)JournalofJilinUniversitScienceEditiony(
吉林大学学报(理学版)
Vol.59 No.3
Ma 2021y
:/doi10.13413.cnki.dxblxb.2021044jj
液相色谱高分辨串联质谱法检测-牛奶中A酪蛋白1和A2β-(吉林大学地下水资源与环境教育部重点实验室,新能源与环境学院,长春11.30012;
)2.中国计量科学研究院化学计量与分析科学研究所,北京100029
刘泽阳1,李 明2,吴佩泽2,宁 杨1,梁大鹏1
/摘要:建立一种基于液相色谱高分辨串联质谱(方法检测牛奶中A-LC-HRMSMS)1和A2
酪蛋白.采用等电点沉淀法从牛奶中提取酪蛋白,经胰蛋白酶酶解后,将酶解产物进行-β/第6的肽段作为特征肽段对ALC-HRMSMS分析,选择含有差异氨基酸残基(7位)1和A2酪蛋白进行区分.采用T-risHCl缓冲溶液充分溶解酪蛋白,在酶解反应体系中添加乙腈以-β提高酶解效率.采用高分辨质谱和串联质谱技术,进一步排除杂质产生的干扰信号.采用该方法对市售4种普通牛奶和2种A酪蛋白的含量约2牛奶进行检测,结果表明,普通牛奶中A1-β酪蛋白,具有高可靠性、高灵敏度等优点,为AA1和A2-2奶源筛选和质量控制提供支持.β关键词:酪蛋白;-A2牛奶;液相色谱;串联质谱β()中图分类号:O615.4 文献标志码:A 文章编号:1671-5489202103-0696-07为A酪蛋白含量的2酪蛋白.该方法可检测牛奶中的2-~4倍,个别A2牛奶样品含微量A1-ββDeterminationofA1andA2β-CaseininMilkbiuidyLqChromatorah-HihResolutionTandemMassSectrometrgpygpy
(1.KeaboratorroundwaterResourcesandEnvironmentoheMinistrducation,yLyofGftyofE2.DivisionohemicalMetrolonalticalScience,NationalInstituteoetroloBeiin00029,China)fCgy&AyfMgy,jg1
12211
,LIUZeanLIMineizeNINGYanLIANGDaenyg,g,WUPg,pg
ColleeoewEnerndEnvironment,JilinUniversitChanchun130012,China;gfNgyay,g:WAbstracteestablishedamethodbasedonliuidchromatorahhihresolutiontandemmassqgpyg-/sectrometrLC-HRMSMS)todetectA1andA2β-caseininmilk.Caseinswereextractedfrompy(,a,tmilkbsoelectricpointpreciitationmethodftertrsinhdrolsishehdrolsateswereyipypyyyy
/analzedbC-HRMSMSmethod.Thepetidecontaininariedaminoacidmoiettthe67thyyLpgvyaositionwasselectedascharacteristicseciestodistinuishA1andA2β-casein.CaseinwasfullppgydissolvedinTrisHClbuffersolution.Theacetonitrilewasaddedtotheenzmatichdrolsissstemyyyy-
toimrovetheenzmtichdrolsisefficienc.HihresolutionmasssectrometrndtandemmasspyyyygpyaandtwokindsofA2milkweretestedbhismethod.TheresultsshowthatthecontentofA1yt
-caseinisabout2—4timesthatofA2β-caseinincommonmilk,whileasmallamountofA2milkβ收稿日期:2021-01-25.
,男,汉族,硕士研究生,从事环境分析化学的研究,E:第一作者简介:刘泽阳(1993—)-mailzean716@q.com.通信作者ygq)基金项目:国家重点研发专项基金(批准号:2017YFF0205403.
sectrometrereusedtoeliminatetheinterferencesinalofimurit.Fourkindsofcommonmilkpywgpy
,男,汉族,博士,副教授,从事环境化学和环境污染控制的研究,:简介:梁大鹏(1978—)E-mailliand@lu.edu.cn.gpj
第3期高分辨串联质谱法检测牛奶中A酪蛋白 刘泽阳,等:液相色谱-1和A2β- 697
samlescontaintraceA1-casein.ThismethodcandetectA1andA2-caseininmilkwithadvantaespgββ,wofhihreliabilitndsensitivithichprovidessuortforA2milksourcescreeninndqualitgyayppgaycontrol.
