间充质干细胞和淋巴细胞分泌细胞因子的抗衰老功效研究

间充质干细胞和淋巴细胞分泌细胞因子的抗衰老功效研究闵 倩1，陈雪梅1，苗 瀛2，吴滌梵2，徐 荻1（1.上海荟苒生物科技有限公司，上海，200333；2.上海宇研生物技术有限公司，上海，200333） 【摘 要】 目的 探索体外扩增培养的间充质干细胞和淋巴细胞分泌的天然细胞因子对皮肤的抗衰老功效。方法 从健康产妇羊膜和新生儿脐带血单个核细胞分别提取扩增间充质干细胞和淋巴细胞，分别制备含人天然细胞因子的细胞提取物。检测提取物中碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、转化生长因子（TGF-β1）、干细胞因子（SCF）、γ干扰素（IFN-γ）含量和这两种提取物对人皮肤成纤维细胞（HFF-1）的促增殖活性以及促胶原蛋白合成能力。结果 两种细胞提取物中bFGF含量在20pg/mL左右，淋巴细胞提取物中TGF-β1及SCF含量在20pg/mL以上、IFN-γ含量在80pg/mL以上；间充质干细胞提取物中TGF-β1含量在10pg/mL左右，SCF含量在40pg/mL左右、IFN-γ含量在60pg/mL左右。两种细胞提取物均对体外培养的HFF-1细胞有明显促增殖作用，并能促进胶原蛋白的合成。结论 羊膜间充质干细胞提取物和淋巴细胞提取物均对皮肤细胞有抗衰老功效，bFGF、TGF-β1等细胞因子的含量检测及对体外培养的HFF-1促增殖实验可作为细胞提取物中细胞因子的活性评估指标。 【关键词】细胞因子；淋巴细胞；间充质干细胞；皮肤成纤维细胞 DOI:10.19593/j.issn.2095-0721.2018.07.026Anti-aging effects of cytokines secreted by mesenchymal stem cells and lymphocytesMIN Qian1, CHEN Xuemei1, MIAO Ying2, WU Difan2, XU Di1(1.Shanghai Huiran Biotechnology Co., Ltd., Shanghai City , 200333, China; 2.Shanghai Yuyan Biotechnology Co., Ltd.,Shanghai City , 200333, China) [ABSTRACT] Objective To explore the anti-aging effects on skin of natural cytokines secreted by mesenchymal stem cellsand lymphocytes cultured in vitro. Methods Amniotic mesenchymal stem cells and lymphocytes were extracted from neonatal amnion and neonatal peripheral blood mononuclear cellsand cell extracts containing human natural cytokines were prepared. The contents of bFGF, TGF-β1, SCF, IFN-γin thecell extracts were detected and their proliferative activity on HFF-1 cell and their collagen-promoting ability were examined. Results The level of bFGF in the two cell extracts was about 20pg/mL, the one of SCF in lymphocyte extracts was above 20pg/mL, and the one of IFN-γ was above 80pg/mL. The level of TGF-β1, SCF and IFN-γ in mesenchymal stem cell extracts was about 10 pg/mL, 40 pg/mL, and 60 pg/mL. The two kinds of cell extracts can promote the proliferation of HFF-1 cells cultured in vitro and promote the synthesis of collagen. Conclusion Both amniotic mesenchymal stem cell extracts and lymphocyte extracts have anti-aging effects on skin. The detection of cytokine levels such as bFGF and TGF-β1 and proliferation experiments of HFF-1 cells cultured in vitro can be used as an indicator of cytokines activity in cell extracts. [KEY WORDS] cytokines; lymphocyte; amniotic mesenchymal stem cells; HFF-1 cell 干细胞可以分泌大量的细胞因子，如血管内皮 机体内细胞因子的主要分泌细胞是淋巴细胞，生长因子（VEGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）、细胞因子除了对自身细胞发挥调节作用外，还对邻干细胞生长因子（SCF）等，这些因子具有对抗氧近的细胞以及远处的细胞发挥旁分泌和内分泌调节化应激、修复创伤、调节皮肤色素代谢等作用[1-4]，作用，在促进皮肤创伤修复方面已有深入研究[7]。同时干细胞可以通过旁分泌和细胞接触调节皮肤真人体天然分泌的细胞因子已发现的达上百种，相互皮干细胞的分化[5]，因此干细胞分泌产物具有抗衰协同发挥作用，如表皮细胞生长因子（EGF）、血老和美容护肤作用[6]。管内皮细胞生长因子（VEGF）、酸性和碱性成纤维细胞生长因子（aFGF、bFGF）、神经生长因子（NGF）China Medical Cosmetology Vol.8 No.7(Total No.59)July2018zgylmr.org.cn85

