(12)发明专利申请
(10)申请公布号(10)申请公布号 CN 104862409 A (43)申请公布日(43)申请公布日 2015.08.26
(21)申请号 201510297544.3(22)申请日 2015.06.02
(71)申请人浙江诺辉生物技术有限公司
地址310052 浙江省杭州市滨江区长河街道
江二路400号2幢1311室(72)发明人吕宁 陈一友 沈卫
(74)专利代理机构杭州裕阳专利事务所(普通
合伙) 33221
代理人冯燕青(51)Int.Cl.
C12Q 1/68(2006.01)C12Q 1/04(2006.01)C12N 15/11(2006.01)C12R 1/01(2006.01)
权利要求书3页 说明书18页 附图1页
(54)发明名称
用于检测幽门螺杆菌及其东亚型分型的引物和探针(57)摘要
本发明提供用于检测幽门螺杆菌的引物和探针，还提供了区分幽门螺杆菌东亚型分型的引物和探针。本发明还提供一种使用本发明的引物和探针检测人感染幽门螺杆菌并区分幽门螺杆菌东亚型分型的方法及试剂盒。本发明提供的引物和探针具有高灵敏度和特异性，而且能区分HP的分型，检测出高致病HP，检测方法没有侵入步骤，可以进行针对性治疗。
C N 1 0 4 8 6 2 4 0 9 A CN 104862409 A
权 利 要 求 书
1/3页
1.一种用于检测幽门螺旋杆菌的引物，其特征在于，
包括一个正向引物，选自
CAAGAGGAATACTCATTGCGAA(SEQ ID NO：1)CGACCTGCTGGAACATTACTGA(SEQ ID NO：2)AGGTGTGAAATCCTATGGCT(SEQ ID NO：3)GGTGAACGGACACACTGGAA(SEQ ID NO：4)ATCCTGGCTCAGAGTGAACG(SEQ ID NO：5)，和一个反向引物，选自
ACTAAGCCCTCCAACAAC(SEQ ID NO：6)AATCTTGCGACCGTACTCC(SEQ ID NO：7)GGTATCTAATCCTGTTTGCTCCC(SEQ ID NO：8)CGCTTGCACCCTCCGTATTA(SEQ ID NO：9)CCCCGTAGGGAGTATCTGGT(SEQ ID NO：10)。2.一种用于检测幽门螺旋杆菌的探针，其特征在于，至少包括一个探针，选自
TCCTGTTTGCTCCCCACGCTTT(SEQ ID NO：11)CCTGTTTGCTCCCCACGCTT(SEQ ID NO：12)
TACCCCTACACCAAGAATTCCACCTACCTC(SEQ ID NO：13)ATATTGCTCAATGGGGGAAACCCTGA(SEQ ID NO：14)ACCCGTGCGCCACTAATCAGCAT(SEQ ID NO：15)。
3.一种用于检测幽门螺旋杆菌东亚型分型的引物，其特征在于，包括一个正向引物，选自
CTCAACGAAGCTACATCAGCAA(SEQ ID NO：16)CTGAAGAGCCCATTTACGCTCA(SEQ ID NO：17)GTGCAAAAATTGACCAACTCAACG(SEQ ID NO：18)AGGTGAGTGCAAAAATTGACCAAC(SEQ ID NO：19)ACTCAACGAAGCTACATCAGCAA(SEQ ID NO：20)CTAGCCCTGAAGAGCCCATTTAC(SEQ ID NO：21)CTGAAGAGCCCATTTACGCTCAA(SEQ ID NO：22)GAGCCCATTTACGCTCAAGTTGC(SEQ ID NO：23)，和一个反向引物，选自
GCCCACTCCTTTACCTGCTG(SEQ ID NO：24)GCTGATCGCCCTGCTCCACT(SEQ ID NO：25)GCTAGCTGATCGCCCTGCTC(SEQ ID NO：26)CGCCCTGCTCCACTGTTTCCG(SEQ ID NO：27)CTCATCAAAATCAATTGTAGCG(SEQ ID NO：28)CCTGCTTGATTTGCCTCAT(SEQ ID NO：29)ATTTGCCTCATCAAAATCAATTGT(SEQ ID NO：30)GAAGCCTGCTTGATTTGCCT(SEQ ID NO：31)
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CN 104862409 A
权 利 要 求 书
2/3页
GGGAAGCCTGCTTGATTTG(SEQ ID NO：32)
GGAAGCCTGCTTGATTTGCCT(SEQ ID NO：33)AAGCCTGCTTGATTTGCCTCATC(SEQ ID NO：34)。
