SRF在VSMC再分化过程中的表达及其DNA结合活性变化

1992;42(6):1462-9󰀁

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中国老年学杂志2006年12月第26卷〔2006-02-28收稿󰀁2006-05-20修回〕

(编辑󰀁张󰀁慧)

SRF在VSMC再分化过程中的表达及其DNA结合活性变化

许丽辉󰀁韩󰀁梅󰀁温进坤󰀁

(河北医科大学基础医学研究所生化室河北省医学生物技术重点实验室,河北󰀁石家庄󰀁050017)

󰀁󰀁〔摘󰀁要〕󰀁目的󰀁探讨SRF在血管平滑肌细胞(VSMC)再分化过程中的表达及其与DNA结合活性的变化规律。方法󰀁采用血清刺激与饥饿的方法诱导培养的VSMC发生表型逆转,应用Northern、Western印迹及电泳迁移率变动分析(EMSA)等方法检测VSMC再分化过程中SRF表达及其与DNA结合活性的动态变化。结果󰀁在体外培养的VSMC发生表型逆转时,SRF的mRNA和蛋白表达的水平均无明显变化;与去分化型VSMC相比,分化型VSMC中SRF的DNA结合活性明显增强,后者与VSMC分化型标志基因SM22󰀁的转录活性具有平行关系。结论󰀁SRF启动VSMC特异性基因表达的活性与其蛋白水平无关,血清饥饿诱导的SRF结合CArG-box的能力明显增强,有利于激活分化型标志基因的表达。

〔关键词〕󰀁血清应答因子;血管平滑肌细胞;表型逆转

〔中图分类号〕󰀁Q7󰀁󰀁〔文献标识码〕󰀁A󰀁󰀁〔文章编号〕󰀁1005-9202(2006)12-1674-03

ExpressionandDNAbindingabilityofSRFintheprocessofVSMCredifferentiationXUL-iHu,iHANMe,iWENJin-Kun󰀁

HebeiKeyLaboratoryofMedicalBiotechnology,InstituteofBasicMedicine,HebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050017,He-be,iChina【Abstract】󰀁Objective󰀁TodetermineSRFexpressionandbindingabilitybetweenserumresponsefactor(SRF)andDNAintheprocessofvascularsmoothmusclecell(VSMC)redifferentiation󰀁Methods󰀁ThemodelofVSMCredifferentiationinducedbyserumstarva-tionwasusedtoreverseVSMCphenotype󰀁TheexpressionandbindingabilitybetweenSRFandDNAweredetectedbyNorthernblotting,WesternblottingandEMSA󰀁Results󰀁ThemRNAandproteinlevelofSRFhadnochangesduringVSMCphenotypicreverseinducedbyser-umstarvation󰀁ButcomparedwithdedifferentiatedVSMC,thebindingactivitybetweenSRFandDNAobviouslyenhancedindifferentiatedVSMC󰀁ThelatterwaspositiverelationtotranscriptionactivityofVSMCmarkergeneSM22󰀁󰀁Conclusions󰀁TheactivitythatSRFstartsVSMCspecificgeneexpressionisunrelatedtoitsproteinlevel󰀁ItmakesforactivatingdifferentiatedphenotypemarkergeneexpressionthatSRFinducedbyserumstarvationbindingwithCArG-boxobviouslyenhance󰀁

【Keywords】󰀁Serumresponsefactor;Vascularsmoothmusclecel;lPhenotypicreverse󰀁󰀁血管平滑肌细胞(vascularsmoothmusclecells,VSMC)是一种非终末分化细胞,其表型具有多样性和可塑性。VSMC在多种细胞因子和生长因子刺激下,可从具有收缩功能的分化型转变为具有迁移和增殖能力的去分化型。去分化型VSMC饥饿培养一定时间后或经胰岛素样生长因子(IGF-1)、层黏蛋白(LN)处理后,VSMC的去分化特征逐渐减弱,代之以分化型标志的恢复。VSMC由去分化型向分化型的转变过程,即表型逆转过程称为VSMC再分化

