牛奶中酪蛋白的提取及含量测定
一、实验原理
1、牛乳的主要成分：碳水化合物（5%）、脂类（4%）、蛋白质（3.5%）、维生素、微量元素（Ca、P等矿物质）、水（87%）
牛奶中的糖主要是乳糖。乳糖是一种二糖，它由D-半乳糖分子和D-葡萄糖分子通过β-1,4-糖苷键连接而成。乳糖溶于水，不溶于乙醇，当乙醇混入乳糖水溶液中时，乳糖会结晶出来，从而达到分离的目的。
牛奶中的蛋白质主要是酪蛋白和乳清蛋白两种，其中酪蛋白占了牛乳蛋白质的80%。酪蛋白是白色、无味的物质，不溶于水、乙醇等有机溶剂，但溶于碱溶液。而乳清蛋白水合能力强，分散性强，在牛乳中呈高分子状态。 2、等电点沉淀法：
在等电点时，蛋白质分子以两性离子形式存在，其分子净电荷为零(即正负电荷相等)，此时蛋白质分子颗粒在溶液中因没有相同电荷的相互排斥，分子相互之间的作用力减弱，其颗粒极易碰撞、凝聚而产生沉淀，所以蛋白质在等电点时，其溶解度最小，最易形成沉淀物。酪蛋白的等电点为4.7左右（不同结构的酪蛋白等电点有所不同），本实验中将牛乳的pH调值4.7时，酪蛋白就沉淀出来。
市售牛奶通常会添加耐酸碱稳定剂来增加粘稠度，以致即使pH调至等电点酪蛋白也沉淀的很少，故实验时可将pH稍微调过多一点再调回等电点。同时，市售牛奶由于生产过程通常导致酪蛋白组分发生变化，因而使pI偏离了4.7，通常偏酸。
3、酪蛋白的提纯
根据乳糖、乳清蛋白等和酪蛋白的溶解性质差异，可以用纯水洗涤来除去乳糖、乳清蛋白等溶于水的杂质，再用乙醇除去脂类，然后过渡到用乙醚洗涤，由于乙醚很快挥发，最终得到纯粹的酪蛋白结晶。 4、蛋白质含量的测定（考马斯亮蓝结合法）
考马斯亮蓝能与蛋白质的疏水微区结合，这种结合具有高敏感性。考马斯亮蓝G520的磷酸溶液呈棕红色，最大吸收峰在465nm。当它与蛋白质结合形成复合物时呈蓝色，其最大吸收峰变为595nm。在一定范围内，考马斯亮蓝G520-蛋白质复合物呈色后，在595nm下，吸光度与蛋白质含量呈线性关系，故可以测定蛋白质浓度。
二、实验器材与试剂
1、器材：恒温水浴锅、离心机、抽滤装置、蒸发皿、精密pH试纸、旋涡混合器、紫外分光光度计、试管*9、5mL吸管、50mL容量瓶、100mL量筒、电子分析天平
2、试剂：鲜牛奶、pH4.7醋酸-醋酸钠缓冲溶液、乙醇-乙醚混合液（95%乙醇、无水乙醚体积比1：1）、0.9%NaCl溶液、标准蛋白液（0.1mg/mL牛血清蛋白）、考马斯亮蓝G520染液
三、实验操作记录
1、酪蛋白的制备
将20mL牛奶盛于100mL的烧杯中加热到40℃，在搅拌下慢慢加入预热至
；.
.