4.一种用于检测幽门螺旋杆菌东亚型分型的探针，其特征在于，至少包括一个探针，选自
TCAGCAGGTAAAGGAGT(SEQ ID NO：35)
CAACTCAACGAAGCTACATCAGCAATAAA(SEQ ID NO：36)CATCAGCAGGTAAAGGAGTGGGCGGTTTC(SEQ ID NO：37)TTGACCGGATTAACAAAATTGCATCAGCAG(SEQ ID NO：38)ATTGACCGGATTAACAAAATTGCATCAG(SEQ ID NO：39)TTGACCGGATTAACAAAATT(SEQ ID NO：40)。
5.一种用于检测幽门螺旋杆菌并区分东亚型分型的引物，其特征在于，包括一个正向引物，选自
CAAGAGGAATACTCATTGCGAA(SEQ ID NO：1)CGACCTGCTGGAACATTACTGA(SEQ ID NO：2)AGGTGTGAAATCCTATGGCT(SEQ ID NO：3)GGTGAACGGACACACTGGAA(SEQ ID NO：4)ATCCTGGCTCAGAGTGAACG(SEQ ID NO：5)，和另一个正向引物，选自
CTCAACGAAGCTACATCAGCAA(SEQ ID NO：16)CTGAAGAGCCCATTTACGCTCA(SEQ ID NO：17)GTGCAAAAATTGACCAACTCAACG(SEQ ID NO：18)AGGTGAGTGCAAAAATTGACCAAC(SEQ ID NO：19)ACTCAACGAAGCTACATCAGCAA(SEQ ID NO：20)CTAGCCCTGAAGAGCCCATTTAC(SEQ ID NO：21)CTGAAGAGCCCATTTACGCTCAA(SEQ ID NO：22)GAGCCCATTTACGCTCAAGTTGC(SEQ ID NO：23)；一个反向引物，选自
ACTAAGCCCTCCAACAAC(SEQ ID NO：6)AATCTTGCGACCGTACTCC(SEQ ID NO：7)GGTATCTAATCCTGTTTGCTCCC(SEQ ID NO：8)CGCTTGCACCCTCCGTATTA(SEQ ID NO：9)CCCCGTAGGGAGTATCTGGT(SEQ ID NO：10)，和另一个反向引物，选自
GCCCACTCCTTTACCTGCTG(SEQ ID NO：24)GCTGATCGCCCTGCTCCACT(SEQ ID NO：25)GCTAGCTGATCGCCCTGCTC(SEQ ID NO：26)CGCCCTGCTCCACTGTTTCCG(SEQ ID NO：27)CTCATCAAAATCAATTGTAGCG(SEQ ID NO：28)
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CN 104862409 A
权 利 要 求 书
3/3页
CCTGCTTGATTTGCCTCAT(SEQ ID NO：29)
ATTTGCCTCATCAAAATCAATTGT(SEQ ID NO：30)GAAGCCTGCTTGATTTGCCT(SEQ ID NO：31)GGGAAGCCTGCTTGATTTG(SEQ ID NO：32)GGAAGCCTGCTTGATTTGCCT(SEQ ID NO：33)AAGCCTGCTTGATTTGCCTCATC(SEQ ID NO：34)。
6.一种用于检测幽门螺旋杆菌并区分东亚型分型的探针，其特征在于，至少包括一个探针，选自
TCCTGTTTGCTCCCCACGCTTT(SEQ ID NO：11)CCTGTTTGCTCCCCACGCTT(SEQ ID NO：12)
TACCCCTACACCAAGAATTCCACCTACCTC(SEQ ID NO：13)ATATTGCTCAATGGGGGAAACCCTGA(SEQ ID NO：14)ACCCGTGCGCCACTAATCAGCAT(SEQ ID NO：15)；和另一个探针，选自
TCAGCAGGTAAAGGAGT(SEQ ID NO：35)
CAACTCAACGAAGCTACATCAGCAATAAA(SEQ ID NO：36)CATCAGCAGGTAAAGGAGTGGGCGGTTTC(SEQ ID NO：37)TTGACCGGATTAACAAAATTGCATCAGCAG(SEQ ID NO：38)ATTGACCGGATTAACAAAATTGCATCAG(SEQ ID NO：39)TTGACCGGATTAACAAAATT(SEQ ID NO：40)。7.一种检测幽门螺杆菌的方法，其特征在于，取人的粪便样品，使用以下各项进行PCR反应，
如权利要求1所述的正向引物；如权利要求1所述反向引物；
至少一个如权利要求2所述的探针。