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等生长因子家族成员，可以定向促进各种细胞的生长，促进细胞间基质的形成，促进皮肤损伤组织的修复[8]。TGF-β转化生长因子家族，可促进成纤维细胞等组织细胞的生长，促进细胞外基质如胶原蛋白、纤粘连蛋白的表达[9]。基因重组细胞因子已被作为护肤添加剂使用，如重组EGF、bFGF等，但淋巴细胞分泌的天然细胞因子的皮肤抗衰老作用尚未见报道。 本研究从新生儿脐带血提取单个核细胞扩增的淋巴细胞以及健康产妇羊膜提取扩增的间充质干细胞这两种细胞中分别提取人天然分泌细胞因子，并对其中bFGF等细胞因子含量、促人成纤维细胞（HFF-1）增殖活性、促胶原蛋白合成能力等方面进行了研究和比较，现报告如下。1 材料与方法

1.1材 料

淋巴细胞分离液（GE Health）；bFGF ELISA检测试剂盒（上海鑫乐生物科技有限公司）；TGF-β1 ELISA检测试剂盒（上海鑫乐生物科技有限公司）；IFN-γ ELISA检测试剂盒（上海鑫乐生物科技有限公司）；SCF ELISA检测试剂盒（上海鑫乐生物科技有限公司）；人I型胶原ELISA检测试剂盒（上海酶联生物科技有限公司）；APC-CD105流式抗体（BD Bioscience）；FITC-CD90流式抗体（BD Bioscience）；FITC-HLA-DR流式抗体（BD Bioscience）；GT-T551培养基（TaKaRa）；DMEM/F12培养基（Gibco）；IL-2（上海华新生物高技术有限公司）；Ⅳ型胶原酶（Sigma）；庆大霉素（浙江瑞新药业股份有限公司）；HFF-1细胞（中科院上海生命科学院）；1×PBS溶液（生工，配制灭菌）；通过安全性质检指标的脐带血和人羊膜（取样前与胎盘和羊水提供者签署知情同意书，知情同意书内容经医学伦理委员会认证）1.2实验方法

1.2.1细胞制备 （1）淋巴细胞制备：采集健康产妇的新生儿脐带血，550-600g离心10min分离出上层血浆，56℃灭活后备用。向下层沉淀中加入等体积1×PBS混匀，经人淋巴细胞分离液密度梯度离心从白膜层分离单个核细胞（PBMC），加1×PBS稀释，550g离心10min，弃上清。取PBMC细胞接种到GT-T551无血清培养基，调整细胞浓度为 1×106个/ml，添加 IL-2（200U/ml）和5%脐86

