维普资讯 http://www.cqvip.com １２８ 中国人兽共患病学报 Ｃｈｉｎｅｓｅ ＪＯｕｒｎａｌ ｏｆ Ｚｏｏｎｏｓｅｓ 文章编号：１００２—２６９４（２００８）０２—０１２８—０４ 动物及其产品中空肠弯曲菌ＰＣＲ检测方法的建立＊ 侯建军 。，朱建国。，华修国。，郝永清。，姜 毅。，吴忠亮。 摘 要：目的 建立快速检测空肠弯曲茵的ＰＣＲ方法。方法 从鸡猪样品中分离培养获得空肠弯曲茵，以该茵特异的 ＶＳＩ基因保守序列为模板自行设计引物，扩增产物为５１６ｂｐ片段．同时进行特异性、灵敏度试验。结果 显示该方法只对空肠 弯曲茵有扩增产物出现，而其它细菌如大肠杆菌、沙门氏茵、无乳链球菌、粪链球菌、金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌ＡＴＣＣ、 腐生葡萄球菌等均不能扩增出特异性片段，检测灵敏度达６ ＣＦＵ／ｍｌ。结论 该方法具有灵敏、高效、特异、稳定的特点。 关键词：空肠弯曲茵；检测；ＰＣＲ 中图分类号：Ｒ３７８文献标识码：Ａ ＰＣＲ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ Ｊｅｊｕｎｉ ｉｎ ａｎｉｍａｌ ｏｒｇａｎｓ ａｎｄ ａｎｉｍａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ＨＯＵ ｌｉａｎ－ｊｕｎ。 ，ＺＨＵ Ｊｉａｎ－ｇｕｏ。，ＨＵＡ Ｘｉｕ—ｇｕｏ。，ＨＡＯ Ｙｏｎｇ—ｑｉｎｇ。，ＪＩＡＮＧ—Ｙｉ。，ＷＵ Ｚｈｏｎｇ—ｌｉａｎｇ。 （１．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｊｉａｏｔｏｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｈａｎｇｈａｉ ２００２４０，Ｃｈｉｎａ； ２．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ａｎｉｍａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｉｎｎｅｒ Ｍｏｎｇｏｌｉａ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｕｈｅｈａｏｔｅ，０１００１８ Ｃｈｉｎａ） ＡＢＳＴＲＡＣＴ：Ｔｈｅ ＰＣＲ ａｓｓａｙ ｗａｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊ ｕｎｉ ｉｎ ａｎｉｍａｌ ｏｒｇａｎｓ ａｎｄ ａｎｉｍａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ｉｎ ｗｈｉｃｈ ａ ｐａｉｒ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗａｓ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔＯ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｅｓ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ＶＳｌｇｅｎｅ ａｎｄ ｕｓｅｄ ａｓ ｔｅｍｐｌａｔｅ ｉｎ ＰＣＲ ａｓｓａｙ．Ｔｈｅ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔ ｗａｓ ａ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ５ １ ６ ｂｐｓ ｉｎ ｌｅｎｇｔｈ．Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ，ｔｅｓｔｉｎｇｓ ｉｎ ｓｐｅｃｉ－ ｉｆｃｉｔｙ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｗｅｒｅ ａｌｓｏ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ａｓ ｕｓｕａ１．