Ｉ试验研究ｌ 。 ｑ 香蕉枯萎病菌拮抗细菌的分离、鉴定 及盆栽防治试验 陆小平 秦斌华、 陆志翔ｚ吴明琼２陈保善３廖咏梅２，３ （’广西壮族自治区水果生产技术指导总站广西南宁５３００２２ 。广西大学农学院广西南宁５３０００４ 广西南宁５３０００４） 。广西大学亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室摘要：采集并分离自广西发病香蕉园的土壤和香蕉组织表面及内生的细菌，筛选对 尖孢镰刀菌古巴专４Ｊ６￣４号生理小种（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｒｕｍ ｆ ｓｐ．ｃｕｂｅｎｓｅ ｒａｃｅ ４，ＦＯＣ４）有拮抗 作用的细菌菌株，并进行盆栽防治试验，以期探索香蕉枯萎病的生物防治方法。 关键词：尖孢镰刀菌古巴专化型４号小种；平板对峙试验；枯草芽孢杆菌；盆栽防效测定 中图分类号￥４３２．４ 文献标识码Ａ 香蕉枯萎病是由尖孢镰刀菌古巴专化型４号生理 小种（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｒｕｍ ｆ．ｓｐ．ｅｕｂｅｎｓｅ ｒａｃｅ ４，ＦＯＣ４） 园采集土壤和香蕉组织并分离细菌，通过平板对峙法 筛选香蕉枯萎病菌的拮抗细菌，鉴定拮抗细菌的种类 侵染引起的一种毁灭性土传病害。其防治研究主要有 化学防治和生物防治两个方面。在化学防治方面，其 并开展盆栽防治试验。现将其试验结果报道如下： １材料与方法 １．１土壤细菌的分离和纯化 研究多停留在平板抑菌试验阶段，鲜见大田防治的 成功例子（郭培钧等，２００９）。由于化学药剂会破坏 土壤微生物多样性，可能导致病原菌的再猖獗，因 此，生物防治已成为该病害防治的研究热点。据报 从广西南宁市西乡塘区坛洛镇香蕉园中，采集健 康香蕉植株根际土壤样品１５份，自然晾干。取各份土 壤样品经ｌ６目筛子过筛后，每份土壤样品称取１０．０ｇ， 混合均匀。称取混合土壤样品５．０ｇ装入有４５．ＯｍＬ无菌 水和２０个玻璃珠的三角瓶中，置于水平摇床（常州 中捷实验仪器，ＳＨＺ～８２）２００ｒｐｍ振荡２０ｍｉｎ，静置 ５ｍｉｎ，取其上清液稀释至１００倍和１０００倍。取各稀释 道，朱利林（２０１ １）从海南发病蕉园的土壤中分离到 具有较好拮抗作用的枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉ］ｉｓ） ＢＬＧ一０１菌株，可以有效定殖在香蕉的根表、根内、 球茎和假茎中，并可持续繁殖，保持一定的数量， 在盆栽试验中防效达７９．８％（朱利林，２０１１）。俞鲁 液１００ Ｌ涂布于ＮＡ（牛肉膏蛋白胨琼脂）培养基上。 置于２８。Ｃ恒温培养箱中培养２４ｈ。挑取菌落特征不一 致的单菌落，划线纯化３次。纯化后的细菌菌株用无 菌水保存在１．５ｍＬ离心管中，４￣Ｃ冰箱保存。 １．２香蕉组织表面或内生细菌的分离和纯化 在南宁市西乡塘区坛洛镇采集健康香蕉植株的 根、球茎、假茎、叶和吸芽，分别用自来水冲洗晾干 等（２０１２）在海南发病蕉园的健康香蕉植株根际土 壤中筛选到具有拮抗作用的解淀粉芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）ＹＬ—ｌ９菌株，该菌株的二次发酵生物 有机肥对抗香蕉枯萎病的盆栽防效达７４％（俞鲁等， ２０１２）。