〔1〕

系,本研究利用血清饥饿法诱导VSMC由合成型再分化为收缩型,观察VSMC表型逆转过程中,SRF的表达及与DNA结合能力的变化规律。1󰀁材料与方法

1󰀁1󰀁材料󰀁󰀁-32P-dCTP(北京亚辉生物医学公司),兔抗鼠SRF多克隆抗体,HRP-1标记的羊抗兔二抗(北京中山公司),RT-PCR试剂盒(AppliedBiosystems),EMSA试剂盒(Promega公司),其他试剂均为进口或国产分析纯。

1󰀁2󰀁细胞培养与分组󰀁取5周龄SD大鼠胸腹主动脉,用贴块法分离VSMC,加入含10%胎牛血清(FBS)的M199进行培养,用0󰀁25%胰蛋白酶消化传代,取3~7代细胞进行实验。血清刺激培养的VSMC为合成型。按文献〔1〕方法诱导合成型细胞再分化为收缩型。待细胞生长至100%汇合后,再继续培养24~48h,使其达到超汇合(postconfluence)状态,继之换成无血清M199,进行血清饥饿培养,并于血清饥饿0、12、24、48、72h收集细胞。另取血清饥饿培养72h的VSMC,按文献〔3〕方法恢复血清刺激,将细胞以80%~90%密度进行传代,加入含10%FBS的M199继续培养,并于24、48h收集已达到100%汇

。近年来,研究者已经筛选出一系

列与VSMC分化和去分化相关的标志基因,并发现在所有分化型标志基因的上游区中均存在血清应答因子(serumre-sponsefactor,SRF)结合元件CArG〔CC(A/T)6GG〕-box

〔2〕

。已

经证实,在VSMC分化过程中,SRF是调节VSMC特异基因表达的关键转录因子之一。为了探讨SRF与VSMC再分化的关

基金项目:教育部高等学校博士学科点专向基金(No󰀁200400018)通讯作者:温进坤(19-),男,医学博士,教授,博士生导师,主要从事

心血管分子生物学研究。

作者简介:许丽辉(1970-),女,博士,副教授,主要从事心血管分子生物

学研究。

许丽辉等󰀁SRF在VSMC再分化过程中的表达及其DNA结合活性变化󰀁第12期󰀁1675󰀁

合的细胞,以此作为恢复血清刺激的合成型VSMC。

1󰀁3󰀁RNA提取及Northern印迹分析󰀁用异硫氰酸胍一步法收集不同条件处理的VSMC,提取总RNA(各30󰀁g),经1%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳分离后,转移,固定至尼龙膜上,随后与󰀁-32P-dCTP标记的SRFcDNA探针进行杂交。

1󰀁4󰀁RT-PCR󰀁收集不同条件处理的VSMC,提取总RNA。以总RNA为模板,进行RT-PCR,检测不同条件处理的VSMC中SM22󰀁的表达活性。SM22󰀁上、下游引物序列分别为5󰀁-TTCT-GCCTCAACATGGCCAAC-3󰀁和5󰀁-CACCTTCACTGGCTTGGATC-3󰀁。反应以三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)作内参照,对模板用量进行标化。PCR产物通过8%PAGE分离、鉴定。

1󰀁5󰀁Western印迹分析󰀁按文献〔4〕方法裂解VSMC,提取细胞总蛋白,用改良酚试剂法测定蛋白含量。各组均取含80󰀁g蛋白的裂解液经8%SDS-PAGE分离后,通过电转移将蛋白印迹至PVDF膜上,用5%脱脂奶粉封闭膜上非特异性结合位点,继之与抗SRF抗体室温反应5h,洗膜3次。随后加入HRP-1标记的二抗室温反应2h,4-氯-1-萘酚/H2O2溶液显色。用法国VilberLourmat公司的BioID数码成像分析软件对Western印迹结果进行定量分析。

