鱼类弹状病毒双重PCR检测的引物组、试剂盒及检测方法[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 111705165 A(43)申请公布日 2020.09.25

(21)申请号 202010631052.4(22)申请日 2020.07.03

(71)申请人 扬州大学

地址 225009 江苏省扬州市大学南路88号(72)发明人 曹攀　刘晓丹　张晓君　孙威　

周紫城　(74)专利代理机构 南京纵横知识产权代理有限

公司 32224

代理人 王玉(51)Int.Cl.

C12Q 1/70(2006.01)C12Q 1/6848(2018.01)C12N 15/11(2006.01)C12R 1/93(2006.01)

权利要求书1页 说明书4页序列表1页 附图2页

CN 111705165 A(54)发明名称

鱼类弹状病毒双重PCR检测的引物组、试剂盒及检测方法(57)摘要

本发明公开了一种鱼类弹状病毒双重PCR检测的引物组、试剂盒及检测方法，检测方法包括：从待测样品鱼的肾组织中提取RNA，以RNA为模板合成cDNA;以合成的cDNA为模板，采用合成的引物组，进行双重PCR扩增；将双重PCR扩增所得的产物进行琼脂糖凝胶电泳，将凝胶置于成像系统中观察结果。本发明针对乌鳢水泡病毒保守基因序列，设计相关特异性引物，以及相适宜的PCR反应条件，建立一种乌鳢水泡病毒双重PCR检测方法，具有特异性强、灵敏度高等特点，能够快速、准确地检测出乌鳢水泡病毒，为乌鳢水泡病毒的临床诊断与预防提供了一项重要的技术手段，对实施乌鳢水泡病毒的鉴定、分离、流行病学调查等研究提供了技术方案。

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权　利　要　求　书

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1.鱼类弹状病毒双重PCR检测的引物组，其特征是，所述引物组包括引物SHVV-1和引物SHVV-2，所述引物SHVV-1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，所述引物SHVV-2的核苷酸序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。

2.鱼类弹状病毒双重PCR检测的试剂盒，其特征是，所述试剂盒包含权利要求1所述的引物组。

3.鱼类弹状病毒双重PCR检测方法，其特征是，包括：从待测样品鱼的肾组织中提取RNA，以RNA为模板合成cDNA;以合成的cDNA为模板，采用权利要求1所述的引物组，进行双重PCR扩增；将双重PCR扩增所得的产物进行琼脂糖凝胶电泳，将凝胶置于成像系统中观察结果。4.根据权利要求3所述的鱼类弹状病毒双重PCR检测方法，其特征是，所述RNA提取采用Trizol法。

5.根据权利要求3所述的鱼类弹状病毒双重PCR检测方法，其特征是，所述双重PCR扩增的反应体系为：cDNA模板×1μL、引物SHVV-1F×1μL、引物SHVV-1R×1μL、引物SHVV-2F×1μL、引物SHVV-2R×1μL、Premix Taq×10μL、ddH2O×5μL，总量20μL。

6.根据权利要求3所述的鱼类弹状病毒双重PCR检测方法，其特征是，所述双重PCR扩增的反应程序为：95℃ 5 min，95℃ 30s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，30循环；72℃，5 min延伸，4℃保存。

7.根据权利要求3所述的鱼类弹状病毒双重PCR检测方法，其特征是，所述琼脂糖凝胶电泳为1.0%琼脂糖凝胶电泳，120V电泳30min。

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说　明　书

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鱼类弹状病毒双重PCR检测的引物组、试剂盒及检测方法

技术领域

[0001]本发明涉及一种鱼类弹状病毒双重PCR检测的引物组、试剂盒及检测方法。背景技术

[0002]PCR即聚合酶链式反应技术，一种类似于参照细胞内的DNA复制过程。该技术是以DNA为模板，加入PCR酶以及对应的特异性引物在PCR仪器中进行程序反应，复制扩增产生新的互补DNA片段。其过程由变性-退火-延伸三个步骤组成，经过多次循环，2-3小时内就可将DNA扩增放大上百万倍。因其扩增效率高、特异性强、灵敏性高等优点，在分子生物学研究领域得到了广泛的应用。

[0003]双重PCR则是建立在普通PCR方法基础之上的一种改进型方案，与一般PCR技术有所区别的是，双重PCR需要一次性加入两对引物，在同一个反应系统中同时扩增，得到特异性更强的目的条带，与一般PCR相比，具有高效、快捷、经济、简便等优点。[0004]乌鳢水泡病毒(Snakehead fish vesicularvirus,SHVV)属于弹状病毒科(Rhabdoviridae)，Perhabdovirus属。2014年从养殖池塘的患病杂交鳢体内分离出来，该病毒能够感染鳢科鱼类、鳜鱼、黄鳝等。近年来，该病毒对一些养殖区域造成了极大危害，在一些人工养殖的池塘内，感染初期病鱼体表无明显症状，摄食减弱，体质下降；严重时停止摄食、体色变黑、眼球突出、浮于池边、时而翻滚，不久便死亡。目前尚无有效治疗方法，对于该病毒的鉴定目前也没有专门的文献和技术。