8.一种检测幽门螺杆菌东亚型分型的方法，其特征在于，取人的粪便样品，使用以下各项进行PCR反应，
如权利要求3所述的正向引物；如权利要求3所述反向引物；
至少一个如权利要求4所述的探针。
9.一种检测幽门螺杆菌并区分东亚型分型的方法，其特征在于，取人的粪便样品，使用以下各项进行PCR反应，
如权利要求5所述的正向引物；如权利要求5所述反向引物；如权利要求6所述的探针。
10.一种检测幽门螺杆菌并区分东亚型分型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：如权利要求5所述的正向引物；如权利要求5所述反向引物；如权利要求6所述的探针。
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CN 104862409 A
说 明 书
用于检测幽门螺杆菌及其东亚型分型的引物和探针
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技术领域
本发明属于生物技术及诊断研究领域，涉及一种用于检测幽门螺杆菌及其东亚型分型的引物和探针，及利用该引物和探针检测样品中是否含有幽门螺杆菌，并确认是否含有高致病风险的东亚型分型的方法和试剂盒。
[0001]
背景技术
幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori，简称H.pylori或HP)是胃癌高危因子之
一。该细菌在80年代初被发现与胃炎有关。经过多年考察研究和验证，确认H.pylori造成超过90％的十二指肠溃疡和80％的胃溃疡，并且使带菌者患胃癌的比例明显增高。因此世卫组织将其定性为致癌物质。
[0003] H.pylori主要分为两种亚型，其中I型表达VacA，CagA等基因，被认为是导致胃部疾病的主要类型。而I型中的东亚型(EAS)导致胃癌的比例更高。相比未感染人群，东亚型H.pylori感染者胃癌发生率可高出～20倍。[0004] H.pylori的临床检测一般有三种方式：1)从血清中检测H.pylori的抗体；2)胃黏液活检；3)尿素呼气试验(UBT)。血清学检测不能区分是现在还是过去感染；抗体也可在根治后很久仍存在于患者血清中，因此仅应用于临床初筛和辅助诊断中。胃黏液活检需要侵入患者胃内取样，一般在做胃镜时使用，患者非常痛苦。UBT法即C-14呼气检测诊断法，原理为：HP菌分泌尿素酶，能分解口服标记的碳-14尿素，产生胺和二氧化碳气体，测定呼出气体内的二氧化碳含量，从而诊断HP是否阳性。这种方法使用方便，没有侵入步骤，灵敏度和特异性都很高，是目前各医院广泛使用的方法。但是这种方法无法区分CagA表达的H.pylori，或东亚型菌株。
[0002]
发明内容
本发明针对上述缺点，提供了一种用于检测幽门螺杆菌及其东亚型分型的引物和探针，通过取病人的粪便样品，采用荧光实时PCR反应技术，达到快速敏捷地检测出H.pylori的存在，更重要的是，还可以分辨出东亚型高度菌株，为普通筛查和传染病防治监控提供有效工具手段。[0006] 为实现上述目的，本发明采取下述技术方案来实现：[0007] 一种用于检测幽门螺旋杆菌的引物，[0008] 包括一个正向引物，选自[0009] SF1：CAAGAGGAATACTCATTGCGAA(SEQ ID NO：1)[0010] SF2：CGACCTGCTGGAACATTACTGA(SEQ ID NO：2)[0011] SF3：AGGTGTGAAATCCTATGGCT(SEQ ID NO：3)
[0005]
SF4：GGTGAACGGACACACTGGAA(SEQ ID NO：4)[0013] SF5：ATCCTGGCTCAGAGTGAACG(SEQ ID NO：5)，[0014] 和一个反向引物，选自
[0012]
5
CN 104862409 A[0015]
说 明 书
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SR1：ACTAAGCCCTCCAACAAC(SEQ ID NO：6)[0016] SR2：AATCTTGCGACCGTACTCC(SEQ ID NO：7)[0017] SR3：GGTATCTAATCCTGTTTGCTCCC(SEQ ID NO：8)[0018] SR4：CGCTTGCACCCTCCGTATTA(SEQ ID NO：9)[0019] SR5：CCCCGTAGGGAGTATCTGGT(SEQ ID NO：10)。