天然药物盐酸小檗碱的分离提取

小檗碱又称黄连素，是在高等植物中分布比较广泛的、有明显生理活性的化学成分。主要存在于黄连、黄柏、三颗针等中草药中。黄连中小檗碱含量最高，可达10%左右，以盐酸盐的形式存在于黄连中。小檗碱具有显著的抗微生物、抗原虫的作用，临床用其盐酸盐（即盐酸黄连素）治疗细菌性感染如痢疾、急性肠胃炎、呼吸道感染等症。小檗碱属异喹啉类生物碱，自水和乙醇中结晶出来的小檗碱为黄色长针状结晶，含5个结晶水，在100℃干燥时即失去结晶水，转为棕黄色，加热至110℃时，其颜色加深变暗色，45℃-160℃即分解。其中以季铵碱式结构状态最稳定，可以离子化呈强碱性，用过量的氢氧化钾处理小檗碱盐类时，可转变为醇式叔胺碱和醛式仲铵碱，季铵碱式小檗碱可离子化，故有一定亲水性，因此，游离小檗碱能缓缓溶于水，在热水及热乙醇中易溶，而在冷乙醇中溶解度为1：100，但难溶于苯、氯仿、丙酮等溶剂。醇式和醛式小檗碱则具有一般生物碱的通性，难溶于水，易溶于有机溶剂。小檗碱的盐类除中性硫酸盐、磷酸盐外，一般在水中的溶解度均较小。小檗碱还能与苯、氯仿、丙酮等溶剂结合成分子缩合物，有完好的结晶状态，可作为小檗碱的识别之用。如用过量的氢氧化钠处理小檗碱盐类，使其转变为醇式小檗碱，就能与丙酮缩合成结晶型的丙酮小檗碱。黄连素被硝酸等氧化剂氧化，转变为樱红色的氧化黄连素。黄连素在强碱中部分转化为醛式黄连素，在此条件下，再加几滴丙酮，即可发生缩合反应，生成丙酮与醛式黄连素缩合产物的黄色沉淀。一、实验目的1、掌握从中草药中提取、精制生物碱的方法；2、熟悉盐酸小檗碱的化学性质与鉴定方法。3、熟悉用层析色谱法检识天然药物的基本操作。二、实验原理根据小檗碱的盐酸盐在在水中的溶解度小（1：500，微溶于冷水，易溶于沸水，几乎不溶于冷乙醇、氯仿、石油醚），而小檗碱的硫酸盐在水中的溶解度大（1:30溶于冷水，溶于乙醇）。因此，从植物原料中提取小檗碱时常用稀硫酸水溶液浸泡或渗漉，先将药材中的小檗碱转变为硫酸盐用热水提出；然后向提取液中加入氯化钠盐析，再加盐酸，使其由硫酸盐转化为盐酸盐，结合氯化钠的盐析作用降低其在冷水中的溶解度，此时，盐酸小檗碱从溶液中析出，从而制得盐酸小檗碱。三、实验仪器粉碎机，渗漉筒，烧杯，硅胶G-CMA-Na薄层板，真空干燥箱、紫外灯光（365nm）、新华层析滤纸、圆底烧瓶、索氏抽提器（配套出入水管）、家用电吹风机、硅胶G板150*100mm、玻璃点样毛细管（0.3mm*100mm1000支/筒）、层析缸（双槽层析缸，斜底薄层色谱展开缸200*80*高度200）、装订线等。四、实验试剂及材料黄连素、盐酸小檗碱标准品20mg、硫酸、盐酸，甲醇、乙醇、NaOH、氯仿、甲醇、丙酮、乙酸、氨水、氢氧化钙、氯化钠、冰醋酸、硝酸、硝酸银、没食子酸、锌粉、次氯酸钠、碘化铋钾、正丁醇、丁酮、甲酸、异丙醇、乙酸乙酯。五、实验内容1、盐酸小檗碱粗品的制备称取黄连粗粉5g，置于烧杯中，加8-15倍量0.2%硫酸水溶液，使之浸没药面，浸泡24小时。用脱脂棉过滤。滤液加石灰乳中和多余硫酸,调pH=12,静置30min。滤除沉淀,滤液用10%盐酸调至pH2-3,再向滤液中加10%（W/V）量的食盐。拌使完全溶解后，继续搅拌至溶液出现为混浊现象为止，静置30min,滤出沉淀。并用少量水洗涤至中性,抽干。即为盐酸小檗碱粗品（湿）。称重，记录。盐酸小檗碱的精制所得小檗碱还需精制。取所得粗品(未干燥)放入20倍沸水中，搅拌溶解后，继续加热数分钟，趁热过滤。滤液滴加一滴浓盐酸，静置(过夜),滤取结晶，用蒸馏水洗涤数次,抽干，50℃以下真空干燥，即为精制盐酸小檗碱。称重，计算提取率。盐酸小檗碱提取率=盐酸小檗碱质量（干重）/黄连粗粉质量×100%。3、盐酸小檗碱的检识鉴定（选做）（1）丙酮试验：取自制精制盐酸小檗碱约50mg，加蒸馏水3ml，缓缓加热溶解后，加5%氢氧化钠溶液2滴，显橙红色。溶液放冷后，加丙酮4滴振摇，即发生浑浊。放置后，析出的沉淀即为丙酮小檗碱，观察沉淀颜色并记录（显色）。然后取上清液，加丙酮1滴，如仍发生浑浊，再加适量丙酮使沉淀完全；过滤，取滤液2ml，加10%稀硝酸1ml，摇匀，再加0.1m1/L硝酸银试液2滴，即有沉淀产生，观察沉淀颜色并记录（显色）。