AOAC 官方方法999.03 食品中总果聚糖的测定中文翻译

aoac官方方法999.03食品中总果聚糖的测定中文翻译

AOAC官方方法999.03食品中总果糖的测定

酶/分光光度法1999年第一次执行

（适用于食品中果糖的测定。不适用于高度解聚的果糖，无论是酸还是酶。）支持方法接受的实验室间研究结果如表999.03所示。a、 原则

用热水提取产物以溶解果聚糖。将等份的提取物用特定的蔗糖酶处理以将蔗糖水解成葡萄糖和果糖，并用纯淀粉降解酶的混合物将淀粉水解成葡萄糖。所有还原糖用碱性硼氢化物还原成糖醇。果聚糖用纯化的果聚糖酶（外切-菊粉酶加内切-菊粉酶）水解成果糖和葡萄糖，并且这些糖通过β-羟基苯甲酸酰肼（pahbah）方法测量用于还原糖。b.装置设备（a）研磨机。

（b） 热盘子。用磁力搅拌器。（c） 水浴温度保持在40±0.1℃。（d） 沸水浴。（e） 旋涡混合器。（f） PH计。

（g）停止计时器。（h）滤纸。

（i） 真空烤箱。用于干燥果糖标准品。（j） 分光光度计。在410纳米处工作。

（k）移液管。用一次性吸头输送100和200μl。或者，可以使用机动手持式分液器。

（l） 正位移移液管。（m） 玻璃试管。（n） 瓶子容量。

（0）聚丙烯容器。c.试剂

所有试剂应具有分析纯度等级。

（a）马来酸钠缓冲液。100mm。ph6.5。将11.6g马来酸溶于900ml蒸馏水中，用2mnaoh（8.0gnaoh/100ml）将ph调节至6.5，并用水稀释至体积1l容量瓶中。储存在4℃。

（b） 醋酸钠缓冲液。100毫米，ph4。5.将5.8毫升冰醋酸（1.05克/毫升）吸入900毫升蒸馏水中。使用1mnaoh调节至pH4 5，并用水稀释至1L。在4°C下储存。

（c）对羟基苯甲酸酰肼（pahbah）还原糖分析试剂.（1）溶液a.-在磁力搅拌器上，在250ml烧杯中加入10gpahbah至60ml水中。搅拌浆液并加入10ml浓hcl。用蒸馏水调节至200ml并在室温（约22°c）下储存。溶液稳定至少2年。（2）溶液b.-将24.9g柠檬酸三钠二水合物加入500ml蒸馏水中并搅拌溶解。加入2.20gcacl22h20并通过静置溶解。然后加入40.0gnaoh并用静止溶解。（溶液可能是乳状液，但会在稀释时澄清。）将体积调节至2l。在室温（约22°c）下溶液稳定至少2年。（3）pahbah工作试剂，现配现用。将20ml溶液a加入180ml溶液b中并充分混合。该溶液应储存在冰上并稳定约4小时。

（d） 氢氧化钠。50mm.将2.0 gnaoh溶解在900毫升蒸馏水中。调整音量

节至1l。在室温下保存（约22℃）。

（e） 碱性硼氢化钠-准确称取50mg硼氢化钠于聚丙烯容器中。在管子上记录重量，密封管子并将其储存在干燥器中以供使用。使用前立即使用。将硼氢化钠（10 mg/ml）溶解在50 mm NaOH溶液中。溶液在室温下稳定4-5小时。

（f）乙酸。100mm。将5.8ml冰醋酸加入蒸馏水中，并将体积调节至1l。在室温下（约22°c）储存。

（g） 蔗糖酶/淀粉酶制剂。2.27单位（U）蔗糖酶/ml。将蔗糖酶（50U）和β-淀粉酶（蜡样芽孢杆菌，500U）、支链淀粉酶（地衣芽孢杆菌，100u）和麦芽糖酶（酵母，1000u）（冻干粉末）溶于22ml马来酸钠缓冲液中。C（a）将酶溶液分为5毫升，并将其冷冻保存在聚丙烯容器中，以防止微生物污染。如果不在缓冲液中稀释，灭菌酶在-20℃下保存可稳定5年。蔗糖酶活性的一个单位是pH值为6时，在5℃和40℃时，蔗糖释放1μmol葡萄糖/分钟所需的酶量。