Ｉｔ ｗａｓ ｆｏｕｎｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｃｃｕｒｒｅｄ ｏｎｌｙ ｆｏｒ Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ａｓ ｄｅｍ— ｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｂｙ ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ａｓｓａｙ，ａｎｄ ｎｏ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｔＯ ｏｔｈｅｒ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ，ｓｕｃｈ ａｓ Ｅ．ｃｏｌｉ， Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ，Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ，Ｓ．ｆａｃａｌｉｓ．Ｓ￡口 ＾ Ｚ０ｃ０ｃｃ“ｓ ａｕｒｅｕｓ ＡＴＣＣ ａｎｄ ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃ ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ．Ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｐｐｅａｒｅｄ ｔＯ ｂｅ ６ ｃｆｕ／ｍ１．Ｉｔ ｉｓ ｅｖｉｄｅｎｔ ｔｈａｔ ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ａｓｓａｙ ｉｓ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ，ｓｐｅｃｉｆｉｃ，ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｎｄ ｑｕｉｔｅ ｓｔａｂｌｅ． ＫＥＹ ＷＯＲＤＳ：Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉ；ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ；ＰＣＲ 空肠弯曲菌（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉ）是弯曲菌 属的一种，是近十几年来受到国内外广泛重视的人 的趋势 。我国在上海、北京、福建等地多次报道经 食物感染该菌并引发疾病，世界卫生组织已将该病 列为最常见的食源性传染病之一㈣。 空肠弯曲菌培养条件苛刻，在２５℃不生长，４２ ℃生长良好容易进人ＶＢＮＣ状态，使得常规的分离 畜共患病原菌，主要可引起人体急性肠炎和食物中 毒，并伴发反应性关节炎、肝炎、瑞特氏病和格林一巴 利综合症（Ｇｕｉｌｌａｉｎ－Ｂａｒｒｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ，ＧＢＳ）等免疫 性损伤性疾病。在兽医学上，可引起家畜流产不孕、 乳房炎及幼畜禽腹泻和家禽肝炎。该菌通过动物带 菌者或患病者的粪便进人环境中，并在水环境中可 以进人一种称为“活的非可培养”（Ｖｉａｂｌｅ ｂｕｔ ｎｏｎ— ｃｕｌｔｕｒｅｒ－ａｂｌｅ，ＶＢＮＣ）状态的休眠期，处于ＶＢＮＣ 培养和生化鉴定耗时费力、灵敏度不高，所需时间长 （一般需要４８—７２ ｈ），而不利于暴发疫情的快速诊 断，也不符合临床病原菌检测所要求的快速、准确的 原则。因此，与传统方法对照，建立一种快速、简便、 可靠的检测方法十分必要。近年来，ＰＣＲ方法取得 了长足发展，它具有灵敏度高、特异性强、检测快速 状态的细菌在特定条件下可以复苏且具有致 病性ｎ 。 等优点。建立空肠弯曲菌快速而特异性的分离和检 ＊上海市技术标准专项（０６ＤＺ０５１３２）资助 通讯作者；朱建国，Ｅｍａｉｌ：ｚｈｕ＿ｊｇ＠ｓｊｔｕ．ｅｄｕ．ｃｎ 作者单位：１．上海交通大学农业与生物学院，上海 ２００２４０； ２．内蒙古农业大学动物科学与医学学院，呼和浩特 ０１００１８ 接触畜禽类，或食人受到污染的禽制品、水源和 牛奶是该菌感染人体的主要途径。国外流行病学调 查表明，该菌作为肠炎的病因仅次于沙门氏菌和志 贺氏菌，在很多地区甚至有超过沙门氏菌而居首位 维普资讯 http://www.cqvip.com 中国人兽共患病学报 Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊ ｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｚｏｏｎｏｓｅｓ １２９ 测方法，是有效控制和预防该类食源性传染病的关 键所在。