而关于香蕉枯萎病拮抗细菌的资源及应用情 况广西境内未见报道。为此，我们从广西的发病香蕉 ５８ Ｉ中国热带农业 后，用无菌水漂洗３次，每种样品取５ｇ２￣１０ｍＬ无菌水 于无菌研钵中研磨，取研磨液１．ＯｒａＬ，稀释至１０倍和 １００倍，然后取各稀释液１００ Ｌ分别涂于ＮＡ平板上， 于２８ｑＣ下培养２４ｈ。挑取菌落特征不一致的单菌落， 划线纯化３次。纯化后的细菌用无菌水保存在１．５ｍＬ离 心管中，４℃冰箱保存。 １．３平板对峙试验 用ＰＤＡ（马铃薯葡萄糖琼脂）培养基２８ ｏＩ＝培养 ＦＯＣ４（分离自广西南宁）３ｄ，用打孔器于菌落边缘取 一个菌饼（直径７ｍｍ）置于新的ＰＤＡ平板中央，距离 菌饼右侧２．５ｃｍ处划直线接种待测细菌。以不接种细 菌为对照。２８℃培养３～５ｄ，观察记录处理组菌落半 径和对照菌落半径。抑菌率＝ｆ（对照菌落半径一处理 组菌落半径）尉照菌落半径１×１００％。 １．４拮抗细菌发酵液的平板抑菌试验 将１．３筛选到的拮抗细菌接种到液体ＮＡ培养基， ３０２２，１８０ｒｐｍ培养５ｄ，用孔径为０．２２ ｍ的细菌过滤 器过滤除菌获得拮抗菌发酵液。将拮抗菌的发酵液用 培养基稀释５倍、１ ０倍和２Ｏ倍，每个浓度设３个重复。 将ＰＤＡ熔好并冷却至４５℃左右时，分别取相应体积的 发酵液加入培养基中并摇匀，按每］１］］．１５ｍＬ的量倒入 培养皿中，制成相应发酵液浓度的ＰＤＡ平板。培养基 凝固后在平板中央接种ＦＯＣ４的菌饼（直径７ｍｍ），以 不加入发酵液的ＰＤＡ为空白对照，置于２８℃下培养。 待生长５ｄ后，用十字交叉法测量菌落直径，计算拮 抗菌抑制率。抑菌率＝（对照菌落直径一处理菌落直 径），对照菌落直径Ｘ １００％（董汉松，２０１２）。 １。５发酵液对分生孢子萌发的抑制试验 将ＦＯＣ４接人液体马铃薯葡萄糖培养基中，１２０ ｒｐｍ，２８ ２摇床培养２ｄ，通过血球计数板，将ＦＯＣ４分 生孢子悬浮液的浓度调节至２×１０ ｃ￣／ｍＬ，取１０ Ｌ孢 子悬浮液涂布于ＰＤＡ平板。以拮抗细菌发酵液稀释１０ 倍的ＰＤＡ平板为处理组，不加入发酵液的ＰＤＡ平板为 对照组。每个处理３次重复。２８℃，培养２ｄ后观察， 统计平板上的菌落数，计算抑制率。抑制率＝ｆ（对照 组平均菌落数量一处理组平均菌落数量）／对照组平均 菌落数量１×１００％。 １．６拮抗细菌的种类鉴定 拮抗细菌的１６Ｓ ｒＤＮＡ序列测定：将纯化好的菌株 于ＮＡ平板上培养，挑取单菌落进行菌落ＰＣＲ。所用引 物为１６Ｓ ｒＤＮＡ通用引物：ｆＩ）２：５’ＡＧＡ ＣＴＴ ＴＧＡ ＴＣＡ ＴＧＧ ＣＴＣ ＡＧ ３’：ｒＰｌ：５’ＡＣＧ ＧＴＴ ＡＣＣ ＴＴＧ ＴＴＡ ｌＥｘｐｅｒ …ｉ试验研究Ｉ ＣＧＡ ＣＴＴ ３’（欧阳秋飞，２０１４）。ＰＣＲ预期产物为 １５００ｂｐ左右。配制２０ Ｌ反应体系如下：Ｅｓｔａｑ Ｍｉｘ １０ Ｌ，ｄｄＨ２Ｏ ８ Ｌ，正反引物各１ Ｌ（１０ ｔｏｏｌ／Ｌ）， 用灭过菌的枪头蘸取菌落，加入反应体系。按下列程 序进行扩增：９４２２热启动２ｍｉｎ，９４％变性３０ｓ，５５℃退 火３０ｓ，７２２２延ｔＯ２ｍｉｎ，共３０个循环，最后７２％延伸 ｌＯｍｉｎ。