[0020] 本发明还提供一种用于检测幽门螺旋杆菌的探针，[0021] 至少包括一个探针，选自[0022] SP1：TCCTGTTTGCTCCCCACGCTTT(SEQ ID NO：11)[0023] SP2：CCTGTTTGCTCCCCACGCTT(SEQ ID NO：12)[0024] SP3：TACCCCTACACCAAGAATTCCACCTACCTC(SEQ ID NO：13)[0025] SP4：ATATTGCTCAATGGGGGAAACCCTGA(SEQ ID NO：14)[0026] SP5：ACCCGTGCGCCACTAATCAGCAT(SEQ ID NO：15)。[0027] 本发明根据上述探针和引物，提供一种检测人感染幽门螺杆菌的方法，具体包括：取人的粪便样品，使用以下各项进行PCR反应，[0028] 一个正向引物，选自SF1-SF5；[0029] 一个反向引物，选自SR1-SR5；[0030] 至少一个探针，选自SP1-SP5。
[0031] 本发明还提供一种用于检测幽门螺旋杆菌东亚型分型的引物，包括[0032] 一个正向引物，选自[0033] F1：CTCAACGAAGCTACATCAGCAA(SEQ ID NO：16)[0034] F2：CTGAAGAGCCCATTTACGCTCA(SEQ ID NO：17)[0035] F3：GTGCAAAAATTGACCAACTCAACG(SEQ ID NO：18)[0036] F4：AGGTGAGTGCAAAAATTGACCAAC(SEQ ID NO：19)[0037] F5：ACTCAACGAAGCTACATCAGCAA(SEQ ID NO：20)[0038] F6：CTAGCCCTGAAGAGCCCATTTAC(SEQ ID NO：21)[0039] F7：CTGAAGAGCCCATTTACGCTCAA(SEQ ID NO：22)[0040] F8：GAGCCCATTTACGCTCAAGTTGC(SEQ ID NO：23)，[0041] 和一个反向引物，选自[0042] R1：GCCCACTCCTTTACCTGCTG(SEQ ID NO：24)[0043] R2：GCTGATCGCCCTGCTCCACT(SEQ ID NO：25)[0044] R3：GCTAGCTGATCGCCCTGCTC(SEQ ID NO：26)[0045] R4：CGCCCTGCTCCACTGTTTCCG(SEQ ID NO：27)[0046] R5：CTCATCAAAATCAATTGTAGCG(SEQ ID NO：28)[0047] R6：CCTGCTTGATTTGCCTCAT(SEQ ID NO：29)[0048] R7：ATTTGCCTCATCAAAATCAATTGT(SEQ ID NO：30)[0049] R8：GAAGCCTGCTTGATTTGCCT(SEQ ID NO：31)R9：GGGAAGCCTGCTTGATTTG(SEQ ID NO：32)[0051] R10：GGAAGCCTGCTTGATTTGCCT(SEQ ID NO：33)[0052] R11：AAGCCTGCTTGATTTGCCTCATC(SEQ ID NO：34)。
[0050]
6
CN 104862409 A[0053]
说 明 书
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本发明还提供一种用于检测幽门螺旋杆菌东亚型分型的探针，[0054] 至少包括一个探针，选自[0055] EP1：TCAGCAGGTAAAGGAGT(SEQ ID NO：35)[0056] EP2：CAACTCAACGAAGCTACATCAGCAATAAA(SEQ ID NO：36)[0057] EP3：CATCAGCAGGTAAAGGAGTGGGCGGTTTC(SEQ ID NO：37)[0058] EP4：TTGACCGGATTAACAAAATTGCATCAGCAG(SEQ ID NO：38)[0059] EP5：ATTGACCGGATTAACAAAATTGCATCAG(SEQ ID NO：39)[0060] EP6：TTGACCGGATTAACAAAATT(SEQ ID NO：40)。[0061] 本发明根据上述探针和引物，还提供一种检测人感染幽门螺杆菌东亚型分型的方法，具体包括：取人的粪便样品，使用以下各项进行PCR反应，[0062] 一个正向引物，选自F1-F8；[0063] 一个反向引物，选自R1-R11；[0064] 至少一个探针，选自EP1-EP6。