本实验旨在建立一种能检测动物及其产品 １．２．２．１ ＰＣＲ引物设计与合成：根据网上（ｈｔ— ｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／Ｐｒｏｊｅｃｔｓ／Ｃ—ｊ￣ｕｎｉ／）公布 中空肠弯曲菌的快速、简洁、准确的ＰＣＲ方法。 １材料与方法 的空肠弯曲菌ＶＳ１基因序列中的保守片段用 Ｐｒｅｍｉｅｒ ５．０软件设计一对特异引物。由上海申能 １．１材料 博彩生物科技有限公司合成。引物序列如下：Ｖ 鸡肝脏、盲肠、泄殖腔拭子（上海 Ｆ：５’ＴＡＣ ＧＡＴ ＴＴＧ ＴＴＴ ＣＡＴ ＴＧ ３’；ＶＳ—Ｒ： ５’ＡＴＴ ＴＣＴ ＴＴＡ ＧＣＡ ＧＧＣ ＡＴＡ ３， １．１．１检测样品市郊某家禽市场）；猪肝脏、盲肠、粪便样本（上海市 五家生猪屠宰场）。 １．２．２．２模板ＤＮＡ的提取取灭菌的１．５ ｍｌ ＥＰ １．１．２主要仪器和设备 １．１．２．１微需氧培养设备 大体积干燥皿，蜡烛， 凡士林，焦性没食子酸和无水碳酸钠。 １．１．２．２ 其它仪器和设备ＰＴＣ－２００ ＰＣＲ仪： ＢＩＯ—ＲＡＤ；ＤＹ—Ａ电泳仪：上海康达仪器厂；凝胶图 像处理系统：天能ＧＩＳ一１０００；ＤＫ一８Ｂ型电热恒温水 槽：上海精宏实验设备有限公司；台式高速冷冻离心 机：Ｈｅｒａｕｅｕｓ ＵＳＡ。 １．１．３ 培养基和试剂 改良Ｃａｍｐ—ＢＡＰ培养基 用于空肠弯曲菌选择性分离培养，购自青岛高科园 海博生物科技有限公司。配制改良布氏肉汤的各试 剂均购自上海前尘生物科技有限公司。ＰＣＲ相关 试剂均购于上海天根生化科技有限公司。 １．２实验方法 １．２．１ 细菌培养 １．２．１ 细菌分离培养及鉴定 空肠弯曲菌的分离 培养，一般采用直接划平皿培养法，用接菌环挑取少 量样品直接接种在改良Ｃａｍｐ—ＢＡＰ选择培养基上， 置于大体积干燥皿中，点燃蜡烛，按每１Ｌ容积各 ２．５ ｇ的用量加入焦性没食子酸和无水碳酸钠，混合 均匀，涂抹凡士林封口。４２℃培养２４￣４８ ｈ。挑取 改良Ｃａｍｐ－ＢＡＰ培养基上生长出的扁平、灰色不闪 光、半透明、白色、棕黄色（可能出现浅红色）凸起、边 缘不整齐、有时沿接种线向外扩散的典型菌落，涂片 作瑞氏一姬姆萨染色镜检，做甘氨酸、３．５ ＮａＣ１溶 液、Ｈ：Ｓ、对萘啶酮酸及马尿酸水解反应等相关生化 鉴定。结果显示，过氧化氢酶、氧化酶、１ 甘氨酸 试验、Ｈ：Ｓ试验、４２℃生长、硝酸盐还原试验和马尿 酸钠水解试验均为阳性，而３．５ ＮａＣ１耐受试验、 ２５℃生长、萘啶酸试验和ＴＴＣ试验为阴性，进一步 确定为空肠弯曲菌。 空肠弯曲菌（Ｃ．ｊｅ）ｕｎｉ Ｉ、Ｃ．ｊｅ）ｕｎｉⅡ、Ｃ．ｊｅ— ｊｕｎｉ ＩＩＩ）由实验室分离获得，未进行详细分型。大肠 杆菌、沙门氏菌、无乳链球菌、粪链球菌、金黄色葡萄 球菌、金黄色葡萄球菌ＡＴＣＣ、腐生葡萄球菌均由本 实验室提供。 １．２．２ ＰＣＲ检测方法的建立 管，加满改良布氏肉汤，以达到微氧环境，用接菌针 挑取少量样品接入改良布氏肉汤中，盖上盖子置于 ４２℃恒温水浴中培养４８ ｈ。样品的增菌方法参照 ＳＮ０１７５—９２进行。所得菌液按分子克隆实验指南 的ＤＮＡ提取方法操作。所得模板ＤＮＡ置一２０ ℃，备用。 １．２．２．３ ＰＣＲ反应体系和循环参数扩增反应总 体积为２５ ｌ，其中灭菌重蒸水８．５ ｌ，ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ— Ｍｉｘ １２．５／１１（包括ＤＮＡＴａｑ Ｅ、ｄＮＴＰ、ｂｕｆｆｅｒ、 Ｍｇ。 ），２０ ｐｍｏｌ／Ｌ引物各１ ｌ，模板ＤＮＡ ２ ｌ。置 ＤＮＡ扩增仪上进行自动化扩增反应．循环参数为 ９４℃预变性５ｍｉｎ，９４℃３０ｓ，５８℃６０ｓ，７２℃ ６０ｓ，共３５个循环，最后７２℃延伸１０ ｍｉｎ。 １．２．２．４ ＰＣＲ扩增产物的鉴定 参考文献配置 １ 的琼脂糖凝胶．按０．５ｍｇ／Ｌ加溴化乙锭（ＥＢ）制 胶。取５ ｌ ＰＣＲ产物和１ ｌ １０×ｌｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ混 合加样。用ＤＬ２０００ Ｍａｒｋｅｒ对照。９０Ｖ电压电泳 ４０ｒａｉｎ取胶置于天能ＧＩＳ－ＩＯ００凝胶成像系统拍摄 和分析电泳结果。 ＰＣＲ产物的测序鉴定，取ＰＣＲ产物送上海捷 瑞生物工程有限公司进行测序。 １．２．２．５灵敏度检测 挑单个菌落接入改良布氏 肉汤培养２４～４８ ｈ。取菌液以１０＿。、１０＿。、１０＿‘、 １０＿。。、１０＿。。、１０～、１０＿。、１０ 倍稀释。