发明内容

[0005]本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提供一种鱼类弹状病毒双重PCR检测的引物组、试剂盒及检测方法，能够快速、准确的检测鱼类弹状病毒，为该病毒的临床诊断与预防提供了一项重要的技术手段，对该病毒的鉴定、分离、流行病学调查等研究提供一项技术方法。

[0006]为解决上述技术问题，本发明提供一种鱼类弹状病毒双重PCR检测的引物组，所述引物组包括引物SHVV-1和引物SHVV-2，所述引物SHVV-1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，所述引物SHVV-2的核苷酸序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。[0007]本发明还提供了鱼类弹状病毒双重PCR检测的试剂盒，所述试剂盒包含上述的引物组。

[0008]本发明还提供了鱼类弹状病毒双重PCR检测方法，包括：[0009]从待测样品鱼的肾组织中提取RNA，以RNA为模板合成cDNA；[0010]以合成的cDNA为模板，采用权利要求1所述的引物组，进行双重PCR扩增；[0011]将双重PCR扩增所得的产物进行琼脂糖凝胶电泳，将凝胶置于成像系统中观察结果。

[0012]优选地，所述RNA提取采用Trizol法。[0013]优选地，所述双重PCR扩增的反应体系为：cDNA模板×1μL、引物SHVV-1F×1μL、引

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物SHVV-1R×1μL、引物SHVV-2F×1μL、引物SHVV-2R×1μL、Premix Taq×10μL、ddH2O×5μL，总量20μL。

[0014]优选地，所述双重PCR扩增的反应程序为：95℃5min，95℃30s，56℃30s，72℃1min，30循环；72℃，5min延伸，4℃保存。[0015]优选地，所述琼脂糖凝胶电泳为1.0％琼脂糖凝胶电泳，120V电泳30min。[0016]本发明所达到的有益效果：

[0017]分子生物学技术运用于病毒的检测，相对于传统病毒形态学鉴定、病毒血清型鉴定，具有速度快、成本低、操作简单等优点。双重PCR较普通PCR而言，其特异性得到大幅提高，减少了假阳性的几率。同时，它能更好地区分同源性较高，种属相近的病毒，运用于临床检测准确性更高，更可靠。

[0018]本发明针对乌鳢水泡病毒保守基因序列，设计相关特异性引物，以及相适宜的PCR反应条件，建立一种乌鳢水泡病毒双重PCR检测方法，具有特异性强、灵敏度高等特点，能够快速、准确地检测出乌鳢水泡病毒，为乌鳢水泡病毒的临床诊断与预防提供了一项重要的技术手段，对实施乌鳢水泡病毒的鉴定、分离、流行病学调查等研究提供了技术方案。附图说明

[0019]图1为双重PCR检测结果：M:Marker DL2000；1:SHVV-1F、SHVV-1R扩增结果；2:SHVV-2F、SHVV-2R扩增结果；3：SHVV-1F、SHVV-1R、SHVV-2F、SHVV-2R两对引物共同扩增结果。

[0020]图2为双重PCR特异性检测结果：M:Marker DL2000；1：乌鳢水泡病毒；2：真鲷虹彩病毒；3：传染性脾肾坏死病毒；4：鲤春病毒血症病毒；5：ddH2O阴性对照。[0021]图3为双重PCR灵敏性检测结果：M:Marker DL2000；1-5:100、10-1、10-2、10-3、10-4、病毒液稀释倍数。

[0022]图4为巢式PCR临床样品检测：M:Marker DL2000；1-21:样品1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21；22：ddH2O阴性对照。具体实施方式

[0023]下面结合附图对本发明作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。[0024]实施例1双重PCR检测方法的建立[0025]1、实验材料：患病鱼样本采自广东省顺德市杂交鳢养殖场，由实验室保存，—80℃。

[0026]实验试剂：TRIpure Reagent(北京艾德莱生物)；异丙醇、三氯甲烷、75％乙醇(国药集团化学试剂厂)；DEPC水(Biosharp公司产品)；Premix Taq(TaKaRa Version 2.0plus dye)、反转录酶、DL2000DNA Marker(TaKaRa公司产品)；DNA凝胶回收试剂盒(全式金公司生产)；琼脂糖(Biowest Agarose)；50×TAE缓冲液。[0027]2、引物设计与合成[0028]根据NCBI(National Center for Biotechnology)已发表乌鳢水泡病毒相关的基因序列，使用Clone Manager软件,根据乌鳢水泡病毒核衣壳蛋白基因的保守序列。利用引