（h）果聚糖酶溶液。350u/ml外切-菊粉酶和35u/ml内切-胰岛素酶。将含有8000u外切-菊粉酶和800u内-缬氨酸酶溶解在装有22ml乙酸钠缓冲液的瓶子中，c（b）。将酶溶液分成5ml等分试样并冷冻储存在聚丙烯容器中以防止微生物接触。如果不在缓冲液中稀释，则在-20℃下储存时，干燥的酶可稳定5年。一个单位（u）外切-菊粉酶活性是在ph4.5和40℃下从半胱氨酸（10mg/ml）释放1μm的还原糖当量（作为

果糖）/min所需的酶量。

（i） 果聚糖控制面粉。含有已知量的α-大丽花果聚糖，在纤维素存在下冷冻干燥。在室温下干燥储存时，它是稳定的。

（j）蔗糖对照面粉。在α-纤维素存在下冷冻干燥的蔗糖。在室温（约22°c）下储存时稳定。

（k） D-果糖标准储备溶液。在0.2%苯甲酸溶液中1.5mg/ml。在制备溶液之前，干燥的粉末状结晶果糖（纯度>97%）在60℃下抽真空16小时。d、 试验材料的制备

所有产品在称重前应在室温（22℃）下进行。

（a） 测试样本。对于干燥食品，在研磨机中研磨约50g实验室样品，以通过0.5mm的筛子。将所有材料转移到广口塑料罐中，并通过摇动和倒置均匀混合。

对于固体潮湿的产品，如巧克力，温热至室温（约22℃），并用奶酪刨丝器将材料碾碎。

对于柔软、非常潮湿的食物，如低脂酱汁，加热材料直至其变软；然后用抹刀用力搅拌，取一部分具有代表性的散装样品。

对于液体或半液体产品，如果汁或酸奶，在加热前将ph调节至约6.5。可以直接稀释在马来酸盐缓冲液中，c（a）。

（b） 果糖标准工作溶液。将0.2ml果糖标准储备溶液[1.5mg/ml，C（k）]加入0.9ml醋酸盐缓冲液C（b）。然后彻底搅拌。将0.2 ml溶液（含54.5μG果糖）分为四个玻璃管，一式四份，B（m）。每管加入0.1ml醋酸缓冲液C（b）。在反应开始前，使用沸水浴并添加5.0mlpahbah工作试剂C（C）。

（c）试剂空白。转移0.3ml乙酸盐缓冲液，c（b）。进入试管并进行e（c）的标准试验。

（d） 蔗糖控制面粉。含有10%的蔗糖。按照与含有0-12%果聚糖的试验材料相同的程序分析1.0 g该粉末。本品不含果聚糖。用于检查蔗糖酶和硼氢化钠

处理的效果。计算出的果聚糖含量不应超过0.3%。e.定量

（a） 果聚糖的提取。（1） 对于含有0-12%果聚糖的样品，运行D-果糖工作标准溶液（一式四份）、试剂空白（一式两份）、果聚糖对照面粉和蔗糖对照面粉。用试剂空白将分光光度计归零。

（i）将1.0g测试部分准确称入干燥的200ml烧杯中。在~80℃加入80ml热蒸馏水：搅拌并加热烧杯，用磁力搅拌器在~80℃下加热加热板约15分钟直至固体完全分散。溶液浆液的ph值>5.5。果聚糖可以部分解聚。

（二） 将溶液冷却至室温，将其定量转移至100ml容量瓶中，用蒸馏水将其定容至刻度，然后混合。

（iii）通过纸过滤等分的溶液试样,b（h）。并立即分析。滤液可能略微混浊。这不是问题。（如果滤液在分析前在低温下储存数小时，则可能会沉淀出溶液。在这种情况下，将溶液再加热至~80°c并冷却至室温，然后取出溶液进行分析。）

（2） 含有12-50%果聚糖的样品。运行D-果糖工作标准溶液（一式四份）和试剂空白（一式两份）。将果糖对照面粉和蔗糖对照面粉与每组试样进行比较。用试剂空白将分光光度计归零。

（i）准确称取90-100mg磨碎试料，直接放入100ml耐热玻璃烧杯中。在?80°c下加入40毫升热蒸馏水，用?80°c的磁力搅拌器搅拌烧杯并加热其内容物约15min，直到固体完全分散。溶液或浆液的ph值大于5.5，或果聚糖可能部分解聚。