用琼脂糖凝胶电泳ＰＣＲ产物，如获得预期大小 的条带，则直接将ＰＣＲ产物送生物公司纯化并测序。 采用ＷＷＷ．ｎｅｂｉ．ｎｌｍ．ｎｌｈ．ｇｏｖ网站中的ＢＬＡＳＴ程序比较分 析测序结果。 生理生化测试：根据１６ＳｒＤＮＡ初步鉴定的菌株种 类，参考《伯杰氏系统细菌学手册》选择所需测定 的生理生化项目，测定菌株的生理生化反应（欧阳秋 飞，２０１４）。 １＿７拮抗细菌规模培养条件的探索 测定拮抗细菌在５种配方的培养液中的菌落数量 变化动态。１号培养液：２％糖蜜＋ｌ％硫酸铵；２号培 养液：２％糖蜜＋４％黄豆粕；３号培养液：４％糖蜜＋ １％硫酸铵；４号培养液：４％黄豆粕＋ｌ％硫酸铵；５号 培养液：２％糖蜜＋２％黄豆粉＋０．５％硫酸铵。将上述 ５种配方加入自来水充分混匀，倒入敞开式的３０Ｌ大桶 中，用氧气泵通人氧气，接人１％拮抗菌液（拮抗细菌 先在液体ＮＡ，３０℃，１８０ｒｐｍ，培养５ｄ），培养３０ｄ。 参照１．４的方法，进行培养液的平板抑菌试验，培养液 处理方式分为２种，一种是过滤除菌体；另一种是不 过滤除菌体。 １．８拮抗细菌的盆栽防效试验 选取１．７试验中筛选出抑制ＦＯＣ４作用最强的培养 液配方培养拮抗细菌，进行盆栽防效测定。 取无病区的土壤作为盆栽土。将４～５叶期的香蕉 苗（威廉斯）栽于盆（直径２０ｅｒａ，深３０ｅｒａ）中，恢复 生长７ｄ后备用。 本试验设置２个处理组和１个对照组，每处理１０棵 香蕉苗。处理组１是用液体ＮＡ培养拮抗菌，处理组２是 用１．７中最优的配方培养拮抗菌，在接种ＦＯＣ４前５ｄ， 将２００ｍＬ的拮抗细菌培养液淋在盆栽香蕉苗根际。对 照组在接种ＦＯＣ４前５ｄ，将２００ｍＬ的未接入拮抗菌的空 白培养液（按１．７中的优选配方）淋在盆栽香蕉苗的 根际。 接种处理：用５０ｍＬ离心管装入２０ｍＬ液体马铃 薯葡萄糖培养基，接入ＦＯＣ４，１２０ｒｐｍ，２８℃摇床培 养２ｄ，然后取５ｍＬ接种于３００ｍＬ的三角瓶，１２０ｒｐｍ， ２０１７．１总第７４期Ｉ ５９ ： ● ｌ试验研究 、 ；Ｘ（ １ ３、ＸＣ２７、ＸＧ３３）抑菌率大于５０％，５株菌株 （ＸＹ３、ＸＹ２ ｌ、ＸＹ２８、ＸＧ１７、ＸＣ２２）抑菌率在 ３０％～５０％之问。 ２８℃培养３ｄ，用血球计数器计算孢子浓度，配制成 １０８ｔ ｆｕ／ｍＬ病原菌孢子悬浮液待用。将香蕉苗从土壤挖 出后，洗干净根部泥沙，将其浸泡于孢子悬浮液中， ２０ｍｉｎ后，重新栽回盆 ，并将１００ｍＬ ＦＯＣ４分生孢子 悬浮液浇灌到靠近根的基部，并用土覆盖。后期根据 天气情况浇水。 调查与记录：接种ＦＯＣ４菌液１５～４５ｄ后，观察蕉 苗发病情况，根据香蕉枯萎病发病蕉苗的病情分级标 准记录发病级别和病株数，计算病情指数。每个处理 取发病严重的植株进行切根观察，统计发病情况。 