定． １．５近红外光谱的采集和预处理 巯基乙醇甲醇定容至１０ ｍＬ． 色谱柱：Ａｇｉｌｅｎｔ ＳＢ－Ｃ 柱（２５０ ｍｍｘ４．６ ｍｉｌｌ，５ ｇｍ），柱温４０℃，流速１．０ ｍＬ／ｍｉｎ，进样体积： 样品加人６０ 衍生化试剂，再加入１２０ ＩａＬ硼 采用布鲁克近红外光谱分析仪对上述样本进行光谱采集，以空气为参比，每个样品平行测定３次取平 均光谱，仪器参数设置为：分辨率８ ｃｍ～，扫描３２次，扫描光谱范围：４ ０００～１２ ０００ ｃｍ，光程：２ ｍｍ． 实验中采用多种光谱预处理方法，一阶导数、二阶导数、矢量归一化、多元散射校正、一阶导数结合矢 量归一化、一阶导数结合多元散射校正 １．６多元校正模型的建立 多元校正已广泛应用于光谱分析，ＰＬＳ（偏最小二乘回归）是一种常用的近红外光谱数据的定量分析 的多元校正方法．建立ＰＬＳ模型，将４组样本数据分为内部建模集（２组），内部验证集（１组）和外部验证 集（１组），采用ｏＰＵＳ ７．０软件建立并优化模型，为了达到最佳的预测效果，使用ＯＰＵＳ７．０软件对光谱预 处理方法，最适主因子数，波数段进行了自动优化建模． 第６期 陈龙等：近红外在线监测谷氨酸脱羧酶酶法转化制备 一氨基丁酸 ・８９・ 左右时保持饱浓度不变，在３８０ ｍｉｎ左右其浓度开始逐渐下降，４００ ｍｉｎ后其浓度下降较快，此时溶液底部 无Ｌ—Ｇｌｕ沉淀，５００ ｒａｉｎＪ￣：Ｌ－Ｇｌｕ完全反应，７－ＧＡＢＡ在酶促反应过程中，含量逐渐增加，５００ ｍｉｎ后，反 应基本终止，７－ＧＡＢＡ浓度不在增加约为７０ ｇ／Ｌ与理论值相符，详见图８． ５００ ４００ ：Ｇ ＬＢＡ Ｌ—Ｇ ３ＯＯ 墨２００ ：ｌｏｏ ． ｌ 。 。 Ｏ ０ ２ ４ ６ ８ １０ １２ １４ １６ １８ ２０ 时间／ｈ ＧＡＢＡ／（ｇ．１ ） ａ：ｖ—ＧＡＢＡ ｓｔａｎｄａｒｄ：ｂ：ｓａｍｐｌｅ 图５ Ｙ－ＧＡＢＡ标准曲线 圈４样品和ｙ－・ＧＡＢＡ标准品的ＨＰＬＣ色图谱 Ｆｉｇ．５ Ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｒｖｅ ｏｆｖ－ＧＡＢＡ Ｆｉｇ．４． ＨＰＬＣ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ ｏｆ ｓａｍｐｌｅ ａｎｄ ａｎｄ Ｔ－ＧＡＢＡ ｓｔａｎｄａｒｄ 表２ Ｌ－－Ｇｉｕ和ＧＡＢＡ多元校准模型参数 Ｔａｂｌｅ ２ Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｏｆ ＰＬＳ－．ｍｏｄｅｌ ２．４监测固定化酶的酶促反应过程 监测固定化酶的酶促反应过程如图９发现，第一批样品在１２ ｈ内反应结束，第二批样品在１６ ｈ内反 应结束，在第３６ ｈ后，酶活下降明显，需要添加新的固定化酶，以保证反应较快的进行． ３讨论 Ｌ－Ｇｌｕ在水中的溶解度为１０ ｇ／Ｌ左右，本研究采用高浓度底物（１００ ｇ／Ｌ），在反应过程中增加的ｐＨ 值可以通过新溶解的Ｌ－Ｇｌｕ抵消，使反应得以继续进行，从而提高７－ＧＡＢＡ的生产力，降低生产成本。研 究发现，在相当长时间内，Ｌ－Ｇｌｕ处于饱和浓度水平保持不变，而 一ＧＡＢＡ呈不断增长趋势，曲线斜率变 化不大，表示酶活变化不大，说明以Ｌ—Ｇｌｕ为底物制备 —ＧＡＢＡ可以省略以谷氨酸钠为底物不断调整ｐＨ 的步骤，这使微生物发酵产生７－ＧＡＢＡ更加简单化实用化．传统的细菌载体与Ｌ－Ｇｌｕ混合在一起，不易监 测反应过程，确定反应结束时间而且 ＧＡＢＡ与菌种的分离过程繁琐，不利于产物的纯化 ．采用大肠杆 菌ＢＬ２１（ＤＥ３）－ｐｅｔ３５ｂ ＧＡＤ［￣产生具有ＣＢＤ（纤维素结合蛋白）标签的ＧＡＤ能固定在脱脂棉上构成固 定化酶，固定化ＧＡＤ不但能高效催化谷氨酸生成７一ＧＡＢＡ还能使发酵液在反应过程中保持澄清，方便检 测反应过程和产物的分离纯化． ＧＡＤ催化Ｌ—Ｇｌｕ脱掉羧基，羧基的Ｃ＝Ｏ紫外最大吸收峰在１ ７００ ｎｍ左右，又由于氢键由于氢键的 影响，吸收位置向低波数位移，这与优化波段１ ５６７—１ ７８９ ｎｍ相符．本研究采用ＮＩＲＳ采集样品，建立多 ・９０・ 南开大学学报（自然科学版） 第４８卷 元校正模型定量分析ＧＡＤ催化Ｌ－Ｇｌｕ发酵过程中Ｌ－Ｇｌｕ和７－ＧＡＢＡ的浓度，此外，通过内部验证和外部 验证检验预测模型的稳定性，各项参数均显示良好，并且利用多元校正模型监测发酵过程中发酵液的组成 成功预测发酵终止时间和更换固定化酶柱子的时间，其结果对工业 —ＧＡＢＡ生产发酵的过程控制具有重 要意义． 生物反应器中底物浓度的监测，目标产物的生成，是Ｌ－Ｇｌｕ发酵生成７－ＧＡＢＡ质量监控的重要监测 指标，ＮＩＲＳ在线监测提供了一种直接、便捷、快速的监测分析方法，可以随时监测发酵过程中各个组分的 含量变化．采用近红外光谱结合ＰＬＳ模型进行监测发酵液中Ｌ－Ｇｌｕ和７－ＧＡＢＡ的浓度，构建模型显示良 好的相关性和较低的预测误差，表明在温度稳定条件下，ＮＩＲＳ能够较好的预测谷氨酸发酵过程中各组分 的含量变化．固定化ＧＡＤ可以简化分离和纯化的７－ＧＡＢＡ的工艺降、低运营成本，ＮＩＲＳ可以在线确定底 物和终产物的浓度，进而用来控制和实时优化发酵过程，使 —ＧＡＢＡ￣产过程更加经济环保． 