第38卷第6期 海 洋 渔M IiⅡe 业 Vo1.38,No.6 2016年11月 Fisheries NOV.,2016 文章编号:1004—2490(2016)06—0663—07 产麻痹性贝毒塔玛亚历山大藻共培养茵群的 物种多样性研究 刘巧红 ,苑丽东 ,田晓清 ,马丽艳 ,周宏农。, 樊成奇 ,杨宪时 ,杨(1.中NI水产科学研究院东海水产研究所,上海3.台湾大学渔业科学研究所,中国台北桥 ,张晓玲 200090;2.上海海洋大学,上海201306; 10617;4.俄勒冈州立大学微生物学系,科瓦里斯,俄勒冈97333) 摘要:产毒赤潮藻与其共生菌的互作关系是揭示麻痹性贝毒(PSP)产生机制的关键,而其共培养菌群的分 离及其多样性解析是开展此研究的必要前提。塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense)是典型产PSP赤潮原 因甲藻,为揭示其共培养菌群的物种多样性信息,本文通过免培养海洋微生物高通量测序技术,解析了东海塔 玛亚历山大藻(at3#)共培养菌群的种类、丰度及多样性信息。结果表明,其共培养菌群共有87个种与已有数 据库匹配,此外尚有5%的未知种。其包含57个属,其中优势菌属5个,分别为Rhodobacteraceae、 Marinobacter、Methylophaga、Nitratireductor及Phycisphaera。研究表明东海产PSP塔玛亚历山大藻(at3#)含有物 种丰富的共培养菌群,且具有发掘海洋特殊生境微生物新种属的良好潜力。 关键词:塔玛亚历山大藻;麻痹性贝毒;共培养菌群;物种多样性 中图分类号:Q 949.3 文献标识码:A 有害赤潮是受到全球关注的重大环境问题 及海洋生态灾害¨ 。近年来,我国海洋环境污 通过免培养微生物高通量测序技术,首次解析了 其共培养菌群的种类、丰度及多样性信息。此研 究结果可为后续开展藻菌关系等研究提供必要 染日趋加重,导致赤潮频发,给我国生态环境、海 产养殖及渔业、水产品质量安全等多方面带来巨 的生物学背景信息支持。 大威胁,且不断引发人体中毒乃至死亡事件发 生 。而目前关于麻痹性贝毒(PSP)的来源问 题仍悬而未决,而甲藻共生菌产毒假说认为,赤 潮藻内共生菌才是PSP的主要生产者 J。该 学说得到了日益增加的赤潮藻产毒共生菌数量 1材料与方法 1.1实验材料 产PSP塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense,编号at3#),由台湾大学渔业科学研究 所周宏农教授课题组提供。分离自台湾屏东市 东港水产养殖池中,保存于本研究室。 藻培养基:改良f/2培养基、细菌分离培养基 为海洋Zobell 2216培养基H 。细菌鉴定生理生 的实验证据支持 。产毒赤潮藻与其共生菌 的关系是揭示PSP产生机制的关键,而其共培养 菌群的分离及其多样性分析是开展此研究的必 要前提。产PSP塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense)是我国典型赤潮甲藻 ,但对其共培 化测试所需培养基,参照文献[15]配制;细菌基 因组DNA提取、PCR扩增试剂盒均购自荷兰 养菌群的物种多样性背景信息尚知之甚少。本 文以东海塔玛亚历山大藻株(at3#)为研究材料, 收稿日期:2016—02—16 QIAGEN公司;PCR引物由上海生工合成;其它化 基金项目:国家自然科学基金(41206093);中央公益性科研院所基本科研业务费专项(2012T08) 作者简介:刘巧红(1990一),硕士研究生,研究方向:海洋微生物及海洋毒素。 通讯作者:张晓玲,副研究员。E-mail:nyyqxl@126.corn 海洋渔业 2016正 学试剂均为分析纯,购自上海国药集团。实验用 纯水制自美国Millipore公司Milli-Q纯水系统。 1.2实验方法 1.2.4数据分析 挑取97%相似性对非重复序列进行分类单 元(OTU)聚类。得到OTU代表序列,选出OTU 代表序列相似性97%以上序列,生成OTU表格。 采用RDP classiifer贝叶斯算法对其进行分类学 分析,在各分类水平上统计样品微生物群落组 成。比对数据库16S细菌数据库:Silva、RDP、 Greengene。软件及计算方法:QIIME及RDP 1.2.1藻培养 使用改良f/2培养基,光照强度:4 500~ 5 000 lx,光照周期:12L/12D,培养温度:22℃。 使用人工海水配制培养基。 1.2.2高通量测序 收集对数生长期的藻培养物50 mL,于无菌 离心管内,静止至藻细胞沉降后,吸弃上清液,细 胞沉淀加入30 mL PBS缓冲液(pH 7.2),振荡均 匀后离心(4℃,4 000 rpm,20 min)。重复洗涤3 次。所得细胞沉淀通过DNA提取试剂盒提取总 DNA,PCR使用细菌通用引物V3+V4区338F一 Classifier平台,置信度阈值0.7。