香蕉枯萎病 栽香蕉苗病害分级标准（黄穗萍 Ａ：ＦＯＣ４］￣落；Ｂ：与Ｊ６—１菌株对峙培养的ＦＯＣ４］￣ 落；Ｃ：与Ｊ３—３菌株对峙培养的Ｆｏｃ４茵落 图１ 部分拮抗细菌平板对峙培养 等，２０１ ３；杨腊英等，２０ｌ４）：０级：外观无可见症 状，解剖球茎和假茎维管束，其中组织未见变褐；１ 级：少量（１０％以下）叶片ｍ现黄化，解削球茎和假 茎维管束，其中组织有少量（１０％以下）褐变；３级： 大量（超过５０％）叶片黄化或倒垂，解剖球茎和假 茎维管束，其中组织有较多（超过ｌ ０％）褐变；５ 级：大量（超过５０％）ｎｔ片黄化或倒垂，假茎基部开 表１ 拮抗细菌的平板抑茵效果 裂，但病株尚未枯死，解剖球茎和假茎维管束，其巾 组织有较多（超过１０％）褐变；７级：病株枯死，球茎 和假茎大量褐变。 病情指数＝｛『∑（发病级数ｘ该级的株 数）１／（最高级数×总株数）｝Ｘ １００％ 发病率＝（发病株数／Ｎ试总株数）ｘ １００％ ２结果与分析 ２．１拮抗细菌的筛选 挑选抑菌率大于４０％日．菌落形态差异比较明显的 ６株菌株（Ｊ３—３、Ｊ６一ｌ、Ｊ７一ｌ，ＸＪ１８、ＸＹ９、ＸＧ２）， 从南宁市西乡塘区坛洛镇香蕉圃中，采集的健 康香蕉植株根际土壤样晶共１ ５份，从经过筛及混合均 匀后的土壤样品中分离纯化得到ｌ２０株细菌菌株（用Ｊ 连续培养２０次后，再次进行平板抑菌试验，发现这６ 株菌株抑菌活性具有较好的稳定性（表１）。 ２．２拮抗细菌发酵液的平板抑菌效果 选取上述６个菌株，用其ＮＡ发酵液（０．２２ ｉｎ 开头编号各菌株）；采集到的健康香蕉的根、假茎、 球茎和叶片样本各１０份，分离得￣１］２００株细菌菌株， 分别用ＸＧ（自根际）、ＸＹ（自叶际或叶内生）和ＸＪ 过滤器过滤）稀释成５、１０、２０倍来进行平板抑菌 试验，其发酵液抑菌率大于９０％的２个菌株是Ｊ３—３和 ｘＪｌ ８（表２，图２），｝＝Ｌ３个浓度下抑菌效果并兀明显 差异。 （自假茎或球茎）编号各细菌菌株。通过平板对峙培 养的方法筛选ＦＯＣ４拈抗细菌，将抑菌率大于３０％的细 菌作为拈抗细菌的候选菌株（ １一Ｂ，网１一（：）。自土 壤样品中筛选 １ １株拮抗细菌候选菌株，其中８个菌 株（Ｊ２—３、Ｊ３—３、Ｊ３—４、Ｊ３—５、Ｊ４—１、Ｊ４—５、Ｊ６一ｌ、 ２．３发酵液对ＦＯＧ４分生孢子萌发的抑制试验 将ＦＯｃ４分生孢子悬浮液的浓度调节至２× １０４ｃｆｕ／ｍｉ ，取ｌ０ Ｌ孢子悬浮液涂布于ＰＤＡ平板，培 养２ｄ后，菌落计数结果如下：不加入发酵液的夺门对 Ｊ ｌ２—３）的抑菌率宽度大于５０％，３个菌株（Ｊ５—４、 Ｊ７—１、Ｊｌ２—４）的抑菌率在３０％～５０％之问．．从香蕉组 织中分离到的菌株中，共筛选｝１＿Ｉ ｌ９株拈抗细菌候选菌 株，其中，１４株菌株（ＸＪ１０、ＸＪｌ ８、ＸＪ２３、ＸＪ４０、 ＸＪ３ １、ＸＪ７、ＸＹ９、ＸＹ３４、ＸＧ２、ＸＧ４、ＸＣ ｌ ２、 照组的３个ＰＤＡ平板 的菌落数分别为：ｌ８１个、１４７ 个和ｌ２９个，而Ｊ３—３与ｘＪ１８发酵液处理的平板ｌ 菌落 数为０（图３）。由此可见，Ｊ３—３和ｘＪｌ ８这２株拈抗菌 ６（）Ｊ中【目热带收 Ｉｋ 试验研究ｌ 表２拮抗细菌发酵液对ＦＯＣ４平板抑菌效果 口口口 Ａ—ｃ：在ＰＤＡ．ＬＦＯＣ４分生孢子萌发情况；Ｄ：在含 ｊ３—３发酵液平板＿ｋ．ＦＯＣ４分￣ｇＥｆｆ－未见萌发产生菌落；Ｅ： 注：同列数据后不同字母表示经ＬｓＤ方法检验在０．Ｏ５ 水平差异显著。 在含ｘＪ１８发酵液平｝￣ｔ＿ｋ．ＦＯＣ４分生孢子未见萌发生产菌落。 