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物设计软件(Primer primer)，设计两对乌鳢水泡病毒的PCR引物(SHVV-1F、SHVV-1R；SHVV-2F、SHVV-2R)，引物序列见表1。[0029]表1：SHVV双重PCR引物序列

[0030]

3、RNA提取和cDNA合成[0032]RNA提取：取待测样品鱼的肾脏组织，根据RNA提取说明书(Trizol法)，提取待检测样品病毒RNA，提取的RNA很容易降解，需要立即进行反转录或者－20℃保存。[0033]cDNA合成：根据RNA反转录说明书操作，取0.2ml无酶离心管，配置以下混合液(10μL)：RNA模板×5μL、Oligo Dt Primer(50μM)×1μL、dNTP Mixture(10Mm each)×1μL、RNase Free dH2O×3μL，在PCR仪中65℃恒温保持5min，迅速插入冰中冷却；以上步骤，可使反转录效率提升。上述反应物×10μL、RNase Free dH2O×4.5μL、Prime ScriptⅡRTase(200U/μL)×1μL、5×Prime ScriptⅡBuffer×4μL、RNase Inhibitor(40U/μL)×0.5μL，轻轻吹打摇匀。将离心管放入PCR仪，45℃，50min合成cDNA，95℃5min使酶失去活性，随后立即放入冰盒冷却3min，即为cDNA模板，－20℃保存备用。[0034]4、双重PCR体系的建立

[0035]双重PCR需要两对引物在一次扩增中完成，反应物配置总量为20μL。[0036]反应体系：步骤2的cDNA模板×1μL、SHVV-1F×1μL、SHVV-1R×1μL、SHVV-1F×1μL、SHVV-1R×1μL、Premix Taq×10μL、ddH2O×5μL。PCR反应程序：95℃5min，95℃30s，56℃30s，72℃1min，30循环；72℃5min延伸，12℃降温，4℃保存。[0037]5、电泳检测

[0038]配置1×TAE缓冲液和1.0％琼脂糖凝胶；点样5μL，DL2000Marker 6μL为参照，使用凝胶电泳仪120V电泳30min。结果显示：阳性条带清晰、明亮(见图1)。将条带胶回并做相关测序检测，扩增条带与目的基因序列一致。[0039]实施例2双重PCR方法的评价[0040]1、特异性检测

[0041]分别取乌鳢水泡病毒(SHVV)、传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)、真鲷虹彩病毒(RSIV)的DNA或cDNA为检测模板，设置ddH2O为阴性对照，按照本发明建立的双重PCR检测方法检测。结果显示SHVV呈阳性，扩增出了845bp和313bp两个目的条带，实验对照样品ISKNV、SVCV、RSIV以及ddH2O，均无任何条带，呈阴性(见图2)。[0042]2、灵敏性检测

[0043]对1TCID50/mL的病毒液进行10倍倍比稀释(100，10-1，10-2，10-3，10-4)，按照本发明建立的检测方法提取RNA，合成cDNA。以此为PCR模板，以相应体系和程序，进行双重PCR扩增。同时设置一组ddH2O为模板的阴性对照。结果显示，当检测样品病毒液稀释浓度为1×10-2

以内，仍可观察到明亮的双条带。当样品病毒液稀释浓度达到1×10-3时，有隐约的条带，

[0031]

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说　明　书

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当样品病毒液稀释浓度达到1×10-3以上时，则无特异性条带(见图3)。表明本实验建立的双重PCR方法对乌鳢水泡病毒最低检测浓度为1×0.01TCID50/mL。[0044]实施例3临床样品检测

[0045]选择21个患病杂交鳢肾组织临床样品，设置ddH2O为阴性对照，按照本发明建立的双重PCR检测方法检测。结果显示，21个样品扩增出了特异性条带，呈阳性；阴性对照ddH2O无条带，呈阴性(见图4)。将阳性条带胶回收测序，阳性样品基因序列与NCBI已发表乌鳢水泡病毒(SHVV)基因序列一致。

[0046]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变形，这些改进和变形也应视为本发明的保护范围。

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序　列　表

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序列表<110> 扬州大学<120> 鱼类弹状病毒双重PCR检测的引物组、试剂盒及检测方法<160> 4<170> SIPOSequenceListing 1.0<210> 1<211> 21<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 1gttcagcaaa tggtgctgtt c 21<210> 2<211> 19<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 2ctccgaagaa tgagcttca 19<210> 3<211> 21<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 3tgacagctca actacatatc a 21<210> 4<211> 19<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 4gggtccatcg aatattttc 19

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图1

图2

图3

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说　明　书　附　图

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图4

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