每个稀释度的 菌液分别取２００ｇｌ，一份用作ＤＮＡ提取，进行ＰＣＲ 检测，一份涂布于改良Ｃａｍｐ－ＢＡＰ培养基，平板置 微需氧环境中（５ Ｏ：，１０％ＣＯ：，８５ Ｎ：）培养 ２４ｈ后，菌落计数。 １．２．２．６特异性鉴定 取实验室分离获得的空肠 弯曲菌（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ Ｉ、Ｃ．ｊｅ）ｕｎｉⅡ、Ｃ．ｊｅ）ｕｎｉⅢ）和 其它七种（大肠杆菌、沙门氏菌、无乳链球菌、粪链球 菌、金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌ＡＴＣＣ、腐生 葡萄球菌）细菌悬液，提取ＤＮＡ进行ＰＣＲ检测，从 而确定该方法的特异性。 ２ 结 果 ２．１ 细菌培养 本实验根据实际情况选用了普通 烛缸法与焦性末食子酸法相结合的培养方法，同时 维普资讯 http://www.cqvip.com 130中国人Chinese兽足患病Journa。t报oseslofZoon^采用空肠弯曲菌选择性改良CampBAP。培养基成，42C可以吸收环境中多余酸和无水碳酸钠混合峥存呻呻呻呻1_，Un^U^～U7■n●0●^U一0U8OnXunu^U功的从所采样本中分离获得空肠弯曲阿，分离闲株。的氰气同时点燃蜡烛可以增加，(()!、含量从而造成．经常规生化指标的测定确定为卒肠弯曲菌2．做氧环境，。同时实验采用的是改良CampBAP培。2，PCR10。方法的灵敏度PCR方法的敏感性试验，养基成功的从所采样本巾分离获得空肠弯曲菌中倍菌液还能扩增出特异件片段，mlO“倍实验室已经通过对榨制培养基中符种抗生素的添加量和制造J犬氧环境的焦性没食子酸l尢水碳酸钠的、菌液则不能扩增特异性片段菌液平板记数算出10j倍菌液含菌体6c6cfu／ml所以该PCR方法的检，添加量实现了对培养条什的优化提高r卒肠弯曲，．测敏感度为2．fu／ml。菌的榆出率PCR。3PCR．方法的特异性PCR方法的特异Hi电泳。另外在增菌培养过程巾我们埘实验操作做了，结果显示该．方法只对空肠弯曲菌能扩增出特、改进，。实验中将改良布氏肉汤分装丁，1．5mlEP。管异性片段而其它大肠杆菌沙门氏闲兀乳链球菌、、中装满为止然后将菌接在改良布氏肉汤巾盖I：盖子利用液面的封闭效果将空气挤压f1J去从m造，．粪链球菌AFCC’、金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌。、腐生葡萄球菌等均不能扩增出特异性片段成了微需氧环境培养是在，42C恒温水浴箱L}J进。通过天能GIS1000，凝胶成像系统对该特异片段进516bp，行恒定的温度更有利丁空肠弯曲菌的生长，仃迁移率计算计算其大小为相符。与预期的¨段‘3．2关于PCR：方法jo一H前对i(、j巧uni的榆测存。PCR产物测序结果表明其序列与网上公布1『)0住两个l’口J题(7．un感染剂量低秆1生长缓慢‘传的序列同源性达剑l％电泳结果见图，110。统的生化检测是项费时货事的力法需要长时间、，23456789的培养和选择性培养增菌去除其它细菌的r扰最．后进行生化鉴定，。虽然苛刎而费叫且敏感性和持，异性不高但常规生化检测是其它方法的金标准．“”。因此前期分离鉴定空肠弯曲菌就是用的常规牛化方法。也正是南于十化检测存实际应用当中准确度，，上生化检测费时费力所以被越来越多小高再JJⅡ，的其它检测方法所代替图Figl．j、。PCR1PCR方法特异性的扩增结果amar近年米分子生物学技术的发展为丌辟卒肠弯，．plificationresultsromoftospeptcoiality1：MkerDI．2000(F250bp、．do：wnare2kbi，lkb：曲菌检测新途径提供了叮能。特别是利用、PCP,、技750bpJ吖…．500bp．，100bp)[；2fli’．J．rjSMI；3(、术建立的检测方法具有灵敏度高特异性强检测快速等优点取得了长足发展，。jⅡ；4：(，吖unⅢ；5：Ee；．co’；6alm9．oneslalla；7有许多大丁利用，PCRIiu。Streptococcusag0alasactiaro8．Sc．d，(alis；phylo方法榆测，Cj0．Ⅲli的研究报道AGuangming’’COCCUSatlFeus：1．piphytstaphylococci等针对空肠弯曲菌鞭毛蛋白(flaA)基因和马尿，33．讨1论酸酶(hip())基冈设计了两组引物与荧光标记探针空肠弯曲菌培养条件比，关于细菌分离培养．首次建立r卒肠弯卡T曲菌的磁捕获荧光聚合酶链式反应(IMC较苛刻其生长需要微需氧培养条件(5％O：(()!、10％，FPCR)快速检测及鉴定方法提高了，。，85％N!)，且具有非可培养状态“”(VNC)。。