纯蛋白质测定

纯蛋白质测定

(一)沉淀分离后消化测定(凯氏法)

一、原理方法：

样品经水溶去蛋白态氮，用重金属盐沉淀分离出蛋白质，用开氏法消化使氮转化为NH4+-N，用电极法测定NN4+的含量，然后计算蛋白质的含量。

主要反应式：

2NH2(CH2)2COOH + 13H2S04 → (NH4)2S04 + 6CO2 + 12S02 + 16H20

二、试剂：

1．6％CuS04：60gCuS04·5H20溶于1000ml水。

2．1．25％NaOH：12.5gNaOH溶于1000ml水。

3．5％BaCl2：10gBaCO2溶于200ml水。

4．浓H2S04(三级)。

5．1：10CuS04·K2S04：10gCuS04·5H20加100gK2SO4，研磨，混匀。

6．10mol/l NaOH：40g NaOH溶于100ml水。

7．0.5％酚酞：0.5g酚酞溶于100ml 95％乙醇。

8．5mol/lNaOH：20gNaOH溶于100ml水中。

9．标准溶液：取分析纯NH4Cl 5.3497g溶于水，定容为1000ml，此为10-1mol/l NH4C1标准液，依次稀释为10-2 ­ 10-5mol/l标准液。

三、主要仪器：

开氏瓶、电炉、离子计、磁力搅拌器、氨气敏电极。

四、操作步骤：

1．取样品0.5 ~ 1g → 150ml烧杯中。

2，加50ml水，在50OC加热10分钟。

3．趁热慢慢加入25ml 6％CuSO4溶液，边加边搅。

4．加入25m1 1.25％NaOH溶液，搅动。

5. 放置半小时以上，使上层澄清，将上层清液倾入漏斗过滤。

6. 在沉淀中加热水搅动洗涤，待澄清后再滤去，如此洗几次后，用小试管接取滤液，滴加BaCl2溶液检验，至无白色BaS04生成为止，将全部沉淀转入滤纸；用水洗净烧杯，并用水将沉淀洗到漏斗中央。

7．待水滤净后，将沉淀连同漏斗置于烘箱中(80OC)烘干。

8．取出滤纸和沉淀，小心卷成筒状，塞进150ml开氏瓶中，加20ml浓H2S04，摇碎滤纸和沉淀物，放置过夜。

9．加入1：10的CuS04：K2SO4 5g，在电炉上消化至透明澄清(带蓝绿色溶液)，再消煮20分钟，冷却。

10．消化溶液先用水稀释，冷却后，转入250ml容量瓶，用水定容。

11．吸取此溶液10ml → 25ml容量瓶中，加酚酞1滴，用5mol/l NaOH中和至微红色，用水定容。

12．将溶液全部倒人干的小烧杯中，放人磁力搅拌棒，置于磁力搅拌器上。

13．将氨气敏电极和参比电极{甘汞电极}浸入待测液中，开启搅拌器，加10mol/lNaOH溶液5滴，待离子计上读数稳定时读出mV数，由标准曲线查取溶液NH4+—N浓度。

同时做空白。

标准曲线：分别取10-5→ 10-2mol/l NH4C1标准溶液25ml，置于小烧杯中，同操作12—13进行，读取mV数。在半对数纸上，以NH4+浓度对mV数作曲线，或是在直角座标纸上，以mV数为纵轴，NH4+浓度的负对数(5 ~ 2)为横轴，作标准曲线 。

五、计算：

蛋白质％ = {[c * 250 * (25/10) * 0.014 * 6.25] * 100%}/W

式中：c：由标准曲线查得的测定溶液中NH4+—N的浓度。

0.014：氮的毫克分子重量(g)

6.25：由氮换算为蛋白质的系数

W：样品重(g)