图３拮抗茵发酵液对ＦＯＣ４孢子萌发的抑制效果 Ａ：ＰＤＡ平板上的Ｆ０ｃ４茵落；Ｂ：含Ｊ３—３发酵液平板 上的Ｆ（）ｃ４菌落；Ｃ：含ｘＪ１８发酵液平板上的Ｆ０ｃ４菌落 图２ ｊ３—３和ｘｊ１ ８菌株发酵液抑菌效果 株的发酵液对Ｆ０ｃ４分生孢子的萌发具有强烈的抑制作 用，抑制率达１００％。 ２．４拮抗细菌的种类鉴定 用ｌ６ＳｒＤＮＡ通用引物ｆＤ２／ｒＰ１对拈抗细菌Ｊ３—３和 ｘＪ１８菌株进行菌落ＰＣＲ，获得ｌ５００ｂｐ左右的ＰＣＲ产物 （图４）．将ＰＣＲ产物送上海英骏生物技术有限公司 （Ｉｎｖｉｌｒｏｇｅｎ）进行测序，将反馈回来的的序列通过 Ｖｅ｛・ｌｏｒ ＮＴ１进行整理，去掉两端无效序列。得到大小 为１４００ｂｐ左右的有效序列。通过Ｖｅｃｔｅｒ ＮＩＴ进行同源性 比对发现Ｊ３—３和ＸＪｌ８Ｎ个菌株的ｌ６ＳｒＤＮＡ序列完全一 致。将所获序列在ＮＣＢＩ的ＧｅｎｅＢａｎｋ Ｅ进行Ｂｌａｓｔ分析， 图４ 拮抗细菌Ｊ３—３和ＸＪ１８茵株菌落ＰＣＲ￣：物电泳图 与枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ，ＡＢ９７１２０６．１）同源 性最高（覆盖度１００％，同源性１００％）。 Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ标准菌株在Ｖ—Ｐ试验、接触酶、水解明胶、水 解淀粉、硝酸盐还原、吲哚产生、尿素、丙二酸盐、 七叶苷、柠檬酸盐和马尿酸盐这些项目的测定结果 一根据菌落形态观察，Ｊ３—３和ｘＪｌ８菌株的菌落同为 圆形到近圆形，乳自色，突起，菌落边缘整齐光滑， 致（表３）。但ｘＪ１８菌株与枯草芽孢杆菌标准菌株 （ＣＭＣＣ６３５０１）的６个生殚生化指标有差异。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ 菌落比较干（罔５）。 选择ｘＪ１８菌株与枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ） 标准菌株（ＣＭＣＣ６３５０１）（杭州天和微生物试剂有限 公司）进行生理生化测定，发现ＸＪｌ８菌株和枯草芽孢 标准菌株氧化酶反 呈阳性，而ｘＪｌ８菌株呈阴性；在 利用Ｉ 一阿拉伯糖、Ｄ一木糖、山梨醇、乳糖的产酸的 测定中表现不同（表３）；Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ标准菌株对渗透 杆菌标准菌株（ＣＭＣＣ６３５０Ｉ）均可利用蜜二糖、棉籽 糖、山梨醇、ｌ【Ｉ梨糖、甘露醇、甘露糖、乳糖、Ｄ一葡 萄糖、Ｉ 一阿拉伯糖和Ｄ一木糖作为碳源。ｘＪ１８菌株与 压的敏感性高于ＸＪ１８菌株，在ＩＯ％ＮａＣＩ的平板不能生 长（表３）。根据《伯杰细菌鉴定手册》（第八版） （佰坎南等，ｌ９８４），ＸＪｌ８菌株与ＣＭＣＣ６３５０１菌株 ２０ｌ ７ １总第７４期ｌ ６１ ｌ试验研究 表３枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）标准菌株（ＣＭＣＣ６３５ｔ）１）与ｘＪ 菌株生理生化测试 注：＋表示阳性；一表示阴性；±表示边界值，不能准确判断一 国国 Ａ：ｘｊ１８菌株；Ｂ：ｊ３—３菌株 号培养液中１５～２０ｄ达到生长高峰．２０ｄ后生长开始衰 减。