[0065] 本发明还提供一种用于检测幽门螺旋杆菌并区分东亚型分型的引物，[0066] 包括一个正向引物，选自[0067] SF1：CAAGAGGAATACTCATTGCGAA(SEQ ID NO：1)[0068] SF2：CGACCTGCTGGAACATTACTGA(SEQ ID NO：2)[0069] SF3：AGGTGTGAAATCCTATGGCT(SEQ ID NO：3)[0070] SF4：GGTGAACGGACACACTGGAA(SEQ ID NO：4)[0071] SF5：ATCCTGGCTCAGAGTGAACG(SEQ ID NO：5)，[0072] 和另一个正向引物，选自[0073] F1：CTCAACGAAGCTACATCAGCAA(SEQ ID NO：16)[0074] F2：CTGAAGAGCCCATTTACGCTCA(SEQ ID NO：17)[0075] F3：GTGCAAAAATTGACCAACTCAACG(SEQ ID NO：18)[0076] F4：AGGTGAGTGCAAAAATTGACCAAC(SEQ ID NO：19)[0077] F5：ACTCAACGAAGCTACATCAGCAA(SEQ ID NO：20)[0078] F6：CTAGCCCTGAAGAGCCCATTTAC(SEQ ID NO：21)[0079] F7：CTGAAGAGCCCATTTACGCTCAA(SEQ ID NO：22)[0080] F8：GAGCCCATTTACGCTCAAGTTGC(SEQ ID NO：23)；[0081] 一个反向引物，选自[0082] SR1：ACTAAGCCCTCCAACAAC(SEQ ID NO：6)[0083] SR2：AATCTTGCGACCGTACTCC(SEQ ID NO：7)[0084] SR3：GGTATCTAATCCTGTTTGCTCCC(SEQ ID NO：8)[0085] SR4：CGCTTGCACCCTCCGTATTA(SEQ ID NO：9)[0086] SR5：CCCCGTAGGGAGTATCTGGT(SEQ ID NO：10)；[0087] 和另一个反向引物，选自R1：GCCCACTCCTTTACCTGCTG(SEQ ID NO：24)[0089] R2：GCTGATCGCCCTGCTCCACT(SEQ ID NO：25)[0090] R3：GCTAGCTGATCGCCCTGCTC(SEQ ID NO：26)
[0088]
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CN 104862409 A[0091]
说 明 书
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R4：CGCCCTGCTCCACTGTTTCCG(SEQ ID NO：27)[0092] R5：CTCATCAAAATCAATTGTAGCG(SEQ ID NO：28)[0093] R6：CCTGCTTGATTTGCCTCAT(SEQ ID NO：29)[0094] R7：ATTTGCCTCATCAAAATCAATTGT(SEQ ID NO：30)[0095] R8：GAAGCCTGCTTGATTTGCCT(SEQ ID NO：31)[0096] R9：GGGAAGCCTGCTTGATTTG(SEQ ID NO：32)[0097] R10：GGAAGCCTGCTTGATTTGCCT(SEQ ID NO：33)[0098] R11：AAGCCTGCTTGATTTGCCTCATC(SEQ ID NO：34)。
[0099] 本发明还一种用于检测幽门螺旋杆菌并区分东亚型分型的探针，[0100] 至少包括一个探针，选自[0101] SP1：TCCTGTTTGCTCCCCACGCTTT(SEQ ID NO：11)[0102] SP2：CCTGTTTGCTCCCCACGCTT(SEQ ID NO：12)[0103] SP3：TACCCCTACACCAAGAATTCCACCTACCTC(SEQ ID NO：13)[0104] SP4：ATATTGCTCAATGGGGGAAACCCTGA(SEQ ID NO：14)[0105] SP5：ACCCGTGCGCCACTAATCAGCAT(SEQ ID NO：15)；[0106] 和另一个探针，选自[0107] EP1：TCAGCAGGTAAAGGAGT(SEQ ID NO：35)[0108] EP2：CAACTCAACGAAGCTACATCAGCAATAAA(SEQ ID NO：36)[0109] EP3：CATCAGCAGGTAAAGGAGTGGGCGGTTTC(SEQ ID NO：37)[0110] EP4：TTGACCGGATTAACAAAATTGCATCAGCAG(SEQ ID NO：38)[0111] EP5：ATTGACCGGATTAACAAAATTGCATCAG(SEQ ID NO：39)[0112] EP6：TTGACCGGATTAACAAAATT(SEQ ID NO：40)。[0113] 进一步，前述各种探针的5’端设有Fam，Vic，hex，Rox，Texas red，Cy3，Cy5中的一种荧光物质，优选的，为Fam。[0114] 进一步，前述各种探针的3’端设有MG BNFQ，BHQ1，BHQ2中的一种。[0115] 本发明根据上述探针和引物，提供一种检测幽门螺旋杆菌并区分东亚型分型的方法，具体包括：取人的粪便样品，使用以下各项进行PCR反应，[0116] 一个正向引物，选自SF1-SF5和另一个正向引物选自F1-F8；[0117] 一个反向引物，选自SR1-SR5和另一个反向引物，选自R1-R11；[0118] 至少一个探针，选自SP1-SP5和另一个探针，选自EP1-EP6。