环境样品及食品巾空肠弯曲情的检出率王振国、。能在环境条件不良时进入低代谢活力的休眠状态，，等应用实时荧光，PCR。技术建立一种特异敏感的存活但不增殖冈此在常规的分离培养中榆出率很空肠弯曲菌检测方法通过对空肠弯曲菌基因组的Ta低。解决培养条件已成为榆测空肠弯曲菌实验巾的。保守序列进行分析来设计引物及qman探针该，重要问题少一国内目前培养该茼的专用设备还比较，。方法具有较强的灵敏性及特异性能够对空肠弯曲菌进行有效的检测。。而且价格昂贵小易基层推广除少数单位外，，般多采用烛缸法来降低氧压培养该菌但检出率。本实验所应用的足以VSl基因为目标片段只．，往往偏低根据实际情况本实验选用丫普通烛缸法。有对空肠弯曲菌才能扩增出特异性片段而其它弯曲菌和其它属的细菌都不能扩增Ⅲ特异性片段的快速敏感特异的、与焦性木食子酸法相结合的方法一普通烛缸法是用当烛光熄火时缸，个大体积的玻璃钟罩(下，u最好能有磨砂面)放入口。、PCR方法。MSl、基因是牵肠弯曲．点燃的蜡烛用凡士林涂抹封内仍含有17，蔺基冈组中具有很高特芹性保守性的遗传序列使陔方法的灵敏度和特异性得以提高“。％()：达不到微氧环境而焦性没食子幽内外所报维普资讯 http://www.cqvip.com 中国人兽共患病学报 Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊ ｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｚｏｏｎｏｓｅｓ １３１ 道的ＰＣＲ方法大都没有把空肠弯曲菌和结肠弯曲 菌鉴别开来 ∞，而该方法为鉴别空肠弯曲菌和结 肠弯曲菌提供了一种简便的方法。ＰＣＲ产物纯化 后测序结果表明ＰＣＲ产物序列与网上公布的序列 同源性达到ｉ００ 。结果表明该ＰＣＲ方法是特异 （２３ Ｓａｈｉｎ Ｏ，Ｋｏｂａｌｋａ Ｐ，ＺｈａｎｇＱ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ Ｃａｍｐｙ— ｌｏｂａｃｔｅｒ ｉｎ ｃｈｉｃｋｅｎ ｅｇｇｓ［Ｊ］．Ｊ Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００３，１９９５： １０７０—１０７９． （３３Ｓｈｕ Ｙ Ｗ，Ｚｈａｎｇ Ｌ Ｓ，Ｒａｎ Ｌｕ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ａｎｄ ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ－ｉｏｓｉｓ［Ｊ］．Ｃｈｉｎ Ｊ Ｆｏｏｄ Ｈｙｇｉｅｎｅ，２００４，１： ５８—６１． 的，且敏感度达到６ ｃｆｕ／ｍｌ，敏感度非常高。与其它 ＰＣＲ方法相比，该方法引物设计简便，且特异性高， （４３ Ｈｅｇｅ Ｋａｒｉｎ Ｎｏｇｖａ，Ａｎｅｔｅ Ｂｅｒｇｈ，ｅｔ ａ１．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ５‘ ｎｕｃｌｅｓａｅ ＰＣＲ ａｓｓａｙ ｉｎ ａｖａｌｕａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｍｅｔｈｏｓ ｆｏｒ 需要的仪器设备简单，成本较低，在检测周期上，从 样品制备开始可在４８ ｈ内给出结果，期间仅需１次 ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ［Ｊ］．Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０００，４０２９—４０３６． （５３胡哲，王振国，刘金华，等．利用ＰＣＲ技术检测鸡肉产品中的空肠 微需氧培养；而常规分离及生化鉴定方法得阳性结 果至少需要连续７ ｄ，期间至少需要４次微需氧培 养，实验条件高且相对较难控制。因此，与常规分离 及生化鉴定法相比，该方法具有快速、简便、灵敏、特 异的特点ｎＨ∞，适合在基层广泛推广。 ＰＣＲ技术能快速、特异地扩增所希望的目的基 因，并能很容易便得纳克水平的起始靶序列达到微 克水平的量，不过实际应用的一个最大缺点是容易 造成假阳性。近年来对空肠弯曲菌的分类和检测等 各项研究得以重视，并飞速发展，新的检测方法不断 出现。ＰＣＲ及其相关技术用于空肠弯曲菌的鉴定、 诊断研究已取得了较大的进展。当然也应该看到， 由于ＰＣＲ及其相关技术用于空肠弯曲菌的鉴定、诊 断研究尚处在研究阶段，有多种因素限制其推广应 用，因此在很多方面还需要作进一步的研究加以 改进。 