维数 ａ：Ｌ（ ｌｕ：｝）：Ｙ—ＧＡＢＡ 维数 图６维数与ＲＭＳＲＰ和ＲＭＳＥＥ关系曲线 Ｆｉｇ．６ Ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ＲＭＳＲＰ、ＲＭＳＥＥ ａｎｄ ｄｉｍｅｎｓｉｏｎｓ ａ：，Ｊ—Ｇｌｕ； ｂ：Ｙ—ＧＡＢＡ 图７红外光谱预测值与测定值的相关图 Ｆｉｇ．７ Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＮＩＲＳ ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ａｎｄ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｖａｌｕｅｓ ８（） ７（） ６（）， ５（） ４０ ：５ｏ薯 ２ｏ １（） ０ ０ １００ ２００ ３００ ４００ ５００ 时间，ｈ 时间／ｍｉｌｌ 图８酶促反应过程曲线 Ｆｉｇ．８ Ｔｈｅ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｒｅａｃｔｉｏｎ 图９酶连续反应过程曲线 Ｆｉｇ．９ Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆｓ ｔｕｂｅ ｏｆｅｎｚｙｍｅ 参考文献 １ Ｋａｎｇ Ｙ Ｍ，Ｑｉａｎ Ｚ Ｊ，Ｌｅｅ Ｂ Ｊ，ｅｔ ａ１．Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ＧＡＢＡ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ ｓｅａ ｔａｎｇｌｅ ａｇａｉｎｓｔ ｅｔｈａｎｉｎ ｄｕｃｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｉｎ ＨｅｐＧ２ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇ，２０１１，１６（５）：９６６—９７０， ２ Ｊｉ Ｙ Ｐ，Ｓｅｏｎ Ｊｕ Ｊ，Ｊｅｏｎｇ Ｈ Ｋ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｄｅｃｒｂｏｘｙｌａａｓｅ（ＧＡＤ）ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｚｙｍａｅ［Ｊ］．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２０１４，３６（９）：１ ７９１一ｌ ７９９． 第６期 陈龙等：近红外在线监测谷氨酸脱羧酶酶法转化制备７一氨基丁酸 ・９ｌ ・ ３ Ａｍｉｎ Ｇ，Ｓｈａｈａｂｙ Ａ，Ａｌｌａｈ Ａ Ｍ．Ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ｂｙｐｒｏｄｕｃｔ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｂｙ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｃｅｉｌｓ ｏｆ ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ［Ｊ］．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｌｅｔｔ，１９９３，１５（１１）：１ １２３－１ １２８． ４ Ｍａｃａｌｏｎｅｙ Ｇ，Ｄｒａｐｅｒ Ｉ，Ｐｒｅｓｔｏｎ Ｊ，ｅｔ ａ１．Ａｔ—ｌｉｎｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ ｆａｕｌｔ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ａｎ ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ｈｉｇｈ ｃｅｌｌ ｄｅｎｓｉｔｙ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ，ｕｓｉｎｇ ＮＩＲ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ［Ｊ］．Ｆｏｏｄ Ｂｉｏｐｒｏｄ Ｐｒｏｃｅｓｓ，１９９６，７４（４）：２１２—２２０． ５ Ｓｍｙｔｈ Ｈ Ｅ，Ｃｏｚｚｏｌｉｎｏ Ｄ，Ｃｙｎｋａｒ Ｗ Ｕ，ｅｔ ａ１．Ｎｅａｒ ｉｎｆｒａｒｅｄ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ａｓ ａ ｒａｐｉｄ ｔｏｏｌ ｔｏ ｍｅａｓｕｒｅ ｖｏｌａｔｉｌｅ－ ｒａｏｍａ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｉｎ Ｒｉｅｓｌｉｎｇ ｗｉｎｅ：ｐｏｓｓｉｂｉｌｉｔｉｅｓ ａｎｄ ｌｉｍｉｔｓ［Ｊ］．