高纯度羟基积雪草苷及积雪草苷B的制备方法[发明专利]

*CN102477063A*

(10)申请公布号 CN 102477063 A(43)申请公布日 2012.05.30

(12)发明专利申请

(21)申请号 201010558562.X(22)申请日 2010.11.24

(71)申请人上海医药工业研究院

地址200040 上海市静安区北京西路1320

号(72)发明人邵燕 陈云艳 孔德云 翁小香

周靖 欧阳丹薇 吕峰 高雯张静 成亮(74)专利代理机构上海金盛协力知识产权代理

有限公司 31242

代理人解文霞(51)Int.Cl.

C07J 63/00(2006.01)

权利要求书 1 页 说明书 3 页权利要求书1页 说明书3页

()发明名称

高纯度羟基积雪草苷及积雪草苷B的制备方法(57)摘要

本发明涉及羟基积雪草苷与其同分异构体积雪草苷B的提纯方法技术领域。本发明所述的高纯度羟基积雪草苷及积雪草苷B的制备方法，是通过制备型高效液相色谱仪，流动相内添加环糊精，根据色谱峰分别采集得到两种收集液，然后将两种收集液分别回收溶剂后萃取去除环糊精。本发明在制备型高效液相色谱分析方法基础上利用环糊精流动相添加剂法分离出积雪草苷B与羟基

不需特殊分析柱就分离提纯出了积雪积雪草苷，

草苷B与羟基积雪草苷，该方法价廉易行，与其他方法相比具有实质性的进步和优势。CN 102477063 ACN 102477063 A

权 利 要 求 书

1/1页

1.高纯度羟基积雪草苷及积雪草苷B的制备方法，该方法是通过制备型高效液相色谱仪，流动相内添加环糊精，根据色谱峰分别采集得到两种收集液，然后将两种收集液分别回收溶剂后萃取去除环糊精。

2.如权利要求1所述的高纯度羟基积雪草苷及积雪草苷B的制备方法，其特征在于：所说的流动相为乙腈-环糊精水溶液系统。

3.如权利要求2所述的高纯度羟基积雪草苷及积雪草苷B的制备方法，其特征在于：所说的环糊精水溶液浓度为2-8mmol/L。

4.如权利要求3所述的高纯度羟基积雪草苷及积雪草苷B的制备方法，其特征在于：所说的环糊精水溶液浓度为2mmol/L。

5.如权利要求1所述的高纯度羟基积雪草苷及积雪草苷B的制备方法，其特征在于：萃取步骤选用丁醇、戊醇或乙酸乙酯作为有机相。

6.如权利要求3所述的高纯度羟基积雪草苷及积雪草苷B的制备方法，其特征在于：萃取时选用正丁醇作为有机相。

7.如权利要求1所述的高纯度羟基积雪草苷及积雪草苷B的制备方法，其特征在于：萃取时有机相与水相的体积比为1∶100～100∶1。

8.如权利要求7所述的高纯度羟基积雪草苷及积雪草苷B的制备方法，其特征在于：萃取时有机相与水相的体积比为1∶4-4∶1。

9.如权利要求8所述的高纯度羟基积雪草苷及积雪草苷B的制备方法，其特征在于：萃取时有机相与水相的体积比为2∶1。

10.如权利要求1所述的高纯度羟基积雪草苷及积雪草苷B的制备方法，其特征在于：萃取次数为1～10次。

11.如权利要求10所述的高纯度羟基积雪草苷及积雪草苷B的制备方法，其特征在于：萃取次数为1次。

12.如权利要求1所述的高纯度羟基积雪草苷及积雪草苷B的制备方法，其特征在于：萃取时，收集液回收溶剂后得到的白色粉末的量(mg)与有机相、水相的总量(ml)比为1∶100～100∶1。

13.如权利要求12所述的高纯度羟基积雪草苷及积雪草苷B的制备方法，其特征在于：萃取时，收集液回收溶剂后得到的白色粉末的量(mg)与有机相、水相的总量(ml)比为25∶1～25∶4。

14.如权利要求13所述的高纯度羟基积雪草苷及积雪草苷B的制备方法，其特征在于：萃取时，收集液回收溶剂后得到的白色粉末的量(mg)与有机相、水相的总量(ml)比为10∶1。