1󰀁6󰀁SRF结合元件(CArG-box)ODNs设计与合成󰀁按SM22󰀁基因启动子近端CArG顺式元件的碱基序列合成正链及互补链ODNs(上海生工生物工程公司),正链序列如下:5󰀁-CTTTC-CCCAAATATGGAGCCTG-3󰀁。将合成的正链及其互补链ODNs溶解于3󰀁SSC溶液中,加热至80󰀁后,缓慢降温至55󰀁,使其退火生成双链ODNs。

1󰀁7󰀁电泳迁移率变动分析(electrophoreticmobilityshiftassay,EMSA)󰀁按文献〔5〕报道的方法从不同条件处理的VSMC中提取核蛋白。各取10󰀁g与末端标记的SM22󰀁基因启动子近端CArG顺式元件进行结合反应,以100倍过量的非标记探针作为特异性竞争结合对照。DNA-核蛋白复合物经4%PAGE分离后,-70󰀁放射自显影显现电泳区带的迁移变化。2󰀁结󰀁果

2󰀁1󰀁血清饥饿对SRF基因表达的影响󰀁由于SM22󰀁是收缩型VSMC的最具特点的标志基因〔6〕,所以本研究中以SM22󰀁表达活性作为判定VSMC表型的依据。在血清刺激培养的VSMC中,即使细胞生长至完全汇合而出现接触抑制时也难以检测到SM22󰀁的mRNA,说明此时的VSMC处于去分化状态。血清饥饿12h后,SM22󰀁mRNA水平迅速上升至高峰,并一直维持此水平不变。这表明血清饥饿可诱导处于增殖状态的VSMC进入静止期,并向收缩型转变。血清饥饿72h后的细胞再恢复血清(10%FBS)刺激时,SM22󰀁表达活性又快速下调,预示着VSMC又恢复为去分化状态。在此过程中我们动态观察了血清刺激与饥饿培养对SRF基因表达的影响。杂交结果显示,将血清饥饿前后不同时间的VSMC总RNA与SRFcDNA探针杂交后,在相当于SRFmRNA长度的位置上出现特异性杂交条带。根据杂交信号强度可知,不同表型的VSMC中SRFmRNA水平相当,并无明显变化。在此基础上,我们用相同条件下VSMC蛋白提取液进行SRF的Western印迹分析,可检测到62和67kD两种形式的SRF区带,以两条区带的密度扫描值之和代表SRF蛋白表达水平。结果表明,不同表型的VSMC中SRF的蛋白水平亦无明显变化。这提示SRF启动VSMC特异性基因表达的活性与其蛋白水平无关,见图1。

1󰀁10%FBS刺激,2󰀁血清饥饿12h,3󰀁血清饥饿24h,4󰀁血清饥饿48h,5󰀁血清饥饿72h,6󰀁血清饥饿72h恢复血清刺激24h,7󰀁血清饥饿72h恢复血清刺激48h

图1󰀁血清饥饿前后VSMC中SRF和SM22󰀁的表达

1󰀁游离探针󰀁2󰀁10%FBS刺激󰀁3󰀁血清饥饿6h4󰀁血清饥饿72h恢复血清刺激6h󰀁5󰀁竞争结合

图2󰀁血清饥饿对SRF与DNA结合能力的影响2󰀁2󰀁血清饥饿对SRF与DNA结合能力的影响󰀁EMSA表明,从血清饥饿前后VSMC细胞中提取的核蛋白都可与SM22󰀁启

󰀁1676󰀁中国老年学杂志2006年12月第26卷

动子近端CArG-box相结合,在4%PAGE上出现迁移率变慢的DNA-蛋白质复合物区带,见图2。其中血清饥饿培养时,表现出收缩表型特征的VSMC中DNA-蛋白质复合物区带加深,说明核蛋白与DNA的结合能力有所增强。当血清饥饿72h后的细胞再恢复血清(10%FBS)刺激时,SRF与DNA结合能力又恢复至血清饥饿前水平。SRF-DNA复合物形成的特异性由过量未标记的竞争性结合而证实。撤血清诱导的SRF结合CArG-box的能力明显增强,有利于激活分化型标志基因表达。3󰀁讨󰀁论