Ａｎａｌ Ｂｉｏａｎａｌ Ｃｈｅｍ，２００８，３９０（７）：１ ９１１－１ ９１６． ６ Ｍａｒｚｅｎａ Ｊ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｎｅａｒ—ｉｎｆｒｒａｅｄ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ｉｎ ｔｈｅ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒ ｍａ— ｃｅｕｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ，２０１２，６６：１－１０． ７ Ｎｉｃｏｌａｉ Ｂ Ｍ，Ｂｅｕｌｌｅｎｓ Ｋ，Ｂｏｂｅｌｙｎ Ｅ，ｅｔ ａ１．Ｎｏｎｄｅｓｔｒｕｃｔｉｖｅ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｆｒｕｉｔ ａｎｄ ｖｅｇｅｔａｂｌｅ ｑｕａｌｉｔｙ ｂｙ ｍｅａｎｓ ｏｆ ＮＩＲ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：Ａ ｒｅｖｉｅｗ［Ｊ］．Ｐｏｓｔｈａｒｖｅｓｔ Ｂｉｏｌ Ｔｅｃ，２００７，４６（２）：９９—１１８． ８ Ａｍｉｇｏ Ｊ Ｍ，Ｃｒｕｚ Ｊ，Ｂａｕｔｉｓｔａ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｓａｍｐｌｅｓ ｂｙ ＮＩＲ ｃｈｅｍｉｃａｌ—ｉｍａｇｅ ａｎｄ ｍｕｌｔｉｖａｒｉ～ ａｔｅ ａｎａｌｙｓｉｓ［Ｊ］．Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００８，２７（８）：６９６—７１３． ９ Ｚｈａｎｇ Ｍ Ｌ，Ｓｈｅｎｇ Ｇ Ｐ，Ｍｕ Ｙ，ｅｔ ａ１．Ｒａｐｉｄ ａｎｄ ａｃｃｕｒａｔｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ＶＦＡｓ ａｎｄ ｅｔｈａｎｏｌ ｉｎ ｔｈｅ ｅｆｆｌｕｅｎｔ ｏｆ ａｎ ａｎａｅｒｏｂｉｃ Ｈ２－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ ｕｓｉｎｇ ｎｅａｒｉｎｆｆｒａｅｄ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ［Ｊ］．Ｗａｔｅｒ Ｒｅｓ，２００９，４３（７）：１ ８２３—１ ８３０． １０ ＬａｍｍｅｎｓＴＭ，Ｄｅ Ｂ Ｄ，Ｆｒａｎｓｓｅｎ ＭＣＲ，ｅｔ ａ１．Ｔｈｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ ｏ【～ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｖａｌｏｒｉｚａ－ ｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ［Ｊ］．Ｇｒｅｅｎ Ｃｈｅｍ，２００９，１１（１０）：１ ５６２—１ ５６７． Ｏｎｌｉｎｅ Ｎｅａｒ—ｉｎｆｌａｒｅｄ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ｆｏｒ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ Ｇｌｕｔａｍｉｃ Ａｃｉｄ Ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｉｎｔｏ ＧＡＢＡ Ｃｈｅｎ Ｌｏｎｇ，Ｄｉｎｇ Ｇｕｏｙｕ，Ｈｏｕ Ｙｕａｎｙｕａｎ， Ｂａｉ Ｇａｎｇ （Ｃｏｌｌｏｇｅ ｏｆＰｈａｒｍａｃｙ，ＮａｎＫａｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔｉａｎｊｉｎ ３０００７１，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｐｕｒｐｏｓｅ ｏｆ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ｗａｓ ｔｏ ｄｅｖｅｌｏｐ ｍｏｄｅｌｓ ｆｏｒ ＮＩＲＳ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｔｈａｔ ｗａｓ ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｉｎｔｏ ７－ＧＡＢＡ ｂｙ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ，Ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｙ ｉｍｍｏｂｉ－ ｌｉｚｅｄ ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｕｓｅｄ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｌｙ ｆｏｒ ｔｗｏ ｔｉｍｅｓ．Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ａｃｈｉｅｖｅ ｔｈｅ ｏｎ－ ｌｉｎｅ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｏｆ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ，ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ ｔｈｅ ｎｅａｒ ｉｎｆｒｒａｅｄ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ（ＮＩＲＳ）ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｐａｒｔｉａｌ ｌｅａｓｔ ｓｑｕａｒｅｓ（ＰＬＳ）ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ｔｈｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｍｏｄｅｌｓ ｔｏ ｍｏｎｉｔｏｒ ｔｈｅ ｐｒｏ— ｃｅｓｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ７－ＧＡＢＡ ｂｙ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ．Ｔｈｅ ｄａｔａ ｆｏｒ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｍｏｄｅｌｓ ｃｏｌｌｅｃｔｉｎｇ ｆｒｏｍ ４ ｂａｔｃｈｅｓ ｏｆ １４８ ｓａｍｐｌｅｓ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ．Ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ ｇｒｏｕｐｓ ｏｆ ｄａｔａ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｍｏｄ— ｅｌｉｎｇ，ｄａｔａ ｉｎ ｔｈｅ ｇｒｏｕｐ ｗａｓ ｆｏｒ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ，ｔｈｅ ｌａｓｔ ｄａｔａ ｗａｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｘｔｅｒｎａｌ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ．Ｕｓｉｎｇ ＯＰＵＳ ７．０ ｄｅａｌｅｄ ｗｉｔｈ ｄａｔａ ａｎｄ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｔｈｅ ｍｏｄｅ１．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｍｏｄｅｌ ｗｅｒｅ ｇｏｏｄ ａｃｃｕ— ｒａｃｙ ａｎｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｗａｖｅ ｎｕｍｂｅｒ １ ５６７～１ ７８９ ｎｍ ａｆｔｅｒ ｆｉｒｓｔ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｔｈｅ ｓｔａｎｄａｒｄ ｅｒｒｏｒｓ ｏｆ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｆｏｒ １．７０ ｇ／Ｌ，ｔｈｅ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｏｆ ｄｅｔｅｍｒｉｎａｔｉｏｎ（Ｒ ）ｗａｓ ９５．６７ ｉｎ Ｌ—Ｇｌｕ ｅｘｔｅｍａｌ ｖａｌｉｄａ－ ｔｉｏｎ；Ｔｈｅ ｓｔａｎｄａｒｄ ｅｒｒｏｒｓ ｏｆ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ５．１４ ｇ／Ｌ，ｔｈｅ ｃｏｅｆｉｆｃｉｅｎｔ ｏｆ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ（Ｒ。）ｗａｓ ８６．３２ ｉｎ Ｌ— Ｇｌｕ ｅｘｔｅｍａｌ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ＮＩＲＳ ｃａｎ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｎｌｉｎｅ，ｔｈａｔ ｃａｎ ｐｒｏｖｉｄｉｎｇ ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ｃｏｎｔｒｏｌｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｎｅａｒ ｉｎｆｒａｒｅｄ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ；ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ；ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ；７－ＧＡＢＡ；Ｌ——Ｇｌｕ