取培养２０ｄ的培养液做平板抑菌试验，结果表明 （表５），２号培养基发酵液的抑菌效果最好，抑菌率 达７０．２９％，说明２号培养基发酵效果优于其他配方。 但离心除菌体后，其发酵液抑菌效果明显降低，仅有 １９．０４％的抑菌率。可见，ｘＪｌ８菌株在２号培养液中， ２．６拮抗细菌的盆栽防效 盆栽香蕉苗的防效试验中，处理ｌ：用ＮＡ培养 产生的具有抑菌活性的代谢物质较少。 图５ 拮抗细菌ＸＪ１８和Ｊ３—３菌株的菌落形态 液培养ＸＪ１ ８菌株，５ｄ后淋盆栽香蕉苗根际上壤；处 理２：用２号培养液培养ＸＪ１ ８菌株，１５ｄ后淋盆栽香 在接触酶、渗透压、葡萄糖和甘露糖产、柠檬酸盐产 蕉苗根际土壤，淋拮抗菌５ｄ后接种ＦＯＣ４。在接种 （ＦＯＣ４）４５ｄ后，按照病情分级标准（图６），统计 碱、硝酸还原酶、水解淀粉等鉴定及分种的主要指标 上一致。因此，推断ＸＪ１８是枯草芽孢杆菌。 基于１６ＳｒＤＮＡ的序列分析、菌落形态特征和生理 生化主要指标的测定结果，将ＸＪ１８菌株鉴定为枯草芽 孢杆菌。 ２．５拮抗细菌的发酵条件 各个级别的发病株数，计算病程指数及其防效（表 ６）。与对照组相比，处理１取得了４２．８６％，处理２取 得Ｙ４６．４３％的防效。 ３讨论 自然界中存在着丰富的拮抗菌资源，本试验发现 拮抗细菌枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）广泛地存在 按照５种配方配制的培养液，接入拮抗细菌 ＸＪ１８，统计培养５～２５ｄ之间（每隔５ｄ取样一次）培养 液中菌落数量变化动态。统计结果如表４所示，拮抗 于香蕉种植园的土壤里，香蕉的根际，叶际及香蕉的 组织中。本试验根据１６ＳｒＤＮＡ的序列分析及生理生化 指标的测定，将ＸＪ１８菌株初步鉴定为枯草芽孢杆菌。 细菌ＸＪｌ８菌株在２号培养液中生长状况最好。ＸＪ１８在２ ６２｝中国热带农业 试验研究ｌ 表４ ５种培养液中拮抗菌的茵落计数单位：ｃｆｉ￣ｌｎ１Ｌ 表５ ５种培养液对ＦＯＣ４的抑菌效果 注：同列数据后不同字母表示经ＬｓＤ方法检验在０．０５水平差异显著 圆 Ａ—ｃ：０级（Ａ—Ｂ：地上部分症状，ｃ：假茎及球茎 解剖症状）；Ｄ—Ｆ：１级（Ｄ—Ｅ：地上部分症状，Ｆ：假茎 及球茎解剖症状）；Ｇ—Ｉ：３级（Ｇ—Ｈ：地上部分症状． Ｉ：假茎及球茎解剖症状）；卜Ｌ：５级（卜Ｋ：地上部分症 状，Ｌ：假茎及球茎解剖症状）；Ｍ—Ｏ：７级（Ｍ—Ｎ：地 上部分症状，０：假茎及球茎解剖症状） 图６香蕉盆栽苗病情分级标；隹（接种后第４５ｄｇ￣样） 然而．在生理生化指标的测定中ｘＪ１８菌株与枯草芽孢 也是ｌ００％（覆盖牢１００％）。俞鲁等在海南的发病香 杆菌标准菌株（ＣＭＣＣ６３５０１）除』，一些主要指标相同 外，还有一些指标不尽相同。据文献报道，解淀粉芽 孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｙ ｏ』 ｒ —ｓ）是从枯草芽孢杆菌 蕉 中的健康香焦根际土壤；胡伟等在大豆植株内均 分离到对ＦＯＣ４有强烈抑制作用的解淀粉芽孢杆菌菌株 （俞鲁等，２０ｌ２；胡伟等，２０１２）。