:;;Kewords-caseinA2milk;liuidchromatorahtandemmasssectrometrqgpypyyβ[]
酪蛋白约占牛奶中蛋白含量的8酪蛋白,其中β酪蛋白约占0%1,酪蛋白主要包括α,--β和κ[]
酪蛋白的变体形式,其中最主要的两种是A酪蛋白(简称40%2.目前已发现超过10种β-1和A2β-[3]
A1和A2蛋白).A1和A2蛋白唯一区别在于其一级结构的第67位氨基酸,A1蛋白为组氨酸[4](,H),,HistidineA2蛋白为脯氨酸(ProlineP).尽管两种酪蛋白的差别微小,但在人体内消化时会
]56]
(),而A产生不同的生物活性肽[酪啡肽可诱发多种疾病[.A1蛋白产生的β--7BCM-72蛋白则不产[][][][0]
生B中CM-77.研究表明,经常摄入A1蛋白的人群在Ⅰ型糖尿病8、胃肠感染9和缺血性心脏病1
]的发病率高于摄入A研究表明,患自闭症儿童尿液中的B2蛋白的群体.文献[11CM-7含量明显高于入不同酪蛋白引起的不同结果已得到广泛关注.为区分酪蛋白,本文将仅含有A2蛋白的牛奶标为“,以此为消费者提供针对性选择.因此,开发一种区分牛奶中AA2牛奶”1和A2蛋白的检测方法具有重要意义.
检测牛奶及乳制品中β酪蛋白种类的方法较多,如通过电泳法结合多元线性回归(可初步判-MLR)
][4]13
,尿素,也可通过中红外断奶酪中的酪蛋白种类[聚丙烯酰胺电泳可区分牛奶中的A-1和A2蛋白1
15]16]
光谱法[或聚合酶链式反应[对牛奶中的蛋白质进行分析,确定蛋白质的组成和含量.近年来,色谱[2]
,但摄健康儿童,且其BCM-7的浓度与病情严重程度正相关.尽管关于BCM-7的危害尚存在争论1
和质谱技术的快速发展为各领域提供了高灵敏度、高精度和高可靠性的检测方法.液相色谱可分离牛
17]
奶中不同的酪蛋白,高分辨质谱在检测完整蛋白质方面具有非常高的可靠性和灵敏度[.但是不同酪
蛋白间的差异很小,它们通常具有相似的物理、化学性质,增大了液相色谱的分离难度.因此,通过对
]18酪蛋白酶解产生的特征肽段确定β酪蛋白种类是一种更可行的方法[-.
/)本文建立一种基于液相色谱高分辨串联质谱(的检测方法,通过检测特征肽段区-LC-HRMSMS
/LC-HRMSMS对酶解产物进行分析.考虑到A1和A2蛋白差异点在第67位氨基酸,所以选择酶解
后的蛋白片段49~97作为特征肽段.除色谱保留时间和一级质谱质荷比数据外,通过诱导碰撞解离A2奶源筛选和A2乳制品的质量控制提供技术支持.
(模式的二级质谱实验对特征肽段进行分析,提高了结果的可靠性.为验证方法的实用性,对市CID)
售4种普通牛奶和2种A2牛奶进行检测.结果表明,本文方法具有高可靠性、高灵敏度等优点,可为
分牛奶中的A1和A2蛋白.先用等电点沉淀法提取牛奶中的酪蛋白,经胰蛋白酶酶解后,再采用
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
;;日本日立公司)美国MCR21GⅢ型高速冷冻离心机(FE20-K型pH计(ettlerToledo公司)
;ME;ME英国S德国SSI500型振荡培养箱(tuart公司)614S型电子分析天平(artorius公司)36S型电;M;子分析天平(德国S美国Fartorius公司)illiQInteral3型超纯水仪(isherScientific公司)g-;美国T美国1250系列色谱仪(hermoFisher公司)VelosPRO型(LTQ)-Orbitrap高分辨串联质谱仪(;ThermoFisher公司)C18色谱柱(150mm×4.6mm,2.6μm,10nm,美国Phenomenex公司).)、牛胰蛋白酶、牛β聚乙二醇辛基苯基醚(酪蛋白和乙腈购自美国STritonX-100-imaAldrich公g-)司;氯化钠(质量分数为9购自德国S购自北京G9.99%)uraur公司;三羟甲基氨基甲烷(TrisPC生pp特征肽标准品购自广东赛百威信息科技有限公司.牛奶样品购自长春市某超市.