zgylmr.org.cn带血浆，在37℃、5%CO2条件下培养，不同时间收集细胞进行细胞记数，至十八天离心收集培养上清液。（2）人羊膜间充质干细胞制备及鉴定：取健康产妇的胎盘羊膜，无菌剪剪碎，用0.05%胰酶预处理。按比例向羊膜沉淀中加入Ⅳ型胶原酶，混匀，置于水浴恒温振荡器（37℃，75r/min）2小时。待羊膜组织溶解95%以上后终止消化，100 μm细胞筛过滤，390g离心10min。取细胞接种到DMEM/F12完全培养液（含5%FBS+庆大霉素50U/ml），调整细胞浓度为 5×105/ml，在37℃、5%CO2条件下培养。每隔二到三天进行细胞传代并收集第十八天的细胞培养上清。 随机抽取P0-P6代细胞进行流式鉴定，1×106个细胞加入20μL抗体，4℃孵育30 min，用1×PBS溶液洗去多余流式抗体，弃上清，再用300 μL1×PBS溶液重悬细胞，上机检测。1.2.2细胞因子提取 将上述两种培养上清液用1KD超滤膜超滤，去除分子量1000以下的小分子杂质，收集截留液待用，标记为淋巴细胞组和间充质干细胞组。1.2.3 Elisa检测 用ELISA 试剂盒对超滤后的上清液中bFGF、TGF-β、IFN-γ、SCF以及人I型胶原蛋白含量进行定量检测，设置空白孔，标准品孔及样品孔，按试剂盒说明书依次进行上样孵育、洗板、二次孵育、洗板、显色、终止和上机检测操作。以空白孔调零，450nm波长测各孔吸光度，绘制标准曲线以计算样品中bFGF、TGF-β1、IFN-γ、SCF及人I型胶原蛋白含量。1.2.4 HFF-1促增殖实验 将对数生长期的HFF-1细胞（来源于中科院上海生命科学院）用无血清培养基DMEM+丙酮酸钠+青链霉素混合液，调整细胞浓度为4000个/200ul，到96孔板，细胞接种量为4000个/200ul/孔，将细胞提取物按照不同浓度（0%，2%，4%，6%，8%，10%）加到各孔中，设置三复孔，加培养基后培养箱孵育72h观测，加入CCK-8溶液继续培养2 h，酶标仪测定细胞于波长450nm处的吸光度值（OD值），以0%孔为对照孔，计算细胞增殖活性增加百分率。计算公式：（OD实验孔-OD对照孔）/OD对照孔1.2.5统计学方法 每种细胞分别用相同的方法制备三个批次的提取物，采用SPSS 19.0统计学软件进行随机单位组方差分析，两组间比较用t检验。China Medical Cosmetology Vol.8 No.7(Total No.59)July.2018《中国医疗美容》第8卷 第7期（总第59期）2018年7月·基础研究·所有数据均用（x!s）表示，检验水准=0.05。著性（pTGF-β1=0.029，pIFN-γ=0.034），SCF2 结 果含量分别为（21.57±7.62）pg /mL和（38.56±6.08）pg /mL，干细胞提取物中SCF含量显著高于淋巴细2.1人羊膜间充质干细胞表型胞提取物（p=0.043）。（图4） P3代样品细胞高表达CD90，CD105抗体，低表2.3人I型胶原蛋白含量达HLA-DR抗体，符合间充质干细胞的表型特征。（图 淋巴细胞及间充质干细胞提取物中人I型1-3）胶原蛋白含量分别为（37.80±4.48）pg/mL和2.2细胞因子含量（35.93±1.58）pg/mL，两组胶原蛋白含量无明显 淋巴细胞提取物与间充质干细胞提取物中差异（P＞0.05）。bFGF的含量分别为（18.00±2.59）pg /mL和2.4 HFF-1细胞形态观察（16.48±5.04）pg /mL，无明显差异（p=0.68）， 显微镜下观察，未添加细胞活性提取物的人皮TGF-β1含量分别为（19.54±3.33）pg /mL和肤成纤维细胞：细胞数量少，缩短，两头分叉，排（10.07±3.63）pg /mL，IFN-γ含量分别为列紊乱，呈衰老状态（图5左）。添加淋巴细胞提（85.43±13.08）pg /mL和（56.61±7.66）pg /取物和间充值干细胞提取物培养的人皮肤成纤维细mL，统计学分析提示淋巴细胞提取物中TGF-β1与胞，细胞形态细长，排列有序，呈生长活跃年轻态IFN-γ含量均高于干细胞提取物，二者差异有显（图5 中、右）。图1 空白对照 图2.CD90+ /CD105+率84.63% 图3.HLA-DR-率0.21%图4 淋巴细胞及间充质干细胞提取物细胞因子含量对比图China Medical Cosmetology Vol.8 No.7(Total No.59)July2018zgylmr.org.cn87《中国医疗美容》第8卷 第7期（总第59期）2018年7月·基础研究·

