１４０ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｚｏｏｎｏｓｅｓ 中国人兽共患病学报 ２０１０，２６（２） 文章编号：１００２—２６９４Ｉ２０１０）０２—０１４０一Ｏ４ 奶牛流产鹦鹉热衣原体ｏｍｐＡ基因的克隆与原核表达＊ 宋竹青 ，邱昌庆 ，周继章 ，曹小安 ，蔺国珍 ，郑福英 ，宫晓炜 ，王光华 ，魏彦明 摘 要：目的 表达奶牛源鹦鹉热衣原体ｏｍｐＡ基因，探索其作为诊断抗原的可能性。方法 采用套式ＰＣＲ方法扩增出 了奶牛源鹦鹉热衣原体ｏｍｐＡ基因完整片段，此扩增产物经过双酶切后克隆到表达载体ｐＧＥＸ一４Ｔ＿１中，转化大肠杆菌ＢＬ２１ （ＤＥ３），经ＩＰＴＧ诱导表达后采用ｓＤ ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ—ｂｌｏｔ检测重组目的蛋白的表达结果。结果 重组蛋白经奶牛衣原体 阳性血清鉴定正确。结论ｏｍｐＡ基因在原核表达系统中得到正确表达。 关键词：鹦鹉热衣原体；ｏｍｐＡ基因；克隆；原核表达；奶牛 中图分类号：Ｒ３７４ 文献标识码：Ａ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｏｍｐＡ ｇｅｎｅ ｏｆ Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｓｉｔｔａｃｉ ｉｎ ＣＯＷＳ ＳＯＮＧ Ｚｈｕ—ｑｉｎｇ ’ ，ＱＩＵ Ｃｈａｎｇ—ｑｉｎｇ ，ＺＨＯＵ ｊｉ—ｚｈａｎｇ ，ＣＡＯ Ｘｉａｏ—ａｎ ， ＬＩＮ Ｇｕｏ—ｚｈｅｎ ，ＺＨＥＮＧ Ｆｕ—ｙｉｎｇ ，ＧＯＮＧ Ｘｉａｏ—ｗｅｉ ，ＷＡＮＧ Ｇｕａｎｇ—ｈｕａ ，ＷＥＩ Ｙａｎ—ｒｕｉｎｇ （１．Ｌａｎｚｈｏｕ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ０ｌ，Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｅｔｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ ｏｆ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｌａｎｚｈｏｕ ７３００４６，Ｃｈｉｎａ； ２．Ｇａｎｓｕ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌａｎｚｈｏｕ ７３００７０，Ｃｈｉｎａ） ＡＢＳＴＲＡＣＴ：Ｔｈｅ ｏｍｐＡ ｇｅｎｅ ｏｆ Ｃｈｌａｍｙｉａ ｐｓｉｔｔａｃｉ ｉｎ ＣＯＷＳ ｗａｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｂｙ ＰＣＲ ｗｉｔｈ ｐｒｉｍｅｒｓ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｏｓｅ ｒｅ— ｐｏｒｔｅｄ ｉｎ ＧｅｎＢａｎｋ．Ｔｈｅ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｏｍｐＡ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｉｎｓｅｒｔｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｐｌａｓｍｉｄ ｖｅｃｔｏｒ ｐＧＥＸ一４Ｔ一１ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｉｎｔｏ Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２ １（ＤＥ３）ｗｉｔｈ ＩＰＴＧ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ．Ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＭＤ１ ８一Ｔ ｖｅｃｔｏｒ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ．Ｉｔ ｗａｓ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｉｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ ６８ｋＤ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｓｓ ｗａｓ ｈｉｇｈｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ ａｎｄ ｍｏｒｅ ｐｕｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｏｕｌｄ ｂｅ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ａｆｔｅｒ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｒｅａｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓｅｒａ ｏｆ ｂｏｖｉｎｅ Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ａｓ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｂｙ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ．Ｔｈｅｓｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｔｈａｔ ｔｈｉｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｈｏｗｓ ｇｏｏｄ ｒｅａｃｔｉｖｉｔ３ ａｎｄ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｕｓｅｄ ｔＯ ｄｅｖｅｌｏｐ ｔｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｋｉｔ ｆｏｒ ｂｏｖｉｎｅ Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ａｎｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｖａｃｃｉｎｅ． ＫＥＹ ＷＯＲＤＳ：Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｓｉｔｔａｃｉ；ｏｍｐＡ ｇｅｎｅ；ｃｌｏｎｉｎｇ；ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ 奶牛衣原体性流产是由鹦鹉热衣原体 本研究通过对奶牛衣原体病ｏｍｐＡ基因进行 （Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｓｉｔｔａｃｉ）引起的一种地方性的接触性 克隆，构建了原核表达载体，并在大肠杆菌中进行表 传染病，以妊娠母牛流产、早产、死产或产无活力的 达，对所得的蛋白进行了纯化。旨在为建立ＥＬＩＳＡ 犊牛为主要特征，肺炎，肠炎，关节炎，脑髓炎，乳房 诊断方法的研究奠定基础。 炎等症状都被报道过ｎ 。衣原体属于真细菌，独特 １材料与方法 之处是缺乏独立的能量代谢系统、只能专性寄生于 １．１ 载体及菌株ｐＭＤ１８一Ｔ载体购自大连宝生物 真核细胞内，在细胞内增殖，形成特征性包涵体。衣 工程有限公司；ＢＬ２１（ＤＥ３）感受态细胞购自北京博 原体还有着独特的“二相型”生活周期：在细胞外是 有感染力而无代谢活性的初体，在细胞内是有代谢 ＊国家科技支撑计划项目（２００６ＢＡＤ０４Ａ０５）和国家科技基础性工 活性而无感染力的网状体 。 。有些鹦鹉热衣原体 作专项（２０Ｏ８ＦＹ２１０２００）基金联合资助 通讯作者：邱昌庆，Ｅｍａｉｌ：ｃｑｑｉｕ＠１２６．ＣＯＩＩＩ 株还是人畜共患病原。奶牛流产衣原体是鹦鹉热衣 作者单位：１．中国农业科学院兰州兽医研究所，家畜疫病病原生物 原体种内引起牛流产的株系。衣原体性奶牛流产在 学国家重点实验室，农业部畜禽病毒学重点开放实验 室，农业部公共卫生重点开放实验室，兰州 ７３００４６； 我国各地区广泛流行，造成巨大经济损失¨ 。 ２．甘肃农业大学，兰州 ７３００７０ Ｃｈｉｎｅｓｅ ＪＯｕｒｎａｌ ｏｆ Ｚｏｏｎｏｓｅｓ 中国人兽共患病学报 １４１ 大泰克基因技术有限责任公司；大肠杆菌ＤＨ５ａ， ｐＧＥＸ一４Ｔ ｌ质粒由作者所在实验室保存；奶牛衣原 体ＳＸ５株由作者所在实验室分离鉴定。 １．２ 主要试剂 Ｅｘ Ｔａｑ预混酶、Ｔ ＤＮＡ连接酶、 限制性内切酶Ｈｉｎｄ ＩＩＩ、Ｓｍａ Ｉ、Ｅｆ０Ｒ Ｉ和Ｓａｌ Ｉ， 定，所得阳性克隆测序（由大连宝生物工程有限公司 完成），将获得的阳性重组质粒命名为ｐＭＤ１８一Ｔ— ｏｍｐＡ。 １．