*影响温永琴，徐咏强，何建芳，黄会杰，朱莹，周婵，张丽君东莞市人民医院病理科(广东东莞523059)【摘要】 目的 探讨乳腺癌患者组织中KB1基因及蛋白表达与临床特征的关系，并采用生物信息学分
析RB1基因表达与突变对临床预后的影响 方法 选择行手术治疗的乳腺癌患者共250例，采用免疫组化 染色检测癌和癌旁组织中RB1的表达水平，分析RB1表达和临床特征及预后的关系，采用生物信息学分析不
同RB1基因表达水平以及RB1基因突变对乳腺癌患者患者预后的影响:结果 乳腺癌组织的RB1表达水
平显著低于正常癌旁组织，差异有统计学意义(/\"()• ()5),RB1低表达的患者其肿瘤最大径M3 cm、淋巴结转
移以及TNM分期为Hl ~ IV期的患者比例均显著高于RB1高表达的患者(P<0. 05) Kaplan - Meier Plotter数
据库结果显示RB1高表达患者的无复发生存率显著优于RB1低表达的患者(P <0.001),而cBioPortal数据 库结果显示RB1基因突变的乳腺癌患者其总体存活率显著低于非突变的患者(P二0.041),Cox多因素模型 分析结果显示乳腺癌患者的TNM分期及RB1表达水平显著影响患者的临床预后(PvO.05)：结论 乳腺癌 RB1表达水平与肿瘤的大小、淋巴结转移及临床预后密切相关，RB1基因高表达显著改善乳腺癌患者的临床
预后，合并RB1基因突变的乳腺癌患者预后较差【关键词】RB1;乳腺癌；突变；表达水平；临床预后【中图分类号】R737.9；R446 【文献标志码】ADOI： 10. 13820/j. cnki. gdyx. 20192150Effect of RBI gene expression and mutation on the prognosis of breast cancer patients. WEN Yong - qin, XU
Yong - qi(ing, HE Jian 一fang、HUANG Hui -jie, ZHU Ying ZHOU Chan , ZHANG Li -jun. Department of Pathology,
Dongguan People's Hospitalt Dongguan 523059, Guangdong, China[Abstract ] Objective To investigate the correlations between RBI expression and clinical features in breast
cancer patients, and to analyze the effects of RBI gene expression and mutation on the prognosis. Methods A total of
25() patients with breast cancer received surgery in our hospital from January 2015 to June 2017 were selected. The expression of Kl)l in cancer and paracancerous tissues was detected by immunohistochemical staining. The coiTelations between
Khl expression and clinical features and prognosis was analyzed. The effects of different Rl)l gene expression levels and
Rbl genr mutation on the prognosis of breast cancer patients was analyzed. Results The expression level of Rbl in breast cancer tissues was significantly lower than that in normal adjacent tissues ( P V 0. 05 ) . The proportions of patients with
tumor size M3 cm, lymph node metastasis and TNM stage HI 一 IV with in low Rbl expression patients were significantly
higher than those in patients with high Rbl expression ( P < 0. 05 ). The Kaplan 一 Meier Plotter database showed that the recurrence - free survival rale of patients with high Rbl expression was significantly higher than those with low Rbl expres