参考文献： Ｃ１］Ｔ Ｖａｎｎｉａｓｉｎｋａｍ，Ｌａｎｓｅｒ Ｊ Ａ，ｅｔ ａ１．ＰＣＲ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｏｎ ｏｆ Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．ｉｎ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ ｌｅｔｔｅｒｓ ｉｎ ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉ— ｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊ）．１９９９，２８：５２—５６． 弯曲菌（Ｊ３．吉林农业大学学报，２００５，２７（６）：６７１—６７４． （６３ Ｌｉｕ Ｇ Ｍ，Ｈａｎ Ｙ １，Ｌｉ Ｘ。ｅｔ ａ１．Ａｐｐｌｉｃａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｆｌ ｒａｐｉｄ ｍｅｔｈｏｄ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃ ｃａｐｔｕｒｅ－ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ＰＣＲ ａｓｓａｙ ｆｏｒ Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉ（Ｊ３．Ｆｏｏｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ，２００６，１７（７）：５２７—５３２． （７３王振国，刘金华，徐宝梁，等．应用实时荧光ＰＣＲ技术检测空肠 弯曲菌（Ｊ３．中国人兽共患病杂志，２００５，２１（１２）：１０９７—１０９９． （８）Ｙａｎｇ Ｃ，Ｊｉａｎｇ Ｙ，Ｈｕａｎｇ Ｋ，ｅｔ ａ１．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ Ｊｄｕｎｉ ｉｎ ｐｏｕｌｔｒｙ， ｍｉｌｋ ａｎｄ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｗａｔｅｒ（Ｊ）．ＦＥＭＳ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｄ Ｍｉｃｒｏ— ｂｉｏｌ，２００３，３８（３）：２６５－７１． （９３ Ｈｏｎｇ Ｙ，Ｂｅｒｒａｎｇ ＭＥ，Ｌｉｕ Ｔ，ｅｔ ａ１．Ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｍｐｙ— ｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｏｌｉ，Ｃ ｊｅｊｕｎｉ，ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｏｎ ｐｏｕｌｔｒｙ ｃａｒ－ ｃａｓｓｅｓ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ＰＣＲ－ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ［Ｊ］． Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏ１．２００３，６９（６）：３４９２—９． （１０３韩伟，顾鸣．聚合酶链反应与自动荧光免疫酶标检测弯曲菌属 的试验（Ｊ３．检验检疫科学，２００３，１３（３）：３２－３４． ［１ １３ Ｐｅｂｏｄｙ，Ｒｙａｎ，ｅｔ ａ１．Ｏｕｔｂｒｅａｋｓ ｏｆ ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ： ｒａｒｅｅｖｅｎｔｓ ｆｏｒ ｆｌ ｃｏｍｍｏｎ ｐａｔｈｇｅｎ（Ｊ３．Ｃｏｍｍｕｎ—Ｄｉｓ—Ｒｅｐ－ＣＤＲ－ Ｒｅｖ，１９９７，７；７（３）：Ｒ３３－７． （１２３ Ａｌｌｏｓ Ｂ Ｍ．Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ｝ｕｐｄａｔｅ ｏｎ ｅｍｅｒ— ｇｉｎｇ ｉｓｓｕｓｅ ａｎｄ ｔｒａｎｄｓ［Ｊ３．Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｖｅ ｄｉｓｅａｓｅ，２００１，３２ （８）：１２０１－６． 收稿日期：２００７—１０－０３；修回日期：２００７－１１—３０