六、注意事项：

1．用Cu(OH)2沉淀蛋白质沉淀速度快，容易得到透明溶液，但有些氨基酸也能生成铜盐沉淀，使结果偏高。沉淀蛋白质常用的还有Pb(OAc)2、单宁等试剂。

2. 样品的粒度：一般过40目筛即可，如太粗，非蛋白态氮不容易完全溶出；过细时，某些含淀粉多的样品易成糊状而使得过滤困难。

3. 米、面等样品含淀粉多，煮沸时会糊化粘结而使过滤十分困难，因此本实验不煮沸而是

采用500C加热10分钟的方法去除可溶部分。

4．沉淀蛋白质要趁热在不断搅拌下滴加沉淀剂，以避免生成大体积固体沉淀，增加过滤困难，如难以过滤，可用离心法洗净分离沉淀。

5．沉淀蛋白质时，溶液要调到近中性，蛋白质才能沉淀完全，但加入的NaOH不能过多，否则会导致蛋白质溶解损失；加有较多的CuS04，可抑制碱性干扰。

6．沉淀烘干温度可用80一100℃，温度过高，容易结壳，而且使滤纸和沉淀发硬易脆,造成损失；温度太低，烘干时间长。烘干程度要适宜，以稍干而不脆为好，如水份过多，不仅装入开氏瓶时易破损，而且将大大增加消煮时间。

7．包装时，滤纸包住沉淀物，卷成条状塞进去，如有沉淀物沾在瓶口，可用小块滤纸擦净 放入开氏瓶内。

8．蛋白质消煮时，容易产生大量泡沫，不小心会溢出瓶口使实验失败。为减少泡沫，加浓H2S04后先放置过夜；在开始加热时小心控制温度，待泡沫消失后再加大火力；如泡沫上冲剧烈，应停火，必要时可加纯石腊(蚕豆大小)消泡。

9．消化加H2SO4的量取决于样品量和性质，小于1g的样，加8ml H2S04，每加1g，要加H2SO4 6 ~ 12ml。富含脂肪的样品应多加些H2S04，如投入开氏瓶较多的滤纸，也应适当多加H2S04。

10. 消煮时应在有H2S04部位加热，瓶壁沾附物应经常摇动使其流入H2S04中，不使其因高温而干枯损失。

11．CuS04作催化剂用，注意Cu2+催化时在400OC以上可能有氨损失，K2S04的作用是增温，加速反应。K2S04的用量与沸点的关系如下：

K2SO4浓度g／ml (H2SO4) 0 0.5 1.0 1.5 2.0

沸点℃ 329 344 365 388 410

12．消化液如不易透明，可取下开氏瓶，冷却后滴加少量H202，消煮，以加速氧化，注意 H202不可多加。

13．消化好的溶液应清亮透明无黑点，消煮好以后先用水稀释，冷却后再转入250ml或 100ml容量瓶。

14. 用电极法测定之前，溶液应调到近中性，以便加入一定量碱后溶液pH达11以上，而且各测定液的pH条件能一致，调中性可用甲基红或酚酞作指示剂，颜色不妨碍电极测定，注意加碱量不可过多。

15．氨气敏电极法测NH4+—N，溶液pH应>11，使NH4+转化为NH3，扩散人电极内测定，注意加NaOH不能过多，以免造成NH3的挥发损失,加NaOH时必须不断搅拌，一是避免局部过浓而使NH3损失，二是加速NH3向电极内扩散，加NaOH后不可久放，必须立即测定,加入浓NaOH的量要一致，以保持待测液的体积一浓度基本不变。

16，应等电位稳定后再读数，由于NH4+浓度不同和电极性能的差异，响应稳定时间一般，要1 ~ 3分钟以上，NH4+浓度高时，响应和稳定较快。

17．各样品溅定时搅拌速度和溶液温度要一致，否则对测定值有影响，搅拌棒每用一次后;须洗净擦干再用。

18．每测一样晶后，需用纯水洗电极至电位(mV)低于本次实验中最低标准溶液的电位值，但这个过程有时是很慢的，可以用稀H2S04洗电极以加速电位回到空白值。一般在测

过浓溶液后测稀溶液之前，需洗电极电位至一定值以下，而由稀溶液转入浓溶液测定之前，则稍洗即可，不一定洗至空白电位值。

19. 由N换算为蛋白质时，一般乘6.25，可根据样品类别乘以相应的换算因子。

七、思考题：

1．什么叫“粗蛋白质”，用本实验方法测得的是否是粗蛋白质?

2．有开氏法消煮测蛋白质的样品时，主要应注意什么?催化剂、增温剂的作用和用量如何?

3．采取什么措施使样品中的蛋白质沉淀完全而又能排除非蛋白态氨的干扰?

4．测定多淀粉样品中的蛋白质，沉淀分离时由于沉淀物易成糊状使过滤十分困难，你可以采取哪些办法来解决这一困难?