sion (P <0. 001 ). The cBioPortal database showed that the overall sun ival of breast cancer patients with Rbl mutation was significantly lower than that of non - mutant patients (P=0. 041 ). Cox multivariate model analysis showed that TNM
stage and Rbl expression level in breast cancer patients significantly affected the prognosis of patients ( P < 0. 05 ) . Con
clusion The expression of Rbl in breast cancer is closely correlated to tumor size, lymph node metastasis and clinical
prognosis. The high expression of Rbl gene significantly improves the prognosis. The prognosis of breast cancer patients
with Rbl gene mutation is poor.[Key words] Rl)l ; breast cancer； mutation; expression level ； clinical prognosis*基金项目：东莞市社会科技发展(一般)项0(201650715(X)1384)・382・广东医学 2020 年 2 月第41 卷第4 期 Guangdong Medical Journal Feb. 2020, Vol. 41 , No. 4视网膜母细胞瘤(retinoblastoma, Rb )基因1 (RBI)是肿瘤抑制基因。RB1是第1个被克隆的肿 瘤抑制基因，RB1对人类视网膜母细胞瘤的发生发 展具有重要的作用⑴。既往研究⑵表明，RB1基因 在乳腺癌患者中经常发生突变，特别是在三阴性乳
腺癌中。Rb蛋白主要作为转录辅因子起作用，它能 结合激活E2Fs,E2Fl/2/3a的反式激活结构域，并 募集染色质修饰因子如组蛋白脱乙酰酶和甲基化酶
以沉默基因表达⑶。Rb蛋白也结合多种其他细胞 蛋白⑷，但它主要通过激活E2F的调节发挥其对细
胞增殖和存活的抑制作用：既往研究⑴显示Rb基 因缺失可导致细胞增殖的失调从而促进了癌症的生
长,且在大多数类型的癌症中，Rb蛋白的失活伴随 着诸如P53的失活从而促进肿瘤存活途径的诱导：
同时,RB1基因的缺失直接影响了肿瘤患者的药物
使用，既往对于RB1基因的研究主要集中在肺癌、 卵巢癌以及膀胱癌⑷，但RB1基因表达及蛋白的表 达水平在乳腺癌中的作用仍未明确。因此,进一步
明确RB1基因及其蛋白在乳腺癌中的表达水平对 临床特征及预后的影响，对乳腺癌的防治具有重要 意义。本研究旨在探讨乳腺癌患者组织中KBI基
因及蛋白表达与临床特征的关系，并分析RB1基因 表达与突变对临床预后的影响。1资料与方法I. I 一般资料 选择2015年1月至2017年6月
于我院行手术治疗的乳腺癌患者共250例，取其保 存的病理石蜡切片进行检查.纳入标准：(1 )经病理 确诊为乳腺癌；(2)术前未行新辅助放化疗；(3)所
有患者获得完整随访。排除病历资料不完整或失访 的患者，以及合并机体免疫性疾病或长期使用激素 治疗的患者所有标本均取其癌组织和癌旁组织
进行后续研究，本研究获得医院伦理委员会审核 并批准。250例乳腺癌患者，年龄35 ~71岁，平均
(54.6±7.3)岁。记录所有患者的基本临床资料， 包括肿瘤大小、组织分级、淋巴结转移、表皮生长因
子受体2( HER2)、雌激素受体(ER)、孕酮受体
(PR)以及TNM分期;1.2免疫组化检测 将石蜡包埋的乳腺癌组织和
癌旁正常组织以5)xm厚度进行组织切片。将组织 切片进行脱蜡水化后，采用柠檬酸盐缓冲液中进行 抗原修复，应用过氧化氢阻断内源性过氧化物酶活
性。采用山羊血清进行封闭后,采用兔Anti - RB - 1抗体(ab224426, Abeam)以］：100稀释后，在4弋 条件下进行一抗孵育过夜，随后在室温条件下与
HRP标记的山羊二抗孵育。最后采用二氨基联苯 胺(DAB)作为底物进行变色反应，然后苏木精复染
并封片。所有切片RB1的表达水平由2位有经验
的病理师在随机选择5个高倍镜视野(200 x )进行 评估，具体的评估方法为：染色强度(0为未染色；1
为弱染；2为中等染；3为强染).同时记录阳性表
达RB1的范围(计分为0： <5%； 1：5% -25% ； 2：
26% -50% ； 3;51% -75% ； 4：76% ~ 100% )o 将