2.5促HFF-1 细胞增殖率

2013年美国哈佛大学的Loffredo[15]等科学家 添加细胞提取物后，HFF-1细胞增长率明显提使用老少配的连体共生动物实验，将老年小鼠和高，以2%提取物浓度为参照，当两种细胞提取物年轻小鼠的血液进行互相交换，四周后老年小鼠浓度从2%增加到4%时，HFF-1增殖率变化不显著（P肥大的心脏恢复正常。2015年斯坦福大学Wyss-＞0.05）。HFF-1细胞增殖率从6%开始显著上升Coray[16]教授团队发现在老年小鼠和年轻小鼠经手（P＜0.01）。淋巴细胞提取物对HFF-1细胞的促术缝合连体共生一周后两只小鼠的淋巴细胞发生了进作用略高于干细胞提取物，但两种细胞提取物对交换，淋巴细胞分泌的活性蛋白可以透过血脑屏障HFF-1细胞增殖的促进效果无明显差异（P＞0.05）。进入大脑，并改善老年小鼠的学习能力和睡眠。由3 讨 论此可见，年轻机体的淋巴细胞可以分泌具有抗衰老 作用的细胞活性因子。 皮肤的老化是一个复杂的生物学过程，主要涉 本实验选取新生儿脐带血和健康产妇羊膜分别及真皮层，如基质金属蛋白酶水平增加导致细胞间提取淋巴细胞和间充质干细胞并制备细胞提取物，基质（ECM）胶原蛋白和弹性纤维降解增加，TGF-选择生长因子bFGF、SCF、转化因子TGF-β1、淋1β信号传导障碍导致胶原蛋白合成减少等，此外巴因子IFN-γ为代表性指标，测定细胞提取物中皮下组织血管减少以及结构变化也是皮肤老化的重的细胞因子水平，结果显示，淋巴细胞提取物含有要因素[10,11]，因此通过补充细胞因子激活真皮层更高水平的TGF-β1和IFN-γ，干细胞提取物含细胞活力在皮肤抗衰老领域有很大的潜力。从多种有更高水平的SCF，二者含有相似水平的bFGF。干细胞主要是间充质干细胞获得的细胞培养产物已 对体外培养的HFF-1细胞促增殖以及胶原蛋白被证实具有皮肤抗衰老功效[12,13,14]。合成检测结果证实，淋巴细胞和干细胞提取物均具图5 HFF-1未添加活性提取物培养及添加活性提取物培养形态对比图图6 淋巴细胞及间充质干细胞促HFF-1细胞增殖率对比图88

zgylmr.org.cnChina Medical Cosmetology Vol.8 No.7(Total No.59)July.2018《中国医疗美容》第8卷 第7期（总第59期）2018年7月有显著的促进成纤维细胞增殖和促进胶原蛋白合成能力。 bFGF是一种多功能细胞生长因子，具有调节细胞生长和组织修复作用；干细胞生长因子SCF具有促进各种组织干细胞生长和分化作用；TGF-β1是促进皮肤胶原蛋白合成的重要信号因子；IFN-γ具有免疫调节、抗病毒和抗肿瘤作用，在皮肤病治疗领域，除用于抗病毒和细菌感染等皮肤病外，作为一种强有力的抗纤维化因子也被用于瘢痕疙瘩的治疗[17]。因此本研究提示脐带血来源的淋巴细胞与羊膜间充质干细胞相似，均能分泌丰富的细胞因子，具有显著的皮肤抗衰功效，由于其含有更高水平的TGF-β1和IFN-γ，在抑制炎症、减少瘢痕形成、修复痘印等方面具有更好的美容应用前景。 由于人体细胞分泌的天然细胞因子含量甚微，难以定量检测，本研究以bFGF、TGF-β1等细胞因子含量检测和体外培养 HFF-1细胞促增殖功能检测相结合，提供了一种细胞提取物中细胞因子的活性评估实验方法。 天然细胞分泌的活性蛋白多达数百种，这些活性成分构成复杂的细胞因子网络相互协调发挥保持机体内环境稳定以及抵御疾病的作用，虽然目前的研究还不能鉴定所有的细胞因子作用机制及其如何综合发挥抗衰老效应，但是从人体细胞获取的天然细胞因子在抗衰老领域将比单一的细胞因子有更重要的应用价值。参 考 文 献[1] Horwitz EM, Prather WR. Cytokines as the major mechanism of mesenchymal stem cell clinical activity: expanding the spectrum of cell therapy [J]. Isr Med Assoc, 2009, 11: 209-211. [2] Kim WS, Park BS, Kim HK, et al. Evidence supporting antioxidant action of adipose-derived stem cells: protection of human dermal fibroblasts from oxidative stress [J]. Dermatol Sci, 2008, 49: 133–142.[3] Kim WS, Park SH, Ahn SJ, et al. Whitening effect of adipose-derived stem cells: a critical role of TGF-beta 1 [J]. Biol Pharm Bull, 2008, 31: 606–610.[4] Liu Q, Luo Z, He S, et al. Conditioned serum-free medium from umbilical cord mesenchymal stem cells has anti-photoaging properties [J]. Biotechnol Lett, 2013, 35: 1707–1714. [5] Zouboulis CC, Adjaye J, Akamatsu H, et al. Human skin China Medical Cosmetology Vol.8 No.7(Total No.59)July2018·基础研究·