2

CN 102477063 A

说 明 书

高纯度羟基积雪草苷及积雪草苷B的制备方法

1/3页

技术领域

[0001]

本发明涉及羟基积雪草苷与其同分异构体积雪草苷B的提纯方法技术领域。

背景技术

积雪草Centella asiatica(L.)Urban.为伞形科积雪草属植物积雪草的干燥全

草，始载于《神农本草经》，味苦、寒。主大热，恶疮，痈疽，身热，被列为中品。积雪草为2010年版《中国药典》收载的常用中药，具有清热利湿、解毒消肿的功效，临床上多用于治疗跌打损伤、皮肤病，同时用于传染性肝炎、流行性脑脊髓膜炎、急性肾小球肾炎等。我国应用积雪草外用及内服治疗疾病已有两千年的历史，南非、印度、东南亚等许多国家和地区也将其作为传统药物应用。积雪草主要的化学成份包括三萜类、多炔烯类、挥发油类以及其他成份。[0003] 积雪草总苷为从积雪草的全草中提取分离得到的有效部位，含有多种三萜类化合物，主要包括积雪草苷、羟基积雪草苷及其同分异构体积雪草苷B。具有促进创伤愈合作用，临床上多用于治疗手术创伤、烧伤、外伤和疤痕疙瘩等。

[0004] 对于积雪草总苷中有关成分的HPLC含量测定已有的相关报道，均是在一般HPLC条件下进行测定，一般的甲醇-水或乙腈-水系统的流动相均无法有效分离羟基积雪草苷与其同分异构体积雪草苷B，羟基积雪草苷与其同分异构体积雪草苷B均为一个混合物的峰。

[0005] 环糊精流动相添加剂法简介：环糊精流动相添加剂法是将环糊精添加于流动相中。β-环糊精具有特殊的分子结构，即呈闭合筒状结构。β-环糊精是由七个D-(+)-吡喃葡萄糖单元通过α-1，4糖苷键相结合，外部是亲水性的表面，内部则是一个具有一定尺寸的手性疏水管腔，β-环糊精这种独特的内疏水、外亲水结构不仅使其在模拟酶、手性分离、主-客体化学、分子识别、光谱探针等领域显示了重要的理论价值，更在医药、食品、化妆品、环境保护等领域显示出重要的实用价值，特别是用于手性分离领域。但未见将环糊精包合物中的环糊精去除而对标准品进行提纯的相关文献报道。

[0002]

发明内容

本发明的目的就是解决现有HPLC条件下无法分离出羟基积雪草苷与其同分异构

体积雪草苷B的上述缺陷，提供一种简便易行的分离高纯度羟基积雪草苷及其同分异构体积雪草苷B的方法。

[0007] 本发明通过制备型高效液相色谱仪，采用流动相环糊精添加剂法分别收集得到羟基积雪草苷的同分异构体积雪草苷B与羟基积雪草苷环糊精包合物的固体样品，即环糊精与标准品的包合物；然后通过去除环糊精包合物中的环糊精对标准品进行提纯即得到液相色谱分析用高纯度羟基积雪草苷及其同分异构体积雪草苷B。

[0006]

本发明采取的技术方案如下：

[0009] 高纯度羟基积雪草苷及积雪草苷B的制备方法，该方法是通过制备型高效液相色谱仪，流动相内添加环糊精，根据色谱峰分别采集得到两种收集液，将两种收集液分别回收

[0008]

3

CN 102477063 A

说 明 书

2/3页

溶剂后通过萃取去除环糊精，即得积雪草苷B与羟基积雪草苷的标准品。[0010] 上述的流动相优选乙腈-环糊精水溶液系统，环糊精水溶液的浓度范围优选在2-8mmol/L，最优选2mmol/L。[0011] 上述的萃取步骤中，优选丁醇、戊醇、乙酸乙酯等作为有机相，最优选的是正丁醇，正丁醇作为有机相对样品的溶解性能相对最好；有机相与水相的比例在1∶100～100∶1范围之间选用，其中有机相与水相的比例优选范围为4∶1-1∶4，最优选范围为2∶1；两种收集液分别回收溶剂后得白色粉末，白色粉末样品量与有机相、水相的总量的比例(mg/ml)在1∶100～100∶1范围之间选用，其中优选范围为10∶1；对样品进行萃取次数为1～10次，优选萃取次数为1次，分层得到有机相，将有机相回收溶剂后即得积雪草苷B与羟基积雪草苷的标准品。

