采用一种新型RNAi载体培育转基因高直链淀粉马铃薯

ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9

http://www.chinacrops.org/zwxb/

E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn DOI: 10.3724/SP.J.1006.2009.00809

采用一种新型RNAi载体培育转基因高直链淀粉马铃薯

郭志鸿1 王亚军1 张金文2 张玉宝1 王金牛1 谢忠奎1,* 陈正华3

中国科学院寒区旱区环境与工程研究所, 甘肃兰州730000; 2 甘肃农业大学农学院, 甘肃兰州730070; 3 甘肃亚盛集团博士后科研工作站北京分站, 北京100101

1

摘 要: 采用PCR技术分别克隆nos终止子、烟草axi1内含子和烟草ubi.u4启动子, 亚克隆部分与马铃薯Sbe1同源、部分与Sbe2同源的融合基因SIII, 构建具有“ubi.u4启动子—反向SIII—反向nos终止子—axi1内含子—正向nos终止子”结构的异源3′端UTR反向重复序列型RNAi载体pCUSNI, 采用农杆菌介导法转化马铃薯品种陇薯3号、甘农薯2号和大西洋, 获得了16个转基因植株, 其中14个的块茎直链淀粉含量大幅度增加, 表观直链淀粉含量介于53.80%~85.33%; 但随着直链淀粉含量的升高, 转基因马铃薯淀粉含量下降。半定量RT-PCR分析表明, 在直链淀粉含量超过80%的转基因株系中检测不到Sbe1和Sbe2基因mRNA的积累。结果表明, 异源3′端UTR反向重复序列型RNAi载体pCUSNI能够高频、高效地同时抑制马铃薯Sbe1和Sbe2基因的表达, 是一个优良的RNAi载体。以载体pCUSNI为基础, 再以植物的其他基因为靶, 只需在pCUSNI的BamH I和Xba I位点之间插入干涉片段替换SIII即可完成载体构建, 而不必构建靶标基因的反向重复序列, 使载体制备迅速便捷。 关键词: RNAi; nos终止子; 反向重复序列; 高直链淀粉马铃薯

Development of Transgenic High-Amylose Potato Using a Novel RNAi Vector

GUO Zhi-Hong1, WANG Ya-Jun1, ZHANG Jin-Wen2, ZHANG Yu-Bao1,WANG Jin-Niu1, XIE Zhong-Kui1,*, and CHEN Zheng-Hua3

1

Cold and Arid Region’s Environmental and Engineering Institute, Chinese Academy of Sciences, Lanzhou 730000, China; 2 College of Agronomy,

Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China; 3 Postdoctoral Scientific Research Station of Gansu Yasheng Industrial (Group). Co. Ltd., Beijing Branch, Beijing 100101, China

Abstract: Amylose from potato starch is of great advantage for applications in many fields because of its higher degree of polym-erization and lower gelling temperature compared with cereal starch. However, there is no natural mutant of high-amylose potato. RNAi technique is efficient and specific for plant gene silence but traditional RNAi vector is laborious to prepare. To design an easily-prepared RNAi vector and to develop transgenic high-amylose potato, PCR technique was employed to amplify the nos terminator, the tobacco axi1 and the tobacco ubi.u4 promoter, and to sub-clone a fused fragment SIII which is partially homolo-gous to potato Sbe1 and to Sbe2. Then, a newly designed vector pCUSNI containing “ubi.u4 promotor–antisense SIII–antisense nos terminator–axi1 gene intron–sense nos terminator” was generated and transformed into potato varieties Longshu 3, Gannong-shu 2, and Atlantic by Agrobacterium-mediated transformation. Sixteen transgenic potato plants were obtained, and the amylose content in 14 of them increased significantly, which ranged from 53.80% to 85.33% of total starch. But with the increase of amy-lose content, starch content decreased in transgenic potato plants. Results of semi-quantitative RT-PCR indicated that the accumu-lation of mRNAs for Sbe1 and Sbe2 was not detectable in transgenic plants with amylose content higher than 80%, indicating that the novel RNAi vector pCUSNI was highly efficient for the simultaneous silence of Sbe1 and Sbe2 in potato. The generation of the RNAi vector pCUSNI makes it much easier to prepare RNAi vectors targeting to other plant genes. The only thing is to insert a fragment of the target gene or the target genes in restriction sites between BamH I and Xba I in vector pCUSNI to replace SIII and there is no need to construct an inverted repeat of target gene.