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Rep, 2016, 6: 29015免疫学杂志,2006, 29(1)：64–64.[17] 范菁, 王侠生. 干扰素在皮肤临床病学中的意义[J]. 国际（上接第79页）去除色素性皮损、吸疱移植、细胞移植等。 物理疗法：光疗（红光、蓝光、紫外线、红外线等），冷冻，电外科治疗（高频电、电解、电灼等），微波，粉刺挤压、微针。 注射填充疗法：局封（相关药物），硬化剂，肉毒素，填充物，吸脂与脂肪移植。 化学剥脱：果酸、乙二醇、乳酸、三氯乙酸、石炭酸、芦丁A等 光学系列疗法：激光、强脉冲光、射频、超声、光动力。 其他疗法：倒膜、护理、药浴，药物内服、外用。 中医美容 中药内服：中草药、中成药内服，中药膳食。 中药外治：湿敷、浸浴、足浴、粉剂膜剂、浸膏、紫外负离子喷雾、超声波透入、直流电离子导入及中药与其他现代仪器配合美容治疗。 针灸：毫针术、三棱针术、皮肤针（梅花针）术、皮内针术、火针术、电针术、水针（穴位注射）术、杵针术、艾炷灸、艾条灸、温针灸、温灸器灸、穴位磁疗术、耳针术、拔罐术 推拿：头面部、躯体、四肢美容推拿技术、足部美容按摩术 其他：穴位埋线：刮痧：结扎法

其他临床科室 烧伤科、创伤科：皮肤护理、皮瓣、肌皮瓣、皮片移植修复， 骨科：仅限于面部骨畸形（先天性或创伤性均可）的矫正 儿科：血管瘤、黑痣、黑色素瘤等先天性损容性疾病（荨麻疹、黄疸、湿疹不收） 妇科：处女膜修补术、阴道松弛缩紧术、阴帝肥大缩小术、小阴唇肥大缩小术、阴道再造术 产科：产后塑形（分娩侧切口、剖宫产腹部切口方向不收） 乳腺科：乳腺肿瘤手术中有考虑美学意义（有美学指标），乳房纤维瘤微创手术 普外科：代谢手术治疗肥胖综合征 神经科：周围性面瘫的手术治疗或针灸治疗（中枢性的不收） 眼科：重睑手术、眼袋手术、斜视、角膜云翳等，（白内障、青光眼、近视不收） 耳鼻喉科：可见整形外科所述 内分泌科：糖尿病足的细胞营养因子治疗和手术治疗（护理方向不收、床褥方向不收） 肿瘤科：乳腺肿瘤、血管瘤、巨大黑痣、黑色素瘤、纤维肉瘤等，皮肤肿瘤切除后的美学修复或皮肤肿瘤切除术依据美学要求的改进，单纯皮肤肿瘤切除后术后放化疗不收。泌尿外科：阴茎延长术、阴茎大部分缺损修复，先天性尿道下裂修复，阴茎再造术。 基础研究 各大学实验室或流行病调查均应能反应损容性皮肤疾病的发展及影响因素，创伤后修复美学指标变化、整形术前后变化等。其 他 化妆品等药物研究也可，但需要美学指标如皮肤光泽度、水分及黑素指数等。90

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