RP HPLC法测定人血浆中盐酸环丙沙星血药浓度

RP HPLC法测定人血浆中盐酸环丙沙星血药浓度

作者：崔松林

来源：《品牌与标准化》2014年第08期

【摘 要】 建立测定人血浆中的盐酸环丙沙星浓度的高效液相色谱法。方法：采用KromailC18（4.6mm×250mm）色谱柱，柱温：35℃；流动相：柠檬酸（0.05mol[⋅]L-1）-乙腈—三乙胺（80：20：0.3），流速1.0ml[⋅]min-1；检测波长277nm，检测器灵敏度0.50AU[⋅]V-1。

【关键词】 HPLC 环丙沙星 血药浓度

盐酸环丙沙星是新一代的喹诺酮类合成抗菌药，具有抗菌谱广、抗菌活性强（尤对革兰阴性杆菌作用强），同时又具有口服吸收完全，体内分布广泛等特点，国内外已广泛用于临床，取得了良好的治疗效果。健康人口服盐酸环丙沙星0.2g或0.5g后，其血药峰浓度（Cmax）分别为1.21μg[⋅]mL-1和2.5μg[⋅]mL-1，达峰时间（Tmax）为1～2小时。广泛分布至各组织、体液（包括脑脊液），组织中的浓度常超过血药浓度，蛋白结合率约为20～40%。血消除半衰期（T1/2β）为4小时。可在肝脏部分代谢，代谢物仍具较弱的活性。口服给药后24小时以原形经肾排出给药量的40%～50%。以代谢物形式排出约15%。同时亦有一部分药物经胆汁和粪便排泄。本文参考有关盐酸环丙沙星生物体内血药浓度测定方法[1]，建立了RP HPLC法测定环丙沙星在人体血浆中的药物浓度。 1 材料

仪器：日本岛津公司LC-10AT泵，KromailC18色谱柱（4.6mm×250mm），SiL-10A全自动进样器，SPD-10A型紫外可见分光光度检测器（190～600nm），NC-2000型色谱工作站。TGL-16G高速台式离心机，超声波发生器，YKH-Ⅱ型液体快速混合器（江西医疗器械厂）。 试剂：乙腈色谱纯（山东省禹王实业总公司化工厂），其它试剂均为分析纯，水为重蒸馏水，环丙沙星标准品由中国生物制品检定所提供（30451-200302）。

标准溶液（63.6μg[⋅]mL-1）：精密称取环丙沙星标准品适量，加甲醇溶解并稀释使成63.6μg[⋅]mL-1，摇匀，置冰箱中冷藏备用。 2 方法 2.1色谱条件

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色谱柱：KromailC18色谱柱（4.6mm×250mm），柱温：35℃；流动相：柠檬酸（0.05mol[⋅]L-1）-乙腈—三乙胺（80：20：0.3），流速1.0ml/min；检测波长277nm，检测器灵敏度0.50AU[⋅]V-1，20μL定量环进样。 2.2血浆样品处理方法

精密吸取血浆样品0.5mL置具塞离心管中，加入乙腈1000μL，涡旋30S，离心5min（10000r/min），分取上清液20μL进样分析。 2.3方法的专属性考察

由血浆样品按本法分离测定所得色谱图表明，空白样品中内源性物质不干扰，通过与空白样品添加标准品色谱图比较，确证6.17min色谱峰为环丙沙星色谱峰，如图1所示。 3 结果

3.1标准曲线的绘制

取空白血浆0.5mL5份分置具塞离心管中，依次加入环丙沙星标准溶液，使环丙沙星的血浆浓度分别为3.18，1.27，0.38，0.0和0.013μg[⋅]mL-1，按血浆样品处理方法处理后经HPLC测定，以环丙沙星峰面积为纵座标，浓度C（μg[⋅]mL-1）为横坐标，按加权最小二乘法[2]进行回归，得血浆标准曲线为：Y=51485.7X+4142.74，r=0.9985（权重1/c2×102），线性范围0.013～3.18μg[⋅]mL-1，最低定量限为0.013μg[⋅]mL-1。 3.2方法精密度与准确性

取空白血浆加入适量的环丙沙星标准液，配成0.013、0.382、3.18μg[⋅]mL-1质量控制（QC）样品，每一个浓度进行5样本分析，连续测定3d并与标准曲线同时进行，以当日的标准曲线计算QC样品的浓度，将QC样品的结果进行方差分析求算本法的准确度和精密度，结果见表1。

表1 人体血浆中环丙沙星准确度和精密度分析（n=15） 3.3回收率试验

于空白血浆中加入一定量的环丙沙星标准贮备液，配制成0.013、0.382、3.18μg[⋅]mL-1的系列标准血浆QC样本各3份，按“2.2”项下处理并进样分析，以实测值与理论值之比计算相对回收率（%），3种浓度下样品的相对回收率分别为（94.15±7.42）%、（101.14±4.99）%、（93.14±1.08）%，相对标准差分别为7.88%、4.93%、1.16%（n=5）。 3.4稳定性试验

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3.4.1室温稳定性

于空白血浆中加入一定量的环丙沙星标准贮备液，配制成0.013、0.382、3.18μg[⋅]mL-1的系列标准血浆QC样本各3份，于室温分别放置不同时间后按“2.2”项下处理并进样分析，与0h相比求得标准血浆样本的偏差。结果表明，标准血浆QC样本在8h内可保持稳定。 3.4.2冻融稳定性

于空白血浆中加入一定量的环丙沙星标准贮备液，配制成0.013、0.382、3.18μg[⋅]mL-1的系列标准血浆QC样本各3份，于-20℃冷冻24h，取出待完全融解后按“2.2”项下处理并进样分析，反复冻融3次，与未冻融前相比求得标准血浆样本的偏差。结果表明，标准血浆QC样本在冻融条件下可保持稳定。 3.4.2长期稳定性

于空白血浆中加入一定量的环丙沙星标准贮备液，配制成0.013、0.382、3.18μg[⋅]mL-1的系列标准血浆QC样本各3份，于-20℃分别冷冻0、7、14、21d后，取出待完全融解后按“2.2”项下处理并进样分析，与0h相比求得标准血浆样本的偏差。结果表明，标准血浆QC样本在-20℃条件下可保持30d稳定。 3.5血药浓度测定

18名男性健康受试者单剂量口服盐酸环丙沙星片500mg后，于服药前和服药后0.5，1.0，1.5，2.0，3.0，4.0，6.0，8.0，10.0，12.0，24.0h取前臂静脉血5ml，离心，分离血浆，于-20℃冷冻保存直至测定。在受试者血浆样品测定过程中，每工作日建立一条标准曲线，同时配制血浆低、中、高三个浓度（分别为0.013、0.382、3.18μg[⋅]mL-1）QC样本，每一浓度进行双样本分析，以判断当日结果的可靠性。按“2.2”项下处理并进样分析，测得18名受试者的血药浓度如表2所示。

表2 18名志愿者口服500mg环丙沙星的血药浓度（μg·mL-1） 4 讨论

本文所建立的高效液相色谱法简便、快速、准确，完全可以用来测定人体内的环丙沙星浓度，为临床药物监测提供了合理依据。 参考文献：

[1]周秦秦，傅颖君，况荣华等.高效液相色谱测定盐酸环丙沙星血药浓度及其药动学研究.中国医院药学杂志，1998，18（3）：114～116

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[2]钟大放.以加权最小二乘法建立生物分析标准曲线的若干问题.药物分析杂志，1996；16（5）：343