Keywords: RNAi; nos terminator; Inverted repeat; High-amylose potato

本研究由中国科学院农业创新基地三期方向项目(KSCX2-YW-N-46-05)资助。

*

通讯作者(Corresponding author): 谢忠奎, E-mail: wxhcas@lzb.ac.cn

第一作者联系方式: E-mail: guozhhong@yahoo.com.cn

Received(收稿日期): 2008-11-17; Accepted(接受日期): 2009-02-05.

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RNA干涉(RNA interference, RNAi)是近年来发展起来的一种双链RNA (double-stranded RNA, dsRNA)介导的高频、高效、高度特异的基因沉默技术, 已广泛应用于动植物功能基因组研究和代谢途径分析[1-2], 并且在作物改良中也得到成功应用[3-5]。通常采用RNAi技术进行植物改良时需要构建靶标基因的反向重复序列结构, 这不但使得载体构建过程十分繁琐, 并且在同时以两个或两个以上同源性较差的基因为靶标进行干涉时导致外源基因片段太长, 载体较大, 影响后续的遗传转化工作及转基因在后代中的遗传稳定性, 一定程度上限制了RNAi技术在作物改良中的应用。随着对RNAi机制认识的不断深入, 发现小干涉RNA (small interference RNA, siRNA)可以作为引物, 在RNA依赖的RNA聚合酶的作用下合成互补RNA (complement RNA, cRNA), 形成新的dsRNA, 然后被Dicer切割后产生次级siRNA, 导致RNA降解区域向mRNA的5′端延伸[6-9]。基于RNAi的这一特性, 构建异源3′端非翻译区(终止子)反向重复序列型RNAi载体, 将可以引起反向重复序列上游基因及与其上游基因同源基因的mRNA的降解, 从而实现特定基因的沉默。故一旦构建了具有异源3′端非翻译区(终止子)反向重复序列型RNAi载体, 在采用RNAi技术以植物的其他基因为靶标进行植物改良时将不但可以简化载体构建过程, 并且能有效缩短外源基因的长度。

马铃薯直链淀粉具有聚合度高、成膜特性好等突出优点, 在胶片制作、光解膜生产、医药、食品等领域有着其他来源的直链淀粉不可比拟的优势, 但由于马铃薯没有高直链淀粉的天然突变体, 而从普通马铃薯淀粉中分离直链淀粉成本较高, 限制了马铃薯直链淀粉的开发和利用。因此, 培育高直链淀粉含量马铃薯品种, 对于拓展马铃薯淀粉应用领域, 促进马铃薯产业的发展及提高经济效益将具有重要的意义。目前已知淀粉分支酶(starch branching enzyme, SBE)在淀粉生物合成过程中负责催化葡聚糖链中α-1,4糖苷键的断裂, 并于线性链之间引入α-1,6糖苷键从而形成分支, 是支链淀粉形成过程中的关键酶[10]。马铃薯中存在两种同工型的SBE, 即SBEI和SBEII, 并且两者之间存在较强的代偿作用, 单独抑制其中一种基因的表达并不能有效提高马铃薯直链淀粉含量[11-12], 而同时抑制Sbe1和Sbe2的表达, 则可以大幅度提高转基因马铃薯的表观直链淀粉含量[13-14]。本研究拟构建具有植物基因工程中常

用的nos终止子的反向重复序列结构的植物表达载体, 并将部分与马铃薯Sbe1同源、部分与Sbe2同源的融合基因SIII插入烟草ubi.u4启动子和nos终止子反向重复序列之间, 转化马铃薯, 实现对马铃薯Sbe1和Sbe2的同时沉默, 获得高直链淀粉含量的马铃薯。