󰀁󰀁已有研究证实,SRF优先表达于发育的早期阶段,而且主要存在3种肌细胞系󰀁󰀁󰀁心肌、骨骼肌和平滑肌中

〔7〕

报告基因的表达,近3󰀁CArG-box更重要。基于上述原因我们选择SM22󰀁基因启动子近3󰀁CArG顺式元件的碱基序列合成正链及互补链ODNs,采用EMSA方法观察血清饥饿对SRF的DNA结合能力的影响。结果表明,与合成型VSMC相比,血清饥饿后,VSMC逆转为收缩型的过程中,SRF与CArG-box的结合能力显著增强。由此提示,尽管在血清饥饿前后SRF的mRNA和蛋白表达水平均无明显变化,但是在血清饥饿的刺激下,SRF的DNA结合活性迅速提高,因此启动了VSMC分化型标志基因SM22󰀁的转录,从而促使VSMC向收缩表型逆转。4󰀁参考文献

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〔2006-03-13收稿󰀁2006-06-07修回〕

。通过抗

SRF抗体的显微注射或应用SRF反义寡核苷酸阻断SRF基因在C2C12成肌细胞中的表达,可抑制肌标志基因的表达,阻断成肌细胞向肌小管的分化〔8〕。这说明SRF在肌生成分化和肌特异性基因表达中的重要作用。另外的研究证实〔9〕一个显性失活的SRF的突变体,在DNA结合方面有缺陷,但能和其他的SRF单体形成异源二聚体,在肌源性培养中可抑制骨骼肌󰀁-actin的基因启动子的转录活性并且阻断其终末分化。因此在骨骼肌的终末分化时󰀁-actin的基因转录过程中,SRF起着必要的作用。SRF基因敲除实验证实了纯合子的SRF-/-小鼠胚胎不能发育形成中胚层,且发育停止在原肠胚形成〔8〕。缺失SRF的小鼠胚胎直到E6󰀁5天发育正常,但不能成中胚层的胚芽层,结果在E8󰀁5天和E12󰀁5天死于胚胎中。SRF-/-胚胎正常发育到E6󰀁5天,而且在中胚层缺陷的情况下正常生长,表明对于正常细胞增殖,SRF不是必需的条件。体外的研究也支持了这个观点〔10〕。特异的心肌SRF的转基因,发现SRF的过表达引起小鼠心肌肥大,小鼠出生6个月死于心力衰竭〔11〕。无DNA结合活性的突变的SRF的过表达严重破坏胚胎的基因发生及小鼠的早期发育〔12〕。所有这些转基因的结果说明充足的SRF对于胚胎的基因发生和早期发育是必需的。对于成年,相对低水平的SRF的维持更有益。

󰀁󰀁SRF是一个普遍存在的MADS结构域家族的转录因子,以同源二聚体的形式结合DNA序列CC(A/T)6GG,即CArG-box。到目前为止,已分析的每一个平滑肌基因的区都包含至少两个CArG-box,协同控制平滑肌特异性的转录。由于SRF在一个广泛的细胞类型中都表达,因而它控制特异性基因表达的机制一直备受关注。为了探索其分子机制,本实验利用我室改良建立的血清饥饿法诱导合成型VSMC逆转为收缩型模型

〔1〕

,

观察了SRF在表型逆转过程中的表达变化。结果显示,在体外培养的VSMC,无论处于分化状态还是去分化状态,SRF的mR-NA和蛋白表达水平均无明显变化。这提示SRF在启动VSMC特异性基因表达的活性与其蛋白水平无关。

󰀁󰀁培养细胞的转基因表达或转基因鼠中的突变分析均已证实SRF结合其保守的CArG序列对于平滑肌特异性基因的全部转录活性是必需的〔13〕。其中最具代表性的就是SM22󰀁启动子,其活性依赖于SRF结合其转录起始位点5󰀁端-300bp处的两个CArG-box。在培养的细胞中,SRF结合的任何一个元件的突变就可降低SM22󰀁启动子活性的一半,两个CArG位点的突变可完全废除其活性。在体内对于SM22󰀁启动子驱动的组织特异性(编辑󰀁张󰀁慧)