所以，ＸＪｌ８菌株 与枯草芽孢杆菌（ ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及解淀粉芽孢杆菌（Ｂ． ￣ｍｙｂ）ｌｉｑｕｅｆａｅｉｅｎｓ）（ＫＰ４１９７２４．１）的遗传关系还有待深 分 来的一个种（邓建良等，２０１０），ＸＪ１８菌株和解 淀粉芽孢杆菌（ＫＰ４１９７２４．１）的１６ＳｒＤＮＡ序列同源性 Ｉ Ｉ试验研究ｌＩ Ｅ 。 ｉ 表６拮抗细菌ＸＪ１８茵株在盆栽试验中的防效（接种Ｆｏｃ４第４５ｄ） 人研究。 据报道，芽孢杆菌属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）的细菌能够产 生多种抗菌物质。其中之一是具有酶类活性的蛋 白，许多芽孢杆菌在代谢过程中会分泌一些对植物 病原菌具有抑制活性的酶类，如几丁质酶、类传感 器激酶（Ｐｕｔａｔｉｖｅ ｓｅｎｓｏｒ ｌｄｎａｓｅ）、芽孢菌霉素Ｄ合 成酶（Ｂａｅｉｌｌｏｍｙｃｉｎ Ｄ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）等（Ｍｏｙｎｅ ｅｔ ａ１． ２００４）。还有一类抑菌物质是小分子物质。例如细菌 素，它是芽孢杆菌在核糖体合成途径中产生的一类具 有抗菌活性的物质。其中枯草菌素（Ｓｕｂｔｉｌｉｎ）是目 前研究较深入的细菌素之一，它具有分子量低、易溶 于水、热稳定性好，抗菌谱广等特点（顾奋觉等， ２００１）。芽孢杆菌在非核糖体合成途径产生的抗菌物 质有脂肽类抗生素、多肽类物质及多烯类抗菌物质、 酚类、异构香豆素和大环内酯类。ｘＪ１８菌株在ＮＡ培 养液中培养５ｄ后，其代谢产物对ＦＯＣ４具有非常好的抑 制效果，可抑制ＦＯＣ４分生孢子的萌发，但在盆栽试验 中并未取得非常理想的效果。推测这可能与病原菌的 接种方式有关，因为盆栽防效试验中采用了病原菌孢 子悬浮液浸根的方法，在从盆中取出香蕉苗时，香蕉 苗的根部会有轻微伤，而香蕉的根际分泌物可能会非 常有利于ＦＯＣ４的分生孢子定殖。ｘａ１８￣否能很好的在 香蕉根际及体内定殖还不是很清楚。当ＦＯＣ４的分生孢 子在香蕉根际有效定殖之后，或许就难以对其产生抑 制作用。ＦＯＣ４是一种土壤习居菌，可以在土壤中腐生 的条件下长时间存活，只有当其达到一定数量时，才 能有效的侵染香蕉。所以大田的实际情况和室内盆栽 防效试验应该是有区别。在ＸＪ１８在２号培养液（４％的 黄豆粕＋２％的糖蜜）中为何抑菌活性的代谢产物比较 少，这应该与该菌的碳源、氮源的利用情况有关，什 么才是大田施用最合适的碳、氮源还需进一步研究。 对于大田应用方面，可以探索优化其培养，发酵 的条件，产生更多具有抑菌活性的物质。还可以尝试 使用固体，半固体的有机肥料来增殖拮抗细菌，通过 ６４』中国热带农业 施用含有大量拮抗菌的有机肥来改变土壤及香蕉根际 的微生态环境，改善发病蕉园土壤的微生物群落多样 性，减少香蕉枯萎病的发病率。 参考文献 Ｉ１】 邓建良，刘红彦，刘玉霞，等解淀粉芽孢杆菌ＹＮ一１抑制植 物病原真菌活性物质鉴定Ｕ１．植物病理学报，２０１０，４ｏ（２）： ２０２－２０９ ［２１ 董汉松．植病研究法【Ｍ】．北京：中国农业出版社，２０１２：５７—６２ 【３３ｊ 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