[0119] 本发明还提供一种检测幽门螺旋杆菌并区分东亚型分型的试剂盒，包括：[0120] 一个正向引物，选自SF1-SF5和另一个正向引物选自F1-F8；[0121] 一个反向引物，选自SR1-SR5和另一个反向引物，选自R1-R11；[0122] 至少一个探针，选自SP1-SP5和另一个探针，选自EP1-EP6。
[0123] 此外本发明还提供前述引物和探针在制备检测幽门螺旋杆菌并区分东亚型分型的试剂盒中的用途。
本发明的有益效果：
[0125] HP感染后，部分细菌会随食物进入消化道，并进入粪便中。本发明以人粪便样品为检测对象，首先提取粪便中的DNA，采用荧光实时PCR反应技术，采用本发明提供的引物和
[0124]
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CN 104862409 A
说 明 书
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探针具有高灵敏度和特异性，可以快速敏捷地检测出H.pylori的存在，同时还可以检测出高致病HP，对HP的类型进行分型，区分出高毒株和普通低毒株。[0126] 目前医院通用的C-14法测HP虽然比较准确，但无法分别患者所感染的是普通的HP，还是高毒株HP。目前对HP的治疗以服用药物为主，较常用的方法为三联法治疗，即分别配合服用三种不同的抗生素，例如：奥美拉唑、丽珠得乐和克拉霉素，或者其它组合。三联法一般需要连服2周左右，副作用非常大。HP在发展中国家的感染率在一半左右，而普通低毒HP的危害并不是特别大，治疗产生的副作用较大，如果所有的感染者都选择治疗，对自身也有很大的伤害，这也是国内很多HP阳性者选择不治疗的原因。利用本发明，准确检测出患者所感染的为高毒株HP还是普通HP，能很好的帮助医生选择最合适的治疗方法。[0127] 此外HP作为胃病，胃癌的致病菌，其本身作用是长期缓慢的，所以针对青少年的检测意义更大，早发现，早根除病根。但由于其治疗的副作用较大，很多青少年关不适合三联法治疗，必需等到一定年龄后，才能治疗。如果能及早判断出所感染的为高毒株，还是普通株，有助于医生在治疗的危害及HP本身的危害中进行权衡选择。[0128] 而且本检测方法不需要侵入患者胃内取样，相对于医院胃黏液活检法，大大降低了患者的痛苦。无需患者亲身去医院，只需要将样品按要求寄至检测地点，经过2周左右时间就可得到结果，既方便了患者，也为医院减轻了压力。附图说明
图1是实施例1中三个待测目标基因荧光定量PCR扩增曲线。[0130] 图2是实施例2中三个待测目标基因荧光定量PCR扩增曲线。
[0129]
具体实施方式
[0131] 下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。[0132] 实施例1
[0133] 使用以下各项进行PCR反应。
[0134] (1)待测目标(即PCR反应中的DNA模板)[0135] 共3份样品，样品A为HP阴性，样品B为HP阳性，非东亚型，样品C为HP阳性，东亚型。
[0136] (2)引物
[0137] 正向引物SF1至SF6任意选择一个，本实施例中选择SF1，[0138] 反向引物SR1至SR5任意选择一个，本实施例中选择SR1。[0139] (3)探针
[0140] 探针SP1至SP1任意选择一个，本实施例中选择SP1。[0141] 其中探针5’端标荧光物质Fam，3’端为MGB。[0142] Fam为羧基荧光素，5-Fam，6-Fam均可选用，优选5-Fam。[0143] MGB即小沟结合，本实施例的探针3’端探针上还连接有MGB(Minor Groove Binder)修饰基团，可以将探针的Tm值提高10℃左右，从而使得探针可以更短，节约成本并提高成功率。
[0144] 本实施例中PCR反应体系为50ul，具体的反应体系，如下：
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说 明 书