1 材料与方法

1.1 试验材料

烟草品种NC89、马铃薯品种陇薯3号、甘农薯2号和大西洋、载体pBluescript SK(+)、pBI121、pRNAiIII[15]大肠杆菌菌株DH5α和农杆菌菌株LBA4404均由亚盛集团博士后科研工作站北京分站提供, 限制性内切酶、T4 DNA连接酶和高保真DNA聚合酶购自TaKaRa公司, RNA提取试剂盒Concert Plant RNA Reagent购自Invitrogen, DNA Marker、凝胶回收试剂盒和用于半定量RT-PCR的Taq Mas-terMix购自TIANGEN公司, 尼龙膜(Nylon Mem-brane, positive geladen)和Southern blot探针标记及检测系统均购自Roche, 直链淀粉和支链淀粉标样购自Sigma。其他试剂购自北京化学试剂公司, 均为国产分析纯。

1.2 基因克隆

根据GenBank中公布的pBI121的序列(GI：19569229)设计扩增nos终止子的引物nosu (5′-gcgg ccgcGATCGTTCAAACATTTGGCAATA-3′)和nosl (5′-tctagaTTCCCGATCTAGTAACATAGATGACA-3′), 预期扩增片段大小为258 bp。为方便后续载体构建, 在nosu的5′端引入Not I位点, nosl的5′端引入Xba I位点(引物序列中小写字母部分为添加的限制性酶切位点)。以质粒pBI121为模板, nosu和nosl为引物, PCR扩增nos终止子。根据axi1基因序列(GI: 559920)设计用于扩增其内含子的引物tinu (5′-gcggccgcGTG GTCCATTTCAATTTTGTT-3′)和tinl (5′-gagctcCTGC AAATGTTACAACAAGGCT-3′), (引物序列中小写字母分别表示添加的Not I、Sac I限制性酶切位点), 预期扩增片段大小为182 bp。采用CTAB法提取烟草叶片基因组DNA, 以tinu和tinl为引物, 以烟草基因组DNA为模板, PCR扩增烟草axi1内含子。参照文献[16]合成扩增烟草ubi.u4启动子的引物ubi1 (5′-aagcttGGAGGCTAACTACGTTAGAGC-3′)和ubi2 (5′-ggatccTCTGTATATACAGAAAAGGTT-3′), 小写字母分别表示引入的Hind III和BamH I限制性酶切

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郭志鸿等: 采用一种新型RNAi载体培育转基因高直链淀粉马铃薯 811

位点, 以烟草叶片基因组DNA为模板扩增ubi.u4启动子; 参照文献[15]设计亚克隆融合片段SIII的引物sal (5′-ggatccGAACGAGGACGATCATCATACCA- 3′)和sbu (5′-tctagaTGATGTTGACAGTAAGCCAGTC- 3′), 小写字母分别为BamH I和Xba I限制性酶切位点。然后采用标准分子克隆技术将扩增到的4个片段依次插入载体pBluescript SK+的Xba I与Not I、Not I与Sac I、BamH I与Xba I及Hind III与BamH I位点之间, 送交基因测序公司进行序列测定, 序列分析正确的载体命名为pUSNI。

1.3 RNAi载体构建

将pUSNI经Hind III/Sac I消化后产生的小片段插入植物表达载体pBI121的相应限制性位点之间得到载体pBIUSIN, 再将pBIUSIN经Hind III/EcoR I消化后产生的小片段插入植物表达载体pCAMBIA- 1300的相应位点之间, 得到最终的干涉载体pCUSNI。

1.4 马铃薯遗传转化及植株再生

采用直接导入法[17]将pCUSNI导入农杆菌LBA4404, 获得用于马铃薯遗传转化的农杆菌工程菌。分别以陇薯3号、甘农薯2号和大西洋的试管苗茎段为受体材料, 通过农杆菌介导法进行转化[18]。当获得的潮霉素抗性苗长到2 cm左右时, 切下转入生根培养基进行生根培养。