（二） 将溶液冷却至室温，将其定量转移至50 ml容量瓶中，用蒸馏水调节体积，并彻底混合内容物。将小份溶液过滤到反应管B（H）中，并立即进行分析。

（3）含有50-100％果聚糖的产品。按照（2）进行，将溶液转移到100ml容量瓶中并调节至标记。通过纸张过滤等分的溶液，b（h），并立即分析。

（b） 去除蔗糖、淀粉和还原糖。（1） 将0.2ml待分析滤液（含有约0.1-1.0mg/ml果聚糖和对照）转移至两个玻璃试管底部。b（m）

（2）加入0.2ml稀释的蔗糖酶/淀粉酶溶液,c（g），到每管，在40℃下反应30分钟。

（3） 向每个试管中加入0.2ml碱性硼氢化钠溶液C（E）。剧烈搅拌试管，在40℃

下反应30分钟，使其完全还原为糖醇。

（4）加入0.5ml乙酸,c（f）,到每管。在涡旋混合器上对每个管进行剧烈涡旋。如果硼氢化物是新鲜的，应该会观察到剧烈的反应。如果没有，硼氢化物存在问题，改用新鲜的硼氢化物分析。（此处理可去除过量的硼氢化物并将ph调节至约4.5。）。这是溶液a.

（c） 果聚糖的水解和测定。（1） 将0.2毫升等分溶液a（一式两份）转移到玻璃管中。b（m）

（2）加入0.1毫升果聚糖溶液，c（h），到每个试管中，在涡流搅拌机上搅拌内容物，并在40℃下反应20分钟，使果聚糖完全水解为果糖和葡萄糖。

（3） 向所有试管中加入5.0mlpahbah工作试剂，包括果糖标准工作溶液、D（b）、试剂空白、D（c）以及果聚糖对照样品c（I）和蔗糖对照样品c（J）的提取物，并在沸水浴中反应6分钟。

（4）从沸水浴中取出所有试管，立即置于冷水（18-20℃）中约5分钟。（5）冷却后尽快测量410nm处所有溶液对试剂空白的吸光度。pahbah颜色复合物会随着时间的推移而褪色。在室温下，在10-15分钟内几乎没有变化

（<5%）。标准溶液中也会发生同样的变化。

f计算

计算总果聚糖含量（%），如下所示：

式中，a=0.2ml反应溶液的吸光度相对于试剂空白读取；f=将吸光度值转换为ug果糖的系数（=54.5ug果糖/54.5ug果糖的吸光度值）；5=将测定的0.2ml转化为1.0ml的因子;v=所用提取剂的体积（ml）（100或50ml）;1.1/0.2=从1.1ml酶消化物中取出0.2ml用于分析；w=提取的测试浓度的重量（mg）；100/w=以面粉重量的百分比表示果聚糖的因子；1/1000=从ug转换为mg的因子；62/180=从游离果糖转化的因子，已测定的脱水葡萄糖（和脱水葡萄糖），是在果聚糖中发生的。g.指示性控制

指示性控制用于检测测定条件。蔗糖/α-纤维素材料的最终吸光度应非常低（<0.03）。这证明了蔗糖酶处理步骤和硼氢化物还原步骤的有效性。如果蔗糖没有被蔗糖酶完全水解，它将被果聚糖酶混合物水解，产生错误的高果聚糖值。其他指示性对照，如可溶性淀粉和α-纤维素。来自α-纤维素的吸光度应可忽略不计。即<0.001；可溶性淀粉。吸光度应非常低，即<0.03。淀粉的这一结果证明了硼氢化物还原步骤的有效性。

物质巧克力牛奶粉维生素片洋葱表999.03食品和植物材料中总果聚糖的实验室间研究结果，以

g/100g

计

rsdr,%rr

实验室编号离群值平均值

rsdr%1313131000030202013.5210.644.6051.4328.4795.874.7251.638.196.46.77.14.76.62.82.34.77.39.910.49.96.28.75.08.65.710.82.42.00.96.85.37.40.36.81.73.73.11.38.97.013.31.18.32.5果聚糖对照13纯果聚糖10小麦秸秆菊芋1311游离低脂肪13