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[0147] [0148]
引物：
[0149] 本实施例对PCR缓冲液(PCR buffer)无特殊要求，使用一般的Tris-Cl缓冲液即
可。
PCR重要参数如表1所示。[0151] 表1PCR重要参数
[0150] [0152]
PCR重要参数引物终浓度探针终浓度
100-1000nM100-500nM
2-10分钟
15秒-30秒30秒-60秒
PCR反应条件： 酶激活
95℃
然后55循环：
[0153]
95℃55-65℃
本实施例中采用ABI7500实时荧光定量PCR仪，图1是三个待测目标基因荧光定
量PCR扩增曲线。从图1中可以看出，本实施例选择的引物和探针及检测方法可以检测到是否感染HP。[0154] 实施例2
[0155] 使用以下各项进行PCR反应。
[0156] (1)待测目标(即PCR反应中的DNA模板)[0157] 共3份样品，样品A为HP阴性，样品B为HP阳性，非东亚型，样品C为HP阳性，东亚型。
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说 明 书
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(2)引物
[0159] 正向引物F1至F8任意选择一个，本实施例中选择F1，[0160] 反向引物R1至R11任意选择一个，本实施例中选择R1。[0161] (3)探针
[0162] 探针EP1至EP1任意选择一个，本实施例中选择EP1。[0163] 其中探针5’端标荧光物质Fam，3’端为MGB。[0164] Fam为羧基荧光素，5-Fam，6-Fam均可选用，优选5-Fam。[0165] MGB即小沟结合，本实施例的探针3’端探针上还连接有MGB(Minor Groove Binder)修饰基团，可以将探针的Tm值提高10℃左右，从而使得探针可以更短，节约成本并提高成功率。
[0166] 本实施例中PCR反应体系为50ul，具体的反应体系，如下：
[0167]
[0168] [0169]
引物：
[0170] 本实施例对PCR缓冲液(PCR buffer)无特殊要求，使用一般的Tris-Cl缓冲液即
可。
PCR重要参数如表1所示。[0172] 表1PCR重要参数
[0171] [0173]
PCR重要参数引物终浓度探针终浓度
100-1000nM100-500nM
2-10分钟
PCR反应条件： 酶激活
95℃
然后55循环：
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CN 104862409 A
[0174]
说 明 书
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本实施例中采用ABI7500实时荧光定量PCR仪，图1是三个待测目标基因荧光定量PCR扩增曲线。从图1中可以看出，本实施例选择的引物和探针及检测方法可以区分HP是否为东亚型。[0175] 实施例3
[0176] 一种用于检测幽门螺杆菌并区分东亚型的试剂盒[0177] 本实施例中的试剂盒包括：PCR缓冲液，dNTPs，PCR引物，探针和DNA聚合酶。[0178] 本实施例中PCR引物中正向引物为F1和SF1，反向引物为R1和SR1，探针为SP1和EP5，所述探针EP5的5’端的荧光基团为FAM，3’端的荧光基团为BHQ1，SP1的5’端的荧光基团为CY5，3’端的荧光基团为BHQ3。[0179] 本实施例中其他成分没有特殊要求，选择一般通用即可实现反应目的。[0180] 使用该试剂盒对目标基因进行检测时，包括以下步骤：(1)目标基因荧光定量PCR扩增：使用试剂盒中荧光定量PCR反应液对待测样品DNA进行PCR扩增反应，得到目的基因的定量结果和PCR产物；[0182] (2)定性结果分析：信号强度及CT值的阈值由研发及临床实验结果得出，检测结果中信号强度高于阈值，且CT值小于设定阈的样品为阳性；若不能同时达到以上二个条件，则为阴性。
[0183] 本发明虽然已以较佳实施例公开如上，但其并不是用来限定本发明，任何本领域技术人员在不脱离本发明的精神和范围内，都可以利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出可能的变动和修改，因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化及修饰，均属于本发明技术方案的保护范围。
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