RB1的染色强度计分和阳性表达范相乘以获得复合
表达分数(composite expression score, CES )17，将得 到RBI的表达水平的CES,将患者分为两组，RB1
低表达(CES <6)和高表达组(CESM6)。1.3 RB1表达的生物信息学分析 采用Kaplan -
Meier Plotter 工具(http：//kmplot. com/analysis/)分 析RBI基因与乳腺癌患者临床预后的关系。采用
cBioPortal 工具(http：//www. cbioportal. org/)分析
RBI基因在乳腺癌病例集中的突变水平，并分析乳
腺癌患者RB1基因突变与非突变患者临床预后的 关系。1.4 统计学方法 采用GraphPad Prism 7. 0软件
统计数据，计量资料采用，士 s表示，比较采用t检
验，计数资料采用百分比表示，比较采用X2检验。 使用Kaplan - Meier生存曲线和log - rank检验对比 不同RB1表达水平对乳腺癌患者总体生存率的影
响，采用Cox风险比例模型进行多因素分析，以
P <0. 05为差异有统计学意义。2结果2. I RB1在乳腺癌和癌旁组织的表达水平对比
250例患者的乳腺癌和癌旁组织中，其中乳腺癌组 织的RB1表达水平的CES得分平均为4.8 ±1.6, 而癌旁组织为5.2±2. 1,其中乳腺癌组织的RB1表 达水平显著低于正常癌旁组织，差异有统计学意义
(P<0.05),不同表达RB1水平的癌组织和癌旁组
织见图U2.2 乳腺癌RB1表达水平与乳腺癌临床特征的关 系 其中RB1表达水平与乳腺癌的年龄、组织分
级、HER2、ER和PR的阳性比例均没有显著的相关
性(P>0.05),而RB1低表达的患者其肿瘤最大径
33 cm、淋巴结转移以及TNM分期为in ~ IV期的患
者比例均显著高于RB1高表达的患者，差异有统计
学意义(P<0. 05),见表1。2.3 乳腺癌组织中RB1表达水平与临床预后的关 系250例乳腺癌患者随访时间为6 ~47个月，中
位随访时间为33个月，其中RB1高表达的患者其广东医学 2020 年 2 月第 41 卷第 4 期 Guangdong Medical Journal Feb. 2020, Vol. 41 , No. 4• 383 •总体生存率显著高于KB1低表达的患者，差异有统
因，也参与了乳腺癌在内的许多人类癌症的发生和
计学意义(HR = 0. 56,95% C/：0. 32 ~0.97,P = 进展。同时，有研究〔卬显示RB1和TP53在28% ~
0. 036 )o 见图 2~3。2.4 RB1表达与乳腺癌临床预后的多元Cox回归
分析Cox多因素模型分析结果显示乳腺癌患者的
40%的三阴性乳腺癌患者中一起存在失活状态，且 通常由纯合缺失引起的KB基因缺失主要发生在三 阴性乳腺癌中。然而,在内分泌治疗后的促转移性
TNM分期及RB1表达水平显著影响患者的临床预
后(P<0. 05),见表 2。肿瘤微环境中，RB1表达损失更加明显。既往研
究显示RB也可以通过由含有CDK4/6的复合物
3讨论乳腺癌是一种异质性疾病，其中不同的病理学 和基因表现影响患者的临床预后和治疗方案\"通 常,ER和PR或HER2扩增状态的存在直接影响了
引发的磷酸化而失活。在乳腺癌中,异常的CDK4/
6活性可解除对RB磷酸化的正常控制，活性细胞 周期蛋白-CDK复合物对Rb(pRb)的磷酸化导致
E2F家族转录因子的释放，以及S期进入所需基因 的转录。CDK4/6作为治疗靶标的重要性现已在
治疗的过程\"。由于乳腺癌中复杂的分子机制，既 往研究、表明，RB1和Tp53是肿瘤的重要抑癌基
ER/PR阳性乳腺癌中得到充分证实。但即使这些・384・广东医学 2020 年 2 月第 41 卷第 4 期 Guangdong Medical Journal Feb. 2020, Vol. 41 , No. 4表1乳腺癌组织中RB1表达水平与临床特征的关系 例（％JRBI临床特征高表达低表达X2值P值5 = 106)(n = 144)年龄0.2040.651W50岁59(55.7)76(52.8)>50岁47(44.3)68(47.2)肿瘤最大径M3 cm48(45.3)78(54.2)4.2060.040< 3 cm68(64.2)66(45.8)组织分级0.2240.636I ~ II 级52(49.1)75(52.1)皿级54(50.9)69(47.9)淋巴结转移5.8600.015阴性45(42.5)40(27.8)阳性61(57.5)104(72.2)HER2阴性76(52.8)93(64.6)1.4110.235阳性30(28.3)51(35.4)ER阴性56(52.8)87(60.4)0.3400.560阳性50(47.2)67(46.5)PR0.2410.623阴性69(65.1)98(68. 1)阳性37(34.9)46(31.9)TNM分期7.3980.007I ~ II 期42(39.6)34(23.6)m ~iv 期64(60.4)110(76.4)药物有效,仍难以阻碍疾病的临床进展，这可能与