5．某人用酸消化蛋白质沉淀物时，作了如下改动，好不好?试述理由：

①加入Se粉作催化剂，以加速消煮过程；

②用H2S04—HCl04混合酸消化；

③用H2S04—H202法消化；

④消化时不加CuS04—K2S04，仅用浓H2S04；

⑤在三角瓶中消煮；

6．用氨气敏电极测NH4+—N时，按下述操作进行，对测定结果会有什么影响?原因是什么?

①从250ml容量瓶中取25ml溶液直接放入烧杯中，加碱在离子计上测定；

②取10ml消化液于25ml容量瓶中，加10ml 5mol/l NaOH，水定容，然后测定；

③25ml容量瓶中的已中和的溶液倒入烧杯，先加入5滴10mol/l NaOH，然后放到磁力搅拌器上搅拌测定；

④在磁力搅拌器上先搅拌，同时加入10滴10mol/l NaOH；

⑤读数时，关掉磁力搅拌器；

⑥在等待读数达到稳定平衡期间，离开了5分钟，然后才回来读数；

⑦加入10mol/l NaOH，溶液变浑浊，在浑浊的溶液中测定；

⑧测过第一个样品溶液后，电极和磁棒来经洗涤，即放人下一个溶液测定。

(二)染料结合法

一、方法原理：

一定浓度的偶氮磺酸染料(桔黄G、酸性橙红)溶液与谷物样品混合时，染料与谷物中碱性氨基酸及蛋白质末端自由氨基结合形成不溶性络合物，结合量大小与碱性氨基酸及蛋白质含量成正比，一定的谷物其蛋白质氨基酸的组成一般是恒定的。因此，通过比色测定反应平衡时剩余染料的浓度，就可求得样品结合染料的多少，从而求出蛋白质及碱性氨基酸的量。

测定时需先用凯氏法测定一批(20 ~ 30个)同类谷物样品蛋白质含量，同时用染料结合法测剩余染料溶液吸收值，以凯氏法测得值为纵座标，染料法测得值为横坐标，作标准曲线。或计算其二法所得蛋白质含量之间的回归方程，供同类未知样品测定时查算用。

二、试剂：

1. 染料溶液：称取1.000g桔黄G(C16H1007N2S2Na2，分子量为452.38)，加少量水在80℃水浴上加热溶解。取柠檬酸(C8H8O7·H2O)20.70g和磷酸氢二钠(Na2HP04·12H20)1.44g，溶于400ml水中。将上述溶液都转入1000ml容量瓶中：加5滴防腐剂(1g百里酚溶于10ml无水酒精中)，用水定容，此为0.1％染料溶液。

三、仪器：

振荡机、离心机、分光光度计。

四、操作步骤：

1．称取0.25mm(60目)谷物样品0.5g左右，放人大试管(20ml)中；

2．加入20ml染料溶液，塞紧塞子；

3．在振荡机内振荡1小时。

4．取反应后溶液约10ml倒人离心管，离心10分钟左右(3000转／分)。

5．取上清液1.00ml放人50ml容量瓶中，用水定容。

6．取稀释液比色测定(721分光光度计，波长402nm，lcm比色皿，以水为参比液)。由标准曲线查出相应的蛋白质含量。

标准曲线的绘制：

称取蛋白质含量从低到高的同一谷物样品20个左右(例如：称量0.1g到1.09的不同样品，每增加0.05g算一个样)，每一个样称两份(或四份)，一份(或两份)用凯氏法测定蛋白质含量，另一份(或两份)用染料结合法剩余染料吸收值，以蛋白质含量(mg)为纵坐轴，吸收值为横轴，作标准曲线。

五、计算：

蛋白质％ = [查得蛋白质含量（mg）* 100]/样品重（ppm）

六、注意事项：

1．本法适用于大批样品的分析测定。样品称样量根据蛋白质含量水平而异，大豆等蛋白样品少称些，水稻、玉米可多称些。

2．样品应磨细至60目以上，使蛋白质能充分与试剂反应，取样应均匀。

3．脂肪含量高的样品最好用乙醚脱脂后再测定。

4，染料结合反应受时间、温度、pH值影响较大，要力求各次反应条件一致，特别注意样品与标准曲线反应条件一致。