获得共培养菌 群落物种丰度(Chao及Ace指数)、多样性(Alpha 多样性,Shannon及Simpson指数)及样品间群落 结构差数据¨ J。 2结果与分析 2.1样品质量控制 806R,其中上游引物338F:5 一GGACTA CHVGG CTAAT一3 ;下游引物806R:5 一 GGACTACHVGGGTWTCTAAT一3 ,进行PCR扩 采用免培养环境微生物高通量测序技术分 析了塔玛亚历山大藻(at3#)共培养菌群多样性。 增。通过Illumina MiSeq平台进行高通量测序。 1.2.3数据处理 首先对测序样品质量进行了分析,其质量控制分 所得端序列数据,根据PE reads问overlap关 系,将成对的reads拼接成一条序列,同时对reads 质量和merge效果进行质控过滤,根据序列首尾 析结果如表1所示。其修剪(trimmed)序列长度 301~400 bp比例高于99.98%,综合以上数据, 说明高通量测序样品数据可靠。 2.2样品多样性指数 两端的barcode和引物序列区分样品得到有效序 列,并校正序列方向。过滤read尾部质量值20 以下碱基,设置50 bp窗口,若窗口内平均质量值 低于20,从窗口开始截去后端碱基,过滤质控后 5O bp以下read。根据PE reads间overlap关系, 塔玛亚历山大藻(at3#)共培养菌群样品的多 样性稀释性曲线分析采用序列随机抽样法,以抽 到测序序列数与其代表OTU数目构建rarefaction 曲线(图1)。结果表明样品高通量测序深度足 够。样品多样性指数,包括菌群丰度(community richness)指数(Chao、Ace)、菌群多样性 (community diversity)指数(Shannon、Simpson)及 将成对reads拼接成一条序列,最小overlap长度 为10 bp,拼接序列overlap区允许最大错配比率 0.2,筛选不符合序列,根据序列首尾两端barcode 与引物区分样品,并调整序列方向,barcode允许 错配数0,最大引物错配数2。 测序深度指数(coverage)结果如表2所示,样品 Shannon.Wiener曲线如图1所示,以上结果可看 出所分析藻样共培养菌群的物种多样性较高。 表1 高通置测序样品质量控制数据 Tab.1 Quality control data of the high-throughput sequencing sample 表2高通量测序样品多样性指数数据 Tab.2 Alpha-diversity data of the hiigh・throughput sequencing sample 分类单元 OTU tO1 Ace指数 Ace index 102 Chao指数 Chao index 102 Shannon指数 Shannon index 2.87 Simpson指数 Simpson index 0.091 1 覆盖度 Coverage 第6期 刘巧红等:产麻痹性贝毒塔玛亚历山大藻共培养菌群的物种多样性研究 I10-【p0日H0 日 ¨0 Tl∞时0目目0-【 0由H0 日 析¨ 。表3表示的是塔玛亚历山大藻(at3#)共 培养菌群样品OTU代表性序列相似性在97%以 上的序列数统计表,OTU聚类得到样品中各个 OTU丰度及其在样品中序列数。 2.4分类学分析 对通过高通量测序所获得的藻共培养菌群 样品数据,采用RDP classiifer贝叶斯算法对97% 相似水平OTU代表序列进行分类学分析,在各分 类水平上统计样品微生物群落组成。结果表明, 种水平比对共有87个种与已有数据库匹配(图 图1高通量测序样品Rarefaction(a)与 Shannon・Wiener(b)曲线图 Fig.1 The Rarefaction(a)and Shannon-Wiener curves(b)of the high-throughput sequencing sample 2),此外含有5%未知种。属水平比对共含57个 属(图3),其中优势菌属5个,分别为 Rhodobacteraceae、 Marinobacter Methylophaga、 Nitratireductor及Phycisphaera。结果表明产PSP 2.3 oTU分布统计 东海塔玛亚历山大藻(at3#)含有丰富的共培养菌 群,且具有发现海洋特殊生境微生物新种属的良 好潜力。 OTU是系统发生学或群体遗传学研究中设 置的分类单元归类操作标志,以便进行比对分 表3高通量测序样品的OTU及其序列数信息 Tab.3 OTU and sequence number data of he high-throughput sequencitng sample 666 海洋渔业 2016年 巷 g ’r 皇 日S毒 Pa 8I_I∞rJ 目 ■8% 翟 rE青 目dn暑 置总8 冒 ∞ 目 I霉 器pl 譬,口甚q 量 3童 g pa g 呵姗董% g耸 8 pa鲁 目H 壹8 昱 pⅡ 时州馨 ∞口 8吕萤q pa _}∞∞Bl§∞ §童 喝童gq082g § 量童量ap 2∞ 童P日皇 §%8a暑 i一 pa .