RB1基因表达损失的有关。由于RB1基因与乳腺 癌存在密切的关系，但目前对于RB1基因、蛋白表
达水平以及其突变对于乳腺癌患者临床预后的影响
仍未明确。本研究拟通过临床样本以及生物信息学 初步明确了 RB1基因和蛋白高表达是乳腺癌预后 良好的标记物，但RB1基因突变的乳腺癌患者预后
不良。RB1基因表达水平与肿瘤大小、淋巴结转移以
及TNM分期密切相关，表明了抑癌基因RB1基因发 生突变是影响乳腺癌预后不良的重要风险因素。肿瘤抑制基因RB1基因调节细胞周期导致细
胞分裂的过程，并且CDK4和CDK6酶阻断RB1活 性，这可导致不受控制的细胞增殖和生长〔⑵。因
此，本研究结果显示，RB1蛋白在乳腺癌中的表达水 平显著下降，且RB1蛋白在乳腺癌中的表达水平与 肿瘤大小和淋巴结转移密切相关，本研究结果与既
往研究结果表明RB1基因在肿瘤细胞周期调控
的重要作用相一致。虽然乳腺癌的CDK 4/6抑制 剂可以抑制肿瘤的增殖，但容易在治疗反应数月后A1.0-0.8-0.2-低表达 0.0-咼表达iii050100150200250300时间（月）Number at nskow 929 706332
951520high 47337714534610Bi.o-HR=0.81 (0.72-0.9) log rank P= 1 e-040.8 -Rbl高表达汕6-
Rbl低表达哥 0.4 -0.2-低表达 0.0-高表达050100150200250时间（月）low 1997Number1269 at nsk583129152high 19541250492112121(％)稔却廿
注：A：不同RB1表达水平对乳腺癌总体存活率的影响（n = 1 420）;B：不同RB1表达水平对乳腺癌无复发生存率的影响5 =3
951）；C：RB1突变与非突变对患者的总体存活率的影响（” =1 918）
图2乳腺癌RB1基因表达及突变对临床预后的影响广东医学 2020 年 2 月第 41 卷第 4 期 Guangdong Medical Journal Feb. 2020, Vol. 41, No. 4参考文献• 385 •[1 ] Gong X, Du J , Parsons SH , et al. Aurora A Kinase Inhibition Is
Synthetic I.rthal with Loss of the RBI Tumor Suppressor Gene[ J]. Cancer Discov, 2019, 9(2) : 248 -263.[2]
Krings G. Chen YY. Genomic profiling of metaplastic breast carcinomas reveals genetic heterogeneity and relationship to ductal carcinoma [ J . Morl Palhol, 2018 , 3(11)： 1661 - 1674.[3] Anwar SL, Lehmann U. Detection of Aberrant DNA Methylation
Patterns in the RBI Gene [ J ]. Methods Mol Biol, 2018 , 1726 :
35 -47.[4]
Brough R, Gulati A , Haider S, et al. Identification of highly pen
图3乳腺癌RBI表达水平与临床预后的关系表2乳腺癌患者Cox多因素生存分析因素TNM 分期(I 〜U % D1 ~etrant Rl)- related synthetic lethal interactions in triple negative breast cancer[ J]. Oncogene, 2018 , 37(43) : 5701 -5718.[5]
P值Miller RE, Uwamahoro N, Park JH. PPM IB depletion in U2OS cells supresses cell growth through RBI - E2F1 pathway and stim
HR值)0.59895% C10.476 ~0.8730. 874 ~1.3520.018ulates bleomycin - induced cell death [ J ]. Biochem Biophys Res Commun, 2018, 500(2) : 391 -397.[6]
HER2（阴性％阳性）ER（阴性伪阳性）1.0520.9671.2160.2910.3650. 1570.792 〜1.4160.923 ~1.5350.512 -0.917贺小威，徐玲.细胞周期相关基因CDKN2A、TP53、RB1和 BRCA2在恶性肿瘤中的研究进展[J].现代肿瘤医学，2018.