1.5 转基因植株的筛选

采用CTAB法[19] 提取转化抗性再生苗叶片基因组DNA。以提取的基因组DNA为模板, 以sbu为正向引物, 以sal为反向引物进行PCR检测, 初步筛选得到转基因植株, 然后再对这些植株进行Souhern杂交, 将PCR检测呈阳性的马铃薯植株基因组DNA经Sac I过夜消化后用0.8%琼脂糖凝胶进行电泳分离, 再用20×SSC转移到尼龙膜, 80℃固定2 h后与探针杂交。探针制备以纯化的ubi.u4启动子为模板, 采用随机引物标记法进行标记, 杂交及检测的其他步骤均按照DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I所述方法进行。

1.6 转基因植株的块茎淀粉含量测定

采用组织快繁法, 将筛选出的阳性转基因植株扩繁并移栽到温室中, 待薯块成熟后采用双波长法

[20]

测定淀粉和直链淀粉含量, 计算直链淀粉占淀

粉总量的百分率。直链淀粉含量测定采用的波长为λ1=500 nm和λ2=600 nm, 支链淀粉为λ3=700 nm和λ4=590 nm。每个样品测定3次, 取平均值。

1.7 半定量RT-PCR分析

提取各转基因植株试管薯总RNA, 进行半定量RT-PCR分析, 具体方法参照文献[15]。

2 结果与分析

2.1 基因克隆

以nosu和nosl为引物, 以pBI121质粒为模板进行PCR扩增, 经琼脂糖凝胶电泳在约250 bp处出现特异条带(图1, 泳道1), 大小与nos相符; 以tinu和tinl为引物, 以烟草叶片基因组DNA为模板进行PCR扩增, 得到约200 bp的特异条带(图1, 泳道2), 大小与axi1内含子相符; 以sal和sbu为引物, 以pCUSNI质粒为模板进行PCR扩增, 产生约700 bp的特异条带(图1, 泳道3), 大小与融合基因SIII相符; 以ubi1和ubi2为引物, 以烟草叶片基因组DNA为模板进行PCR扩增, 产生800 bp左右的特异条带(图1, 泳道4), 大小与ubi.u4启动子相符。序列分析表明, 这4个扩增片段的核苷酸序列均与预期一致, 并且插入的顺序与方向也与设计的一致, 说明已成功克隆了nos终止子、烟草axi1内含子、融合基因SIII及烟草ubi.u4启动子, 并获得了含有“ubi.u4启动子—反向SIII—反向nos终止子—axi1内含子”的克隆载体pUSNI。

图1 基因PCR扩增

Fig. 1 PCR amplification of genes

M：DNA marker III; 1：nos终止子; 2：axi1内含子; 3：SIII; 4：ubi.u4启动子。

M: DNA marker III; 1: nos terminator; 2: axi1 intron;

3: SIII; 4: ubi.u4 promoter.

2.2 pCUSNI载体鉴定

构建的pCUSNI载体分别以nosu和nosl及tinu和tinl为引物进行PCR扩增, 分别在约250 bp (图2, 泳道1)及200 bp左右(图2, 泳道2)处出现特异条带, 说明载体中连接有nos终止子和axi1内含子; 经EcoR I/Sac I消化, 在250 bp左右处出现特异条带(图3, 泳道4), 以tinu和nosl为引物进行PCR扩增,