}§ 8§皇 皇ll 曼 S譬 譬 ≈一 岳 最一量害 曼 缸 喜∞ 譬 8 量骂叠鱼 望匹譬量皇 毒§ 目 譬 誉8 .ds% g g dH目 趸胃 盘 8q0Ⅱ 薯 }q8 b lliIⅢiIlIlI㈣ lllIIIllIllIl㈣ 0Ill lll l翻[HllUlIHIHH 川 ,∞ 8 0口 基孳Pa 8 §}镕 I盛 ^I目翻 翻 Pa 8 § _目 目嗣 童g 昱 皇 § 888量芝 0 跪雌H§∞ ∞『。 镪 r0 ap占 pa % 8 %日『姗 ER§美∞Is甚 叠lIl葛∞∞Bl窖罩∞ 警 sl0茸 墨置呈8PI爱 % ≈盘 器 §磐 l盘口专 毒 芑雯 盘 量窭《毒 pa i __§ HlJ|S Ⅳ|Hs S鱼 鲁 缸 譬山∞ 量瓷pa , 目 §§ 9巨∞ 3曼量;Hn p。自a i《 童旨 .导盈已譬, 司 茸目 目Al《 目百∞ 舀 叠暑警委 Pl g 05~ 壹ig66D h 目『。目喜舢『目 量8 8 8目 8 图2塔玛亚历山大藻(at3#)共培养菌群的物种种类及其丰度图 量^目 d0 皇童m i ⅡaP鲁 Fig.2 Species diversity of the CO-cultured bacterial community of A.tamarense(at3#) 8 8 2a∞目 0.04 O.02 O 量 量 妻耋 耋耋 童 薹量萋量 耋耋 量耋 量薹耋 耋耋量耋量萋耋 蓍壹茎 墨量 耋望 壹 耋 耋 图3塔玛亚历山大藻(at3#)共培养菌群的属水平分布图 Microbial distribution on genus level of the CO-cultured bacteril communiaty of A. 第6期 刘巧红等:产麻痹性贝毒塔玛亚历山大藻共培养菌群的物种多样性研究 the harmful red tide[J].Nature,1997(388):513 —3讨论 目前,PSP究竟是由赤潮藻、或其共生菌单独 5l4. [2] ZOU C,YE RM,ZHENG JW,et a1.Molecular phylogeny and PSP toxin profile of the Alexandrium 产生,或藻菌二者互作共同产生,尚无定论。两 种观点争辩的最终解决,需在赤潮藻及其共生菌 两方面开展更为深入的系统研究,以找寻并积累 更多实验证据 卜驯。而海洋共生菌在长期自然 进化过程中,与其宿主形成了复杂的共生体系, 二者之间既存在代谢产物的相互交流,亦有遗传 物质在不同物种之间的基因水平转移(horizontal gene transfer)及基因融合(gene fusion) 。因 此,赤潮藻与其共生菌互作关系是揭示PSP产生 机制的关键 。-20]。 塔玛亚历山大藻是世界范围的产PSP赤潮 甲藻,其适应能力强、生存范围广。在我国北至 胶州湾,南至厦门海域、大鹏湾均有分布,并有较 高赤潮发生频率,是我国各海区典型赤潮原因甲 藻,亦是赤潮生物学的研究热点及模式生物之 一,但其共培养菌群的多样性研究尚无报道。而 海洋环境中高达99%的微生物为活的不可培养 状态(viable but non-cultivable state),这一特殊类 群微生物对于宿主赤潮甲藻的生长及毒素生物 合成的影响如何?亦应引起更多关注 卜 。而 通过免培养(culture-independent)高通量测序技 术解析其共培养菌群的物种多样性信息,可为其 分离培养策略的设计与优化、提高其共培养菌群 的可培养性提供有益科学参考 。本研究利用 高通量测序技术,首次阐明了东海塔玛亚历山大 藻内共培养菌群的种类、丰度及多样性信息。结 果表明,其具有丰富的共培养菌群,且蕴含发掘 特殊海洋生境微生物新种属的良好潜力。而本 课题组的已有研究发现,通过微生物纯培养所获 得的可培养共培养菌群的种属数量远低于高通 量测序所分析结果 ,印证了若要揭示产毒赤潮 藻共培养菌物种多样性真实全貌,尚需在其关键 研究瓶颈技术——提高海洋微生物特别是共生 菌可培养性(cultivability)方面取得突破。基于 此,产毒赤潮藻内共培养菌的系统分离及多样性 研究仍将是今后藻菌关系相关研究的重要方向 之一。 参考文献: [1] KREUDER C,MAZET J,BOSSART G,Turning back tamarense species complex along the coast of China [J].Marine Pollution Bulletin,2014,89(1—2): 209—219. 