（2）没食子酸试验：取自制精制盐酸小檗碱约20mg，置白瓷蒸发皿中，加浓硫酸lml溶解后，加5%没食子酸的乙醇溶液5滴，置水浴上加热，观察颜色变化并记录。（显色）（3）锌粉试验：取自制精制盐酸小檗碱约5mg，加水1m1使溶解后，加锌粉少许，再分数次加入浓硫酸数滴，每隔10分钟加一次，观察其黄色是否消退并记录。（4）浓硝酸或漂白粉试验：取盐酸小檗碱少许，加10%的H2SO42ml，平行做两支试管，溶解后一只试管滴加浓硝酸数滴，观察颜色并记录。另一支试管加漂白粉少许（或者少许次氯酸钠），观察颜色并记录。（两管都显（5）盐酸小檗碱的薄层层析（选做）氧化铝薄层层析法。吸附剂：中性氧化铝软板（中性氧化铝Ⅱ级（100-200中性氧化铝FCP级（层析用）），色。）2过160目筛，干法铺板）。样品：①自制精制盐酸小檗碱乙醇溶液乙醇溶液展开剂：①氯仿－乙醇(9:1)②盐酸小檗碱标准品②甲醇－丙酮－乙酸(4:5:1)显色剂：先置于紫外光灯(365nm)下检视荧光，或自然光下观察黄色斑点，再喷雾改良碘化铋钾试剂，观察斑点颜色并与标准品对照。记录图谱并计算Rf值。硅胶G层析法。吸附剂：硅胶G硬板(未活化)样品：①自制精制盐酸小檗碱乙醇溶液标准品乙醇溶液②盐酸小檗碱展开剂：①氯仿－乙醇(9:1)②甲醇－丙酮－乙酸(4:5:1)显色剂：先置于紫外光灯(365nm)下检视，再喷雾改良碘化铋钾试剂，观察斑点颜色，并与标准品对照。记录图谱并计算Rf值。薄层色谱检识。吸附剂：硅胶G-CMC-Na薄层板甲醇溶液对照品：盐酸小檗碱甲醇溶液样品：不同色带的展开剂：CHCl3-MeOH-冰醋酸（7：1：2）检视：先在紫外灯光（365nm）下观察荧光，再喷改良碘化铋钾试剂，记录图谱并计算Rf值。（6）盐酸小檗碱的纸色谱检识支持剂：新华层析滤纸（中速、20cm×7cm）试样：自制盐酸小檗碱乙醇溶液对照品：盐酸小檗碱对照品乙醇溶液展开剂：正丁醇-醋酸-水（4：1：1）显色：紫外灯下观察荧光。六、实验说明及注意事项1、浸泡药材（黄连）粗粉的硫酸水溶液，浓度不宜过高，一般为0.2-0.3％为宜。若硫酸水溶液浓度过高，小檗碱可成为硫酸氢小檗碱（酸式硫酸盐），其溶解度（1：100）明显较硫酸小檗碱（1：30）为小，降低提取效率。硫酸水溶液浸出效果与浸泡时间有关，浸泡12小时约可浸出小檗碱80％，浸泡24小时，可浸出92％。常规提取应浸泡多次，使小檗碱提取完全，本实验中浸出液只收集第1次的浸泡液。2、在pH8.5时小檗胺沉淀较完全，但不易凝聚，故80℃保温，使凝聚而沉降。硫酸小檗碱1:150溶于水，微溶于乙醚。3、在精制盐酸小檗碱过程中，因盐酸小檗碱放冷极易析出结晶，所以加热煮沸后，应迅速抽滤或者保温滤过，防止溶液在滤过过程中冷却，析出小檗碱结晶而阻塞滤材，造成滤过困难，降低收率。4、盐析时，加入氯化钠的量，以提取液量的10%（g/v）计算，即可达到析出盐酸小檗碱的目的。氯化钠过多，溶液的相对密度增大，会造成析出的盐酸小檗碱结晶呈现悬浮状态而难以下沉。盐析用氯化钠用精制食用盐，粗制食盐因混有较多泥沙等杂质，影响产品质量。5、层析检测时需预先要将层析纸在展开剂气氛中饱和15-30分钟,否则分离效果不佳。6、各地产黄连根茎小檗碱及总生物碱含量分别为4.2-6.7%，6.6-9.6%；栽培种比野生种含量少20％左右。黄连除根茎作药材外，各部位均含小檗碱，黄连须根0.8-5.5％，叶为1.49％，老叶为2.5-2.8％，花为0.56％，种子为0.23％。采用不同产地黄连，采用黄连3的不同部位提取小檗碱时，由于小檗碱含量不同，提取试剂应酌情增减。七、思考题1、在提取过程中为什么用稀硫酸冷浸而不用稀盐酸冷浸？2、加入食盐的目的是什么?3、小檗碱的提取分离过程中使用了哪些提取分离方法？4、如果利用黄连叶作原料提取小檗碱时，提取试剂的使用量应如何调整？八、实验教材与参考书1、《生物物质分离工程》，严希康主编，化学工业出版社，2012年，第2版。2、《天然药物化学实验指导》，吴立军主编，人民卫生出版社，2011年，第3版。4