土壤中产淀粉酶菌株的分离、鉴定与纯化

土壤中产淀粉酶菌株的分离、纯化鉴定及高活力淀粉酶菌株的筛选

一、实验原理

培养基是供微生物生长、繁殖、代谢的混合养料。由于微生物具有不同的营养类型，对营养物质的要求也各不相同。但从营养角度分析，培养基中一般含有微生物所需的C源、N源、无机盐、生长因子以及水等。从混杂微生物群体中获得只含某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离纯化。平板分离法普遍适用于微生物的分离与纯化，其基本原理是选择适合于待分离微生物的生长条件，或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其它微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。

稀释涂布法或平板法时常用的分离与纯化的方法，以淀粉作为惟一碳源的培养基培养未分离细菌，能产淀粉酶的细菌能生长，且菌落周围出现透明圈（淀粉不透明，被消化后变透明），则产淀粉酶微生物被分离出来。本实验采用透明圈检验法检测培养物中是否有产淀粉酶微生物的生长。

二、分离及纯化

1、材料

试剂:营养琼脂、淀粉 、土壤、碘液等

器皿：移液管、培养皿、试管、三角瓶、量筒、 酒精灯、接种环等

仪器：高压蒸汽灭菌锅、恒温培养箱

其他：报纸、纱布、棉花、面线绳

2、方法

2.1培养基与器皿的准备和灭菌

（1）培养基的配制

称量1.2克淀粉。加少量水加热溶化，然后加入6.8克营养琼脂，加水至150毫升，煮沸后倒入250ml容量的三角瓶中，加棉塞后放入高温蒸汽灭菌锅内灭菌备用。

（2）无菌水的制备

分别取9ml蒸馏水加入5支试管中，加塞后用报纸包扎捆绑，放入高压蒸汽灭菌锅灭菌备用。取90ml蒸馏水加入250ml三角瓶中，同样的操作，灭菌备用。

（3）器皿的准备

将刻度吸管用报纸包扎，培养皿装入专用灭菌杯分别放入高温灭菌箱灭菌备用。

2.2菌悬液的制备和梯度稀释

取10g土壤样品加入90ml无菌水中震荡, 然后静置2分钟。

取六只试管编号1—6分别加入9ml无菌水，从菌悬液中取1ml上清液加入1号管后震荡摇匀，然后再从1号管中取1ml加入2号管震荡摇匀，依次操作六个试管，得到10¯

1—10¯6六个稀释度的菌悬液。

2.3稀释混合倒平板法分离产淀粉酶细菌

取1ml稀释度为10¯4菌悬液倒入平皿，然后加入适量的经过融化的培养基，摇匀冷却，标记后倒扣放入恒温培养箱37°C恒温培养24-48小时。依次对10¯5、10¯6两稀释度的菌悬液进行上述操作。

再将10¯4、10¯5、10¯6三个稀释度的试管放入沸水浴3分钟。分别从三支试管取经过沸水浴的菌悬液1ml注入培养皿，然后加入适量的经过融化的培养基，摇匀冷却标记后，倒扣放入恒温培养箱，同条件培养。

培养24-48小时后取出培养皿，先进行各梯度菌落的计数，然后加入少量碘液，进行淀粉酶菌落的计数。

三、鉴定

1.制备培养基

制备固体淀粉培养基，葡萄糖发酵培养基，乳糖培养基（内装有倒置的德汉氏小管），蛋白胨水培养基，葡萄糖蛋白胨水培养基，

2.淀粉水解试验

1.将固体淀粉培养基熔化后冷却至50℃左右，无菌操作制成平板。

2将分离出来的产淀粉酶菌株接种到平板上并记号。

3将平板倒置在37℃温箱中培养48h。

4观察各种细菌的生长情况，打开平板盖子，滴入少量卢氏碘液于平板中，轻轻旋转平板，使碘液均匀铺满整个平板。如菌苔周围出现无色透明圈，说明淀粉已被水解，为阳性。透明圈的大小可初步判断该菌水解淀粉能力的强弱，即产生胞外淀粉酶活力的高低。

3糖发酵试验

1用记号笔在各试管外壁上分别标明发酵培养基的名称和所接种的细菌菌名。

2取葡萄糖发酵培养基试管2支，接入已分离的菌株，第2支不接种，作为对照。另取乳糖发酵培养基试管2支，同样接入已分离的菌株，第2支不接种，作为对照。在接种后，轻缓摇动试管，使均匀，防止倒置的小管进入气泡。

3将接过种和作为对照的4支试管均置37℃中培养48h。

4观察各试管颜色变化及徳汉氏小管中有无气泡。

4吲哚试验

1用接种针将已分离的菌株接入2支蛋白胨水培养基中，置37℃中培养48h。

2于培养48h后的蛋白胨水培养基内加入3~4滴乙醚，摇动数次，静置1min，待乙醚上升后，沿试管壁徐徐加入2滴吲哚试剂。在乙醚和培养物之间产生红色环状物为阳性

反应。

5甲基红试验

1用接种针将已分离的菌种接入2支葡萄糖蛋白胨水培养基中，置37℃中培养48h。

2培养48h后，将1支葡萄糖蛋白胨水培养基培养物内加入甲基红试剂2滴，培养基变为红色者为阳性，变为黄色者为阴性。