６ 表达载体的构建 对ｐＭＤ１８ Ｔ—ｏｍｐＡ和 ｐＧＥＸ一４Ｔ １载体质粒分别进行ＥｃｏＲ Ｉ和Ｓａｌ Ｉ双 酶切，回收后用Ｔ ＤＮＡ连接酶于１６Ｃ连接过夜，连 ＤＮＡ回收试剂盒均购自大连宝生物工程有限公司； Ａ型质粒小型快速提取试剂盒购自北京博大泰克 基因技术有限责任公司；Ｎｏｖａｇｅｎ包涵体提取试剂 接产物转化感受态Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ａ。提取质粒经酶切 和ＰＣＲ鉴定正确后，将重组质粒命名为ｐＧＥＸ一４Ｔ— 盒购自华美生物工程公司。 １．３引物的设计与合成 根据ＧｅｎＢａｎｋ中已登录 的ｏｍｐＡ基因序列，设计合成了２对特异性克隆引 物和１对表达引物。 外套扩增上引物：５，＿ＧＡＧＧＴＧＡＧＴＡＴＧＡＡ— ＡＡＡＡＣＴＣＴＴＧ一３ 外套扩增下引物：５｜＿ＣＡＡＧＧＴＴＧＴＡＡＴＣＴ— ＣＴＡＧＧＴＴＴＣＡ ３ 内套扩增上引物：５ ｒ＿ＴＡＴＧＡＡＡＡＡＡＣＴＣＴ— ＴＧＡＡＡＴＣＧＧＣ一３ 内套扩增下引物：５ ＧＡＴＡＧＣＧＧＧＡＣＡＡＡ— ＡＡＧＴＴＡＧＧＡＴ一３ 表达上引物：５，＿ＡＣＧＧＡＡＴＴＣＴＴＧＣＣＴＧＴ— ＡＧＧＧＡＡＣＣ一３ （下划线为引入的ＥｃｏＲ Ｉ酶切位 点） 表达下引物：５，＿ＴＧＡＧＴＣＧＡＣＧＡＡＴＣＴＧＡ ＡＴＴＧＡＧＣＡＴＴＣＡＴ一３ （下划线为引入的Ｓａｌ Ｉ酶 切位点）；以上弓ｌ物均由大连宝生物工程有限公司 合成。 １．４ ｏｍｐＡ基因的ＰＣＲ扩增 外套扩增：反应总 体积为５０ｆｆＩ ，其组成为Ｅｘ Ｔａｑ预混酶２５ｆｆＬ，外套 扩增上、下引物各ｌ肚Ｉ ，模板（基因组ＤＮＡ）４／ｘＩ ，去 离子水补足至５０ｆｆＬ。内套扩增：反应总体积为 ５０＞Ｉ ，其组成为Ｅｘ Ｔａｑ预混酶２５ｆｆｉ ，内套扩增上、 下引物各１ Ｉ ，外套扩增产物４ｆｆＬ，去离子水补足至 ５０ｆｆＬ。反应条件：外套扩增：首先９５℃充分变性 ５ｒａｉｎ，然后３５个循环，分别为：９４ Ｃ变性１．５ ｍｉｎ； ５２＿Ｃ退火１．５ｍｉｎ；７２℃延伸２ｍｉｎ。７２ Ｃ延伸 １０ｍｉｎ。内套扩增：２０个循环，分别为：９４℃变性 １ｒａｉｎ；５０。Ｃ退火１ｒａｉｎ；７２℃延伸１ｍｉｎ。７２ Ｃ延伸 １０ｍｉｎ。待反应结束后，将ＰＣＲ产物用１０ｇ／Ｌ跑琼 脂糖凝胶电泳，观察结果。使用胶回收试剂盒回收 ０；９／ｐＡ目的基因ＰＣＲ产物。 １．５基因的克隆与鉴定将ＰＣＲ产物与克隆载体 ｐＭＤ１８一Ｔ载体分别用ＨｉｎｄｌＩＩ和Ｓｍａ Ｉ酶切回收 后，按常规方法 连接，转化宿主菌ＤＨ５Ｑ。通过氨 苄青霉素抗性及利用限制性内切酶进行筛选和鉴 ｏｍｐＡ，转化ＢＬ２１（ＤＥ３）感受态细胞，提取质粒进行 酶切和ＰＣＲ鉴定。 １．７重组蛋白的表达及最佳诱导条件的优化 将 含重组质粒的Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１接种于含氨苄青霉素抗 性的ＬＢ培养液中，３７℃振摇过夜。取过夜培养物 以１：１００接种到新鲜的含氨苄青霉素抗性的Ｉ Ｂ 培养液中，摇菌至Ｄ。 值为０．３—０．５时，加入诱 导剂ＩＰＴＧ至终浓度为ｌｍｍｏｌ／Ｉ ，收获细菌。分别 采用不同浓度ＩＰＴＧ，不同温度，不同时间进行诱导 表达。４℃１２ ０００ｒ／ｒａｉｎ离心５ｍｉｎ，回收细菌，进行 ＳＤＳ—ＰＡＧＥ分析。 １．８重组蛋白的可溶性分析及纯化 按照常规方 法进行菌体裂解，超声，离心后取上清液和沉淀，分 别进行ＳＤＳ—ＰＡＧＥ分析。包涵体的提取按照Ｎｏ— ｖａｇｅｎ包涵体提取试剂盒操作进行，然后对提取出 来的包涵体进行电洗脱纯化。并利用紫外分光光度 计测定的纯化后蛋白的浓度。 １．９重组蛋白的Ｗｅｓｔｅｒｎ—ｂｌｏｔ鉴定 应用奶牛衣 原体阳性血清和辣根过氧化物酶标记的兔抗牛ＩｇＧ 酶标二抗进行Ｗｅｓｔｅｒｎ—ｂｌｏｔ鉴定。 ２ 结 果 ２．１ 目的基因的扩增 经ＰＣＲ扩增出来的ｏｍｐＡ 基因片段大小约为１ １７０ｂｐ，与预期目的片段大小 相符，见图１。 ２．２重组质粒ｐＭＤ１８一Ｔ—ｏｍｐＡ的鉴定ｏｍｐＡ基 因ＰＣＲ产物通过Ｔ—Ａ方式与ｐＭＤ１８一Ｔ载体进行 连接，并转化大肠杆菌ＤＨＳａ。把经蓝白斑筛选初 筛到的阳性克隆用碱裂解法进行质粒小量提取。用 Ｈｉｎｄ Ｉｌｌ和Ｓｍａ Ｉ进行酶切，产物经１０ｇ／Ｌ的琼脂 凝胶电泳分析，重组质粒显示２条带，一条大小与１ １７０ｂｐ相近，一条与ｐＭＤ１８一Ｔ质粒大小相近。经 ＰＣＲ扩增出来的片段大小约为１ １７０ｂｐ，与预期目 的片段大ｄ，ｔｇ符见图２。 ２．３重组表达质粒ｐＧＥＸ一４Ｔ ｏｍｐＡ的鉴定 经 初筛后得到的阳性克隆子用大肠杆菌质粒提取法进 行质粒提取，再将重组表达质粒ｐＧＥＸ一４Ｔ—ｏｍｐＡ 用限制性内切酶ＥｃｏＲ Ｉ和Ｓａｌ Ｉ进行酶切，３７｜Ｃ过