[0012] 本发明的有益效果：

[0013] 本发明在制备型高效液相色谱分析方法基础上利用环糊精流动相添加剂法分离出积雪草苷B与羟基积雪草苷的环糊精包合物，然后通过萃取去除环糊精得到液相色谱分析用高纯度羟基积雪草苷及其同分异构体积雪草苷B。该方法价廉易行，不需特殊分析柱，就分离提纯出了积雪草苷B与羟基积雪草苷，相对于现有技术具有很大的进步和优势。具体实施方式

[0014] 以下实施例是为了更好的说明本发明而非用来本发明。[0015] 实施例1-12[0016] 1.制备：(送样样品为积雪草总苷原料)

通过环糊精添加剂法利用制备型高效液相色谱的方法将羟基积雪草苷与其同分异构体积雪草苷B分离.岛津制备型高效液相色谱仪，包括Shimadzu Class-VP工作站，LC-8A泵，SCL-10Avp泵的控制器，SPD-M10Avp检测器，FRC-10A自动收集器，流动相选用乙腈∶2mmol/L环糊精水溶液(v/v)＝26∶74，色谱柱为：SHIMADZU shim-pack PRC-ODS柱(20mm×250mm)，流速：6ml/min，进样量：5ml，检测波长：204nm，根据色谱峰分别采集得到制备液相色谱的收集液，将收集液分别回收溶剂，得到白色粉末。[0018] 2.萃取：

[0019] 取上述得到的白色粉末50mg，选用正丁醇(水饱和的)、戊醇、乙酸乙酯等作为有机相，萃取按照有机相与水相的体积比例在1∶100-100∶1范围之间选用，白色粉末样品的总量(mg)与有机相、水相的总量(V)的比例在1∶100-100∶1范围之间选用，对样品进行萃取，萃取1-10次，分层得到有机相，将有机相回收溶剂后即得积雪草苷B与羟基积雪草苷的标准品。

[0020] 3.样品纯度检测：

[0021] 采用HPLC-ELSD及UV检测，HW Workstation工作站，Alltech ELSD 2000

色谱柱为检测器，Waters 515HPLC Pump，流动相采用乙腈∶水(v/v)＝30∶70，

C18(4.6mm×250mm)柱，流速：1ml/min，进样量：20μl，检测波长：204nm，根据进样量，样品的浓度以及样品峰面积可以得出标准品的纯度。根据所得的标准品计算得到收率。[0022] 4.获得的标准品含量：≥99％。[0023] 5.产品外观：白色粉末。

[0017]

4

CN 102477063 A[0024]

说 明 书

3/3页

各实施例萃取步骤具体条件与结果见下表1：

[0025] 表1

[0026]

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

[0027]

25∶1 25∶1 25∶1 25∶1 10∶1 10∶1 10∶1 10∶1 25∶4 25∶4 25∶4 25∶4

1∶4 3∶2 2∶1 3∶1 3∶2 2∶1 3∶1 4∶1 3∶2 2∶1 3∶1 4∶1

3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

19.97 49.35 36.99 23.35 31.90 63.11 45.06 19.97 30.40 60.69 39.72 22.17

试验用样品量为50mg，收率是以所得样品的纯度达到标准品的纯度计算而得。单

因素考察实验时均采取萃取次数为3次，根据纯度合并萃取的样品，计算收率，上表1为单因素实验数据。

[0029] 本发明另外进行了正交实验，采取了萃取次数为1、2、3次的实验设计，根据正交实验的结果得到萃取1次为最优选择。[0030] 实验分别采用了丁醇、戊醇、乙酸乙酯等作为有机相进行了萃取，其中水饱和的正丁醇作为有机相，对样品的溶解性能相对最好，标准品收率也最高，戊醇、乙酸乙酯的实验收率较低，所以最优选采用正丁醇作为有机相。

[0028]

5