PR（阴性vs阳性）26(1) ： 153 -157.[7]
Pan JH , Zhou H , Zhu SB, et al. Nicotinamide phosphoribosyl
RB1（高表达％低表达）0.6850.031出现耐药性。有研究「⑷表明，RB1基因的突变导致
transferase regulates cell growth via the Sirtl/P53 signaling path
way and is a prognosis marker in colorectal cancer [ J J. J Cell Physiol, 2019, 234(4) : 4385 -4395.[8] [9]
RB1基因功能丧失并因此导致促进了肿瘤对CDK4/6 抑制剂的抗性。本研究中采用Kaplan - Meier Plot-
黄钱，甘淋.雄激素受体在三阴性乳腺癌中的研究进展门〕.
实用医学杂志，2019, 35(2)： 318-321.包美荣，王海波,顾金萍.RB-E2F信号通路与乳腺癌及其
ter数据库的结果显示了虽然RB1基因高表达其乳 腺癌患者预后更优.但进一步分析RB1基因突变的
患者其预后显著差于非突变的患者，表明了 RB1基 因突变严重影响了 KB1基因的抑癌功能。本研究结果也进一步显示,乳腺癌组织样本中，
治疗[J].中国生物化学与分子生物学报.2017, 33 (6)：
572 -578.[10] 郑文，郑建云，刘冰，等.乳腺癌组织中人乳头状瘤病毒与
Rb、P53蛋白表达、预后的相关性分析[J].山西医科大学学
RB1高表达患者的总体生存率更优。既往有研 究\"表明RB1基因富集的卵巢癌患者其预后更
好，联合PD0332991与卡钳或紫杉醇共同治疗时能 显著提高RB1基因富集卵巢癌患者的临床疗效。
报,2016, 47( 11 ) ： 1026 -1031.[11] Dyson NJ. RBI : A prototype tumor suppressor and an enigma
[J]. Genes Dev, 2016, 30( 13) : 1492 - 1502.[12] Indovina P, Pentimalli F, Casini N, et al. RBI dual role in prolif
eration and apoptosis: Cell fate control and implications for cancer therapy [J]. Oncotarget, 2015, 6(20) : 17873 -17890.同时，在肺癌中，抑制RB1后可导致pl6表达上调，
pl6保护RB1缺乏的细胞免受DNA损伤，也导致了 基因的不稳定，增加了细胞的增殖功能W RB1的 表达水平也是膀胱癌患者膀胱灌注化疗治疗效果以
[13] Guarducci C, Bonechi M, Benelli M, et al. Cyclin El and Rb
modulation as common events at time of resistance to palbocielib in hormone receptor - positive breast cancer[ J ]. NPJ Breast Cancer,
2018, 4： 38.
及肿瘤复发的预测因子W而本研究结果也显示
[14] 汤小玲，马建秀，钟建斌，等.抑癌基因RB-蛋白与肿瘤相
RB1高表达水平是乳腺癌患者预后良好的重要因
素。虽然本研究对纳入的样本进行了蛋白水平的评
关的研究进展[J].中国医院药学杂志，2016, 36 ( 21 )： 1931 - 1935.估,但本研究并未对所纳入的标本进行RB1基因突 变检测，对于RB1基因突变其对蛋白功能的影响以
[15] Oser MG, Fonseca R, Chakraborty AA , et al. Cells Lacking the
RBI Tumor Suppressor Gene Are Hyperdependent on Aurora B Ki
nase for Survival[ J]. Cancer Discov, 2019, 9(2) : 230 -247.[16] 龙菲.CDK4/6抑制剂SHR6390抗RB阳性肿瘤活性的研究
及对乳腺癌患者预后的影响仍需要进一步加大样本
量进行评估。综上所述，乳腺癌RB1表达水平与肿瘤的大
[D].杭州：浙江理工大学，2019.[17] Schrijver WAME, Selenica P, Lee JY. Mutation Profiling of Key
Cancer Genes in Primary Breast Cancers and Their Distant Metas-
小、淋巴结转移及临床预后密切相关,RB1基因高表
达显著改善乳腺癌患者的临床预后，合并RB1基因 突变的乳腺癌患者预后较差。tases[J]. Cancer Res, 2018, 78( 12) ： 3112-3121.(收稿日期：2019 -07 -15编辑:朱绍煜)
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