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The answers to the source of PSP toxins are still unsolved.Algae—bacteria interaction study is the key to uncover the producing mechanism of PSP.Whereas,the intensive isolation and biological background analysis is the first premise to develop such interaction study.Currently,A.tamarense is a dinoflagellate known to produce saxitoxin,a neurotoxin which causes the human illness clinically known as PSP.Multiple species of phytoplankton are known to produce saxitoxin,including at least 10 other species from the genus Alexandrium.A.tamarense is a worldwide dinoflagellate known to produce saxitoxin.It has strong adaptabity, can survive in a wide range of sea areas.It distributes from Kiaochow Bay to Xiamen sea area and Dapeng Bay.It has frequency of HAB.A.tamarense is one of the representative toxic marine dinoflagellates causing HAB in the East China Sea area.However,little is known about its biodiversity of its co・cultured bacterial community yet.To elucidate its biodiversity,the species abundance and diversity of the co—cultured bacterial community associated with toxic A.tamarense(at3#)were analyzed by high—throughput sequencing.From the results,the quality control data of the high—throu:ghput sequencing sample indicated that its reliability with the length distribution of the trimed sequences of 301——400 bp was over 99.99%.The biodiversity indexes including community richness,Chao index(1 02),Ace index(1 0 1),and the community diversity indexes including Shannon(2.87),Simpson(0.09 1 1)and coverage(0.9996)all showed relative richness of the sample sequenced.The results obtained by the OUT taxonomy analysis showed that 87 species co—cultured bacterial community associated with toxic A.tamarense(at3#)matched with the established database,in addition to about 5%unknown species.They belong to 57 genus.in which the five dominant include Rhodobacteraceae sp.,Marinobacter sp.,Methylophaga sp.,Nitratireductor sp.and Phycisphaera sp..This study demonstrates for the first time the biodiversity of the co—cultured bacterial community associated with toxic A.tamarense(at3#),and the great potential for discovering new marine microbial species from this special habitat. Key words:Alexandrium tamarense;PSP toxins;co-cultured bacterial community;species diversity