物科技有限公司;盐酸(购自北京化工厂;甲酸(体积分数为9购自瑞士FGR)8%)luka公司;A1和A21.2 样品预处理
/),混匀,取10mL牛奶样品,加入40mL的TrisHCl溶液(50mmolL,H=8.560℃恒温振p-
698 吉林大学学报(理学版) 第59卷
/荡1h.取15mL上述溶液,加入15mLNaCl溶液(0.5molL,含体积分数为0.2%的聚乙二醇辛基/,加水定容至1m白酶(0.7mmL)L后,加入330μL乙腈.37℃恒温反应6h,用20μL体积分数g
/,)为1后,取上清液备用.0%的甲酸溶液终止酶解反应,样品离心(10000rmin10min/度洗脱程序:50min内将流动相B从5%线性提升至55%;进样体积:10μL;流速:0.3mLmin.
)质谱.电喷雾电离(正离子模式;电压:+2kESIV;鞘气:10;辅助气:2;吹扫气:0;毛细管温/:度:375℃;轨道阱分辨率:300000;质量范围(mz)150~2000;CID碰撞能:24eV.
[9]
,用甲酸溶液将其p/,)苯基醚)后,于4℃静置过夜.离心(H值调至4.614℃,10000rmin15min
分离出沉淀的酪蛋白.用25mL的TrisHCl溶液再次溶解沉淀,取500μL复溶液加入100μL胰蛋-
质谱条件1.3 色谱-色谱.流动相A:体积分数0.1%的甲酸水溶液;流动相B:体积分数0.1%的甲酸乙腈溶液;梯
1.4 数据处理
®
质谱数据通过仪器配备的X软件进行处理;caliburA1和A2蛋白被胰蛋白酶酶解后产生的肽段序计算特征肽段的一级质谱和CID产物离子的理论数据.
:///_c/)序列由网站(提供的Phttsweb.exas.oretideutteretideCutter工具进行计算;利用网ppygppp-://///?-)站(提供的M程httsrosector2.ucsf.edurosectorcibinmsform.ciform=msroductS-Productpppppggp
2 结果与讨论
2.1 酪蛋白提取与酶解
]20
,有助于展开蛋白质为充分溶解蛋白质,通常用尿素和二硫苏糖醇等搭配无机盐配制缓冲溶液[)质谱(分析前需进行脱盐处理.但脱盐处理操作繁琐,耗时长且容易导致样品损失,因此本文LC-MS开发了一种不引入盐杂质的蛋白质提取和酶解方法.采用TrisHCl水溶液提取酪蛋白,在充分沉淀后-经低温离心分离酪蛋白.低温离心可减少乳蛋白中疏水基之间的相互作用,防止乳清蛋白和酪蛋白聚
]21
集[酪蛋白标准品和牛奶样品中提取的酪蛋白均未展现良好的酶解效果,这是.但在酶解实验中,-β22]由于溶液中的酪蛋白处于折叠结构所致.因此,在酶解体系中加入可使蛋白质变性的乙腈试剂[.添
空间结构,从而提高蛋白质提取和酶解效率.为避免污染检测器,含有这类缓冲液的样品在液相色谱-
加乙腈显著提高了酶解效率,同时乙腈作为液相色谱分离中的流动相B,无需在质谱检测前进行去除.2.2 液相色谱分离与质谱全扫描
/使用A优化梯度洗脱程序.由于胰蛋白酶特异性切割1和A2特征肽混合标准品溶液(15μmL)g
23]
,因此选择包含第6蛋白质中碳端的赖氨酸和精氨酸残基[7位氨基酸残基的蛋白片段49~97作为区分A1和A2蛋白的特征肽段.研究表明,核壳结构填料的C18色谱柱对相似结构的多肽分离效果优A1和A2蛋白的特征肽段可完全分离.分离后的肽段进入高分辨质谱进行全扫描分析,结果如图2所示.
在一级质谱图中,A1和A2蛋白的特征肽具有不同的带电荷情况,其中四电荷A1特征肽离子(/:)/核质比(和三电荷A的信号最强,特征肽段带电荷存mz)1340.722特征肽离子(mz:1773.95)
]25
,即A在差异是由于二者的氨基酸组成不同所致[1特征肽比A2特征肽多一个碱性氨基酸残基
(:////67位组氨酸).2条特征肽段检测到的分子量数据与理论数据(httswww.sisweb.commstoolsp]24
,因此用其对A异[1和A2蛋白酶解后的特征肽段进行分离,结果如图1所示.由图1可见,经优化后,
经优化,最终确定体积分数为25%的乙腈对酶解效率提升最明显.