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出现450 bp左右的特异条带(图2, 泳道3), 说明内含子axi1下游端含有正向的nos终止子; 以tinl和nosu为引物扩增, 也在450 bp左右处出现特异条带(图2, 泳道4), 说明axi1内含子上游端连接有反向的nos终止子; 以sbu和sal为引物进行PCR扩增, 在710 bp左右处出现特异条带(图2, 泳道5), 说明干涉片段SIII完整无缺; 经BamH I/ Sac I消化, 在 1 200 bp左右处出现特异条带(图3, 泳道3), 与“融合基因SIII—反向nos终止子—axi1内含子”的大小相符。分别经Hind III/ BamH I消化及以ubi1和ubi2为引物进行PCR扩增, 均产生约800 bp的特异条带(图3, 泳道2; 图2, 泳道6), 说明ubi.u4启动子也以正确顺序和方向存在于载体中。经Hind III/ EcoR I消化, 产生了2 200 bp左右的特异条带(图3, 泳道1), 与“ubi.u4启动子—融合基因SIII—反向nos终止子—axi1内含子—正向nos终止子”大小相符。以上鉴定充分说明成功构建了以马铃薯Sbe1和Sbe2为靶标的异源3′端UTR反向重复序列型RNAi载体pCUSNI, 其表达框架结构如图4所示。

链淀粉含量大幅度升高, 总淀粉中直链淀粉含量最

低为53.80%, 最高为85.33%, 均远远高于转基因受体亲本; 直链淀粉含量大幅度增加的转基因株系占了转基因株系总数的87.5%。其中直链淀粉含量超过80%的株系有4个, 来自陇薯3号的有2个(3A3 和3A6), 来自甘农薯2号的有1个(3A11), 来自大西洋的有1个(3A14)。直链淀粉含量超过80%的株系

(SY)

图2 pCUSNI PCR检测 Fig. 2 PCR detection of pCUSNI

M：DNA marker III; 1：以nosu+nosl为引物扩增; 2：以tinu+tinl为引物扩增; 3：以tinu+nosl为引物扩增; 4：以tinl+nosu为引物扩增; 5：以sbu+sal为引物扩增; 6：以ubi1+ubi2为引物扩增。 M: DNA marker III; 1: amplified with nosu+nosl; 2: amplified with tinu+tinl; 3: amplified with tinu+nosl; 4: amplified with tinl+nosu; 5: amplified with sbu+sal; 6: amplified with ubi1+ubi2.

2.3 马铃薯遗传转化及转基因植株筛选

通过对陇薯3号、甘农薯2号和大西洋试管苗茎段的转化, 获得44个潮霉素抗性再生株系。对其进行PCR鉴定, 结果有16个再生株系在800 bp左右处出现特异条带, 大小与ubi.u4启动子相符, 而作为阴性对照的陇薯3号则未出现相应的条带(图5), 初步说明融合基因SIII已整合到受体材料的基因组中。Southern杂交结果进一步证明这些植株是阳性转基因植株, 并且每个转基因植株只整合了1~2拷贝的外源基因(图6)。16个转基因植株中, 来自陇薯3号的有9个(3A1~3A8和3A15), 来自甘农薯2号的有4个(3A9~3A12), 来自大西洋的有3个(3A13~ 3A14和A16)。

图3 pCUSNI酶切分析

Fig. 3 Restriction analysis of pCUSNI

M: DNA marker III; 1：Hind III/ EcoR I消化; 2：Hind III/BamH I消化; 3：BamH I/ Sac I消化; 4：EcoR I/Sac I消化。

M: DNA marker III; 1: digested by Hind III/ EcoR I; 2: digested by Hind III/BamH I; 3: digested by BamH I/ Sac I; 4: digested by EcoR

I/Sac I.

2.4 转基因马铃薯直链淀粉含量分析

表1结果表明, 16个转基因株系中有14个的直

图4 pCUSNI表达框架示意图

Fig. 4 Schematic diagram of pCUSNI expressing frame

RB：右边界; ubi P：烟草ubi.u4启动子; anti-SIII：反向SIII; anost：反向nos终止子; Tin：烟草axi1内含子; nost：正向nos终止子; CaMV 35S：CaMV35S启动子; HPTII：潮霉素磷酸转移酶基因; poly A：CaMV 35S终止子; LB：左边界。

RB: right border; ubi P: tobacco ubi.u4 promoter; anti-SIII: SIII in antisense oritention; anost: nos terminator in antisense oritention; Tin: tobacco axi1 intron; CaMV35S: CaMV35S promoter; NOS P: nos promoter; HPT II: hygromycine phosphotransferase gene; poly A: CaMV

35S terminator; LB: left border.