40℃、pH4.7的醋酸缓冲溶液20mL。用冰醋酸调节溶液pH至4.7，此时即有大量的酪蛋白沉淀析出。将上述悬浮液冷却至室温，离心5min（4000r/min），弃去上清液，沉淀即为酪蛋白粗品。
用蒸馏水洗涤沉淀3次（每次约20mL），离心5min（3000r/min），弃去上清液。在沉淀中加入约20mL95%乙醇，搅拌片刻，将全部的悬浊液转移到布氏漏斗中抽滤，用乙醇-乙醚混合溶液洗涤沉淀2次，最后用乙醚洗涤沉淀2次，抽干。将沉淀摊开在培养皿中，风干，保存至下周。 2、标准曲线的制作
取7支干净干燥试管，按下表进行编号并加入试剂。
混匀，室温静置3min，以第一管为空白，于波长595nm处比色，读取吸光度，以吸光度为纵坐标，各标准液浓度为横坐标得标准曲线。 表 1 标准曲线的制作 2 3 4 5 6 7 试剂\\编号 1（空白） 标准蛋白液/mL 0.9%NaCl/mL 考马斯亮蓝染液/mL 蛋白质浓度/(μg/mL) —— 1.0 4.0 0 0.000 0.1 0.9 4.0 10 0.151 0.2 0.8 4.0 20 0.260 0.3 0.7 4.0 30 0.326 0.4 0.6 4.0 40 0.440 0.6 0.4 4.0 60 0.535 0.8 0.2 4.0 80 0.636 3、样液的测定 准确称取25mg自制酪蛋白，置于50mL烧杯中，加入约20mL0.9%NaCl，再准确加入1mol/L NaOH 5mL，当酪蛋白溶解后，准确加入1mol/L乙酸5mL，充分振摇直至酪蛋白完全溶解为止（不溶可在50℃水浴加热至溶），全部转移至50mL容量瓶中，加0.9%NaCl稀释定容至50mL，充分摇匀。取5mL上述蛋白液，转移至另一个50mL容量瓶中，用0.9%NaCl稀释定容至50mL。
另取一支干净试管，加入样品液1.0mL及考马斯亮蓝染液4.0mL，混匀，室温静置3min，于波长595nm处比色，读取吸光度，由样品液的吸光度查标准曲线即可求出含量。
四、实验结果
1、酪蛋白产量及产率计算 表 2酪蛋白产量及产率计算 酪蛋白质量/g 牛奶样品质量/g 0.78 2、标准曲线 20.03 产率/g 3.89% ；.
.
由散点图可以看出，后两个点与前面几个点的线性关系并不好，出现了明显的负偏差。故在线性拟合时舍去后两个点，取前5个点进行拟合。拟合出的直线R²达到0.983，线性较好。
2、 样品液的吸光度是0.324，对照标准曲线得酪蛋白浓度为28.40μg/mL。
称取的酪蛋白样品质量为0.0267g，稀释倍数为500倍。
=
=53.2%
五、误差分析与讨论
1、本次制备实验中得到的蛋白质量较多，但纯度较低，分析原因如下：
1）得到的蛋白质略呈黄色，且有些发粘，说明可能脱脂不彻底，蛋白质产品中含有脂质。
2）考马斯亮蓝G520染液中有沉淀，最后影响考马斯亮蓝-蛋白质复合物溶液的吸光度。
3）配制标准溶液时操作上可能有误差，如往试管中加入溶液时挂在管壁，且最终也没有与下方溶液混合均匀，导致标准溶液的浓度可能不准，致使标准曲线不准，数据处理时也发现数据线性并不好，尤其是浓度较大时，虽然可能是超出考马斯蓝线性范围，但不能排除操作失误的可能。 2、注意事项
1）试管提前一周清洗干净并晾干，否则制作标准曲线时无法保证各管浓度。并且不干净的试管在加溶液时容易挂管壁，不利于控制标准蛋白液浓度。
2）在配制不同浓度标准蛋白液时，各组分的体积要准确移取，特别是量较少的标准蛋白液，只要稍微洒出一点就会导致较大的相对误差
3）蛋白质粗品的洗涤一定要按照规范做，每一次离心洗涤时要将搅匀，在布氏漏斗上洗涤时要先微接抽气管，待洗出液缓慢流出后，再接紧橡皮管抽干。
；.
因篇幅问题不能全部显示，请点此查看更多更全内容