一致,质量偏差均小于4×1isotoe.htm)0-6.A1和A2特征肽段的相关信息列于表1.p2.3 牛奶中A1和A2蛋白的测定奶,5,6为A2牛奶.
为验证该方法的实用性,选取市售的4种普通牛奶和2种A2牛奶进行分析,编号1~4为普通牛
/采用L酪蛋C-HRMSMS方法,通过A1和A2特征肽的色谱保留时间和一级质谱数据可确定β-白的变体形式.若样品中存在保留时间相近且相对分子质量相似的杂质,则会产生不易分辨的干扰信号.用串联质谱的二级质谱模式对其优化,可提高检测结果的可靠性.将特征肽进行串联质谱CID分
第3期高分辨串联质谱法检测牛奶中A酪蛋白 刘泽阳,等:液相色谱-1和A2β- 699
析,对碎片离子信息进行解析和标注,结果如图3所示.由图3可见,碎片离子与理论数据吻合.
Fi.1 ExtractedionchromatorahfA1characteristicpetide(A)andA2characteristicpetide(B)ggpyopp/inmixedstandardsolution(15μmL)ofA1andA2characteristicpetidesgp
/图1 A中A和A的提取离子色谱1和A2特征肽混合标准品溶液(15μmL)1特征肽(A)2特征肽(B)g
图2 分离后肽段的高分辨质谱
Fi.2 Hihresolutionmasssectrometrfsearatedpetideggpyopp
表1 A1和A2特征肽段的相关信息
Table1 RelatedinformationofA1andA2characteristicpetidesp
特征肽段A1A2
氨基酸序列
IHPFAQTQSLVYPFPGPIHNSLPQNIPPIHPFAQTQSLVYPFPGPIPNSLPQNIPPLTQTPVVVPPFLQPEVMGVSKLTQTPVVVPPFLQPEVMGVSK
理论相对分子质量5355.895315.8
实测相对分子质量5355.885315.85
相对分子质量偏差1.9×10-63.8×10-6
2种特征肽碎裂后信号最强的碎片离子,所以选择该信号构建A1和A2特征肽的EIC,结果如图4所
示.牛奶样品中A1和A2蛋白的相对含量如图5所示.由图5可见:在1~4号牛奶样品中可同时检
可排除样品中可能存在的具有相似保 相比于一级质谱,从二级质谱中得到的提取离子色谱(EIC)
留时间和质量的杂质,进一步提高了分析方法的可靠性和准确性.在二级质谱中,碎片离子y13是测到A1和A2特征肽,根据峰面积半定量分析,普通牛奶中A1蛋白约为A2蛋白含量的2~4倍;
700 吉林大学学报(理学版) 第59卷
5号牛奶样品中仅存在A2特征肽信号;6号牛奶样品中出现强度较小的A1特征肽信号,其信号强度明显低于其本身的A酪蛋白,可能是由于筛选A2特征肽信号,表明该样品中存在少量A1β-2奶源所
Fi.3 CIDsectraofA1(A)andA2(B)characteristicpetidesinmilksamlesgppp
((图3 牛奶样品中A和A特征肽的C1A)2B)ID谱
第3期高分辨串联质谱法检测牛奶中A酪蛋白 刘泽阳,等:液相色谱-1和A2β- 701
用的分析方法灵敏度较低所致.
/)图4 牛奶样品A提取二级质谱中的最强信号m1和A2特征肽的提取离子色谱(z:1428.92Fi.4 ExtractedionchromatorahfA1andA2characteristicpetidesinmilksamlesggpyopp
(/themostintensitsinalmz:1428.92extractedfromsecondarasssectrum)ygymp
高 综上所述,本文建立了一种基于液相色谱-分辨串联质谱方法,通过检测蛋白被酶解后的特征肽段测定牛奶中的A1和A2蛋白.在蛋白提取和
酶解的样品处理中,采用TrisHCl作为缓冲液,乙-腈作为蛋白变性剂,简化了实验操作,缩短了实验时间.利用检测特征肽段实现了A酪蛋1和A2β-白的鉴别,避免了完整蛋白质分析法中色谱分离难等缺点.通过液相保留时间、高分辨一级质谱和串
联质谱分析,进一步排除了可能产生的干扰信号,图5 牛奶样品中A酪蛋白相对含量示意图1和A2β-提高了方法的可靠性.通过对市售6种牛奶的分Fi.5 Schematicdiaramofrelativecontentsofgg析,该方法具有较高的稳定性和灵敏性,可帮助企业开发A2产品和服务政府部门进行质量监管.
参
考
文
献
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