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图5 Hyg抗性再生植株的PCR检测

Fig. 5 PCR detection of regenerated plants resistant to Hyg

M：DNA marker V; 1~6：再生植株; 7：陇薯3号。 M: DNA marker V; 1–6: regenerated plants; 7: Longshu 3.

图6 转基因植株Southern杂交

Fig. 6 Southern blotting of transgenic plants 1: 3A3; 2: 3A5; 3: 3A10; 4: 3A11; 5: 3A12; 6: 3A13;

7: 3A15; 8: Longshu 3.

表1 转基因植株直链淀粉和淀粉糖含量

Table 1 The amylose and starch content in transgenic plants

品种(系) 直链淀粉含量 淀粉含量 Variety (line) Amylose content (%)

Starch content (%)

陇薯3号 Longshu 3

23.65±2.35 21.62±1.96

3A1 74.30±2.49 11.92±2.11 3A2 68.20±1.95 14.74±2.36 3A3 85.33±3.80 8.78±2.68 3A4 74.26±2.69 11.01±1.89 3A5 55.86±3.00 16.37±3.02

3A6 81.30±3.03 9.74±2.22 3A7 79.81±1.70 11.32±1.59

3A8 66.33±2.74 15.75±2.38 3A15 23.22±2.86 22.43±1.98 甘农薯2号 Gannongshu 2

23.75±3.36 20.11±2.26

3A9 69.83±2.55 15.04±2.27

3A10 79.96±3.11 10.34±3.37 3A11 85.24±3.58 9.11±1.85 3A12 53.80±3.06 10.74±2.01 大西洋 Atlantic

22.16±1.74 18.53±1.75

3A13 68.12±2.41 15.79±2.26 3A14 83.33±3.29 8.91±1.29

3A16 21.99±2.42 17.98±2.19

直链淀粉含量为占总淀粉的百分率。

Amylose content is the percentage to total starch.

占转基因株系的25%。但转基因马铃薯随着直链淀粉含量的升高, 淀粉含量下降, 并且直链淀粉增加的幅度越大, 淀粉含量下降的幅度也越大。

2.5 转基因株系中Sbe基因的表达水平

各转基因株系Sbe1和Sbe2基因mRNA积累量的分析结果表明, 用内标引物从各株系都扩增到800 bp左右亮度相当的条带, 与预期的Actin基因片段大小相符, 说明用于PCR扩增的模板量基本一致; 作为对照的陇薯3号中可检测到Sbe1和Sbe2 mRNA (图7, 泳道1)的积累, 但在直链淀粉含量超过80%或接近80%的株系中检测不到其积累(图7, 泳道2~ 6), 说明在这些株系中编码SBE两种亚型的基因mRNA积累量极低, 在直链淀粉含量没有明显变化及变化幅度较小的转基因株系中可检测到Sbe1和Sbe2 (图7, 泳道7~10)积累, 说明转基因植株中直链淀粉含量升高是由于Sbe1和Sbe2表达受抑制引起的。

图7 半定量RT-PCR检测Sbe1和Sbe2 mRNA的积累

Fig. 7 Semi-quantitative RT-PCR detection of mRNA derived from Sbe1 and Sbe2

M: DNA marker III; 1: Longshu 3; 2: 3A3; 3: 3A6; 4: 3A11; 5:

3A14; 6: 3A10; 7: 3A15; 8: 3A16; 9: 3A5; 10: 3A12.

3 讨论

异源3′端UTR反向重复型RNAi载体是基于dsRNA

能够引起其5′端序列及与其5′端序列同源基

因的沉默(即

RNAi能向dsRNA 5′端延伸)的原理设

计的。本研究构建了具有“ubi.u4启动子—反向SII

—反向nos终止子—axi1基因内含子—nos终止子”

结构的载体, 由于反向的nos终止子不具备终止转

录的功能, 故转基因植物中外源转基因经转录后就

形成了具有“反向SIII—反向nos终止子—axi1内含子—nos终止子”结构的mRNA, 然后nos终止子通过链内退火形成dsRNA, 激发RNAi机制, 产生小

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siRNA, 然后以siRNA为引物, 在RNA依赖的RNA聚合酶作用下形成反向SIII序列的互补RNA, 使反向SIII区域也出现双链结构, 进而导致与反向SIII同源的mRNA的降解。异源3′端UTR反向重复型RNAi载体作为一个新型的高频、高效的干涉载体, 具有其独到的优势。首先, 构建这种载体十分方便。一旦构建了含有3′UTR的反向重复序列的基本载体, 在针对特定基因构建干涉载体时只需将待干涉基因的部分片段插入到3′端UTR的反向重复序列的上游(5′端), 就可以获得最终的干涉载体。其次, 这类载体中反向重复序列的选择可以使用长度较小的3′端UTR, 从而为在载体中插入较大的干涉片段实现对多个基因的沉默提供方便。本研究选择了的植物基因工程中常用的但长度比较小的nos终止子, 构建了其反向重复序列, 并在该反向重复序列之间引入了一个功能性的内含子axi1, 将其置于双子叶植物中的强启动子烟草ubi.u4启动子的控制之下, 以保证载体具有良好干涉效果。以我们构建的具有nos终止子反向重复序列结构的新型RNAi载体pCUSNI为基础, 在针对特定的植物基因为靶标构建RNAi载体时, 只需在该载体BamH I和Xba I限制性酶切位点之间插入与靶标基因同源的序列即可, 而不必构建靶标基因的反向重复序列。由于nos终止子和引入的烟草axi1基因内含子的片段都比较小, 构建的内含子连接的nos终止子反向重复序列的总长度不超过800 bp, 并且已经包括外源基因阅读框架的终止子, 这为插入更大的干涉片段实现对多个基因的沉默提供了方便。由本研究结果可见, 在16个转pCUSNI的转基因株系中, 14个株系的Sbe1和Sbe2基因的表达均得到有效抑制, 直链淀粉含量大幅度增加, 占了总转基因株系的87.5%, 其中直链淀粉含量超过80%的转基因株系为4株, 占总转基因株系的25%, 说明以nos终止子为反向重复序列的异源3′端UTR反向重复序列型RNAi载体可以高频、高效地沉默两个非同源基因Sbe1和Sbe2的表达, 是作物改良和植物反向遗传学研究中理想的RNAi 载体。

本研究通过同时抑制Sbe1和Sbe2的表达, 实现了转基因马铃薯直链淀粉含量的大幅度增加。外源基因整合到受体材料的基因组中的拷贝数较低(为1~2个拷贝), 并且存在2个拷贝的转基因株系直链淀粉含量升高的幅度大, 而直链淀粉含量升高幅度相对较小或没有明显升高的则为1个拷贝, 一定程度上说明外源转基因的干涉效果存在剂量效应。导

致外源基因拷贝数较低的原因一方面可能与农杆菌介导的遗传转化的特性有关, 另一方面由于RNA干涉效果存在剂量效应, 随着外源基因拷贝数的增加, Sbe1和Sbe2表达被抑制的程度增强。有报道显示, 高效沉默Sbe基因表达的转基因马铃薯植株生长缓慢, 而如果完全抑制Sbe的表达则影响植株再生[14], 故得到的转基因植株均是低拷贝的。通过抑制Sbe1和Sbe2表达提高了转基因植株的直链淀粉含量, 但淀粉总量却有所下降, 这一方面可能是抑制支链淀粉的合成, 导致淀粉总量下降所致; 另一方面可能与高直链淀粉马铃薯块茎的含水量增加有关, 有报道表明转基因高直链淀粉马铃薯块茎含水量远高于受体亲本[14]。

4 结论

异源3′端UTR反向重复序列型 RNAi载体pCUSNI是一个高频、高效的新型RNAi载体, 利用该载体抑制Sbe基因表达能够大幅度提高转基因马铃薯的直链淀粉含量。

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