免疫标记技术及其在食品安全检测中的应用

农业大学

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免疫标记技术及其在食品安全检测中的应用

陈泽 食品科学与药学学院 食品质量与安全 食品质量与安全112班 114033207 王子荣 职称: 教授 2014 年 6 月 10 日

农业大学教务处制

免疫标记技术及其在食品安全检测中的应用

作者：陈泽 指导老师：王子荣

摘要：文章介绍了免疫标记技术的发展以及免疫标记技术在食品安全检测中的应用，包括免疫荧光技术、免疫酶技术、放射免疫测定法、免疫胶体金技术和发光免疫测定法，并概述这些检测技术对食品安全的重要作用及影响。 关键词：免疫标记技术；食品安全；检测

免疫分析法是以抗原抗体特异性结合生成抗原抗体免疫复合物为基础，用来检测生物样品中较低含量活性物质的检测方法。此种分析方法的基础是抗原抗体反应的高度专一性和反应灵敏性。进行免疫分析的前提是获得与检测物质相对应的抗体或抗原，抗体的特异性和亲和性都是决定免疫分析能力的重要影响因素。免疫标记技术:泛指使用荧光素、放射性同位素、酶、胶体金以及化学(或生物)发光剂等作为标记物，标记的抗体或抗原和与之对应的抗原或抗体进行特异性的抗原抗体反应，最终借助各种精密的检测仪器对实验结果进行观察和测定。免疫标记技术可以为样本定性研究，或为样本定量或者半定量检测技术，也可以在细胞或者组织中进行定位研究。

一、免疫分析发展的历史

20 世纪50年代，免疫分析方法最初应用在体液中生物大分子的检测。1959年，美国学者Yalow和Bersou建立检测糖尿病患者血浆中胰岛素的免疫标记方法，巧妙地将放射性同位素125I示踪技术和传统的免疫方法相结合，使免疫分析技术从定性技术转变为定量技术，开创免疫标记的先河。1971年，瑞典学者Eugvai和Perlmauu用酶代替放射性同位素进行标记，创建了酶联免疫吸附试验（ELISA）。1982年，Neurmau在免疫分析的基础上发展了一种新型免疫分析技术——时间分辨荧光免疫测定(TRFLA)。1976年，Tsuji等基于酶与其特异性发光物质与免疫反应相结合，建立化学发光免疫测定(CLIA)。1990年，Leland建立电化学发光(ECLIA)，是继放射免疫、酶免疫、荧光免疫, ELIA以后的新一代标记免疫测定技术。 二、免疫荧光技术

免疫荧光技术又称荧光抗体法(fluorescent antibody technique, FAT)，是一种将结合有荧光素(异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯二嗓基氨基荧光素)的荧光抗体作为分子探针与抗原进行反应，借以提高免疫反应灵敏度和适合显微镜观察的免疫标记技术。该法具有灵敏度高、特异性强的特点。

免疫荧光技术的原理是将抗原抗体反应的特异性和敏感性与显微小踪的精确性相结合，以有荧光素作为标记物，与已知抗体结合，但不影响其免疫学特性。然后将荧光素标记的抗体作为标准试剂，用以检测和鉴定未知抗原。在荧光显微镜下，可以直接观察呈现特异荧光的抗原抗体复合物以及其存在部位。

张冬青等采用膜溶解、密度梯度分离纯化结合免疫荧光技术对饮用水中的“两虫”(隐抱子虫和贾第鞭毛虫)进行定性定量分析检测，其回收率分别为56%和35%，均高于EPA 1623方法的质量控制要求。采用免疫荧光技术操作方法简便且经济，适合在国内水源检测中推广使用。有报道首次将微菌落技术同免疫荧光技术相结合，建立了微菌落免疫荧光技术(M-CIF) 。M-CIF法敏感性和重复性好，用已知沙门氏菌浓度做最低检出限量实验，常规法检出限为10个/mL，而该

法为5个/mL;阳性对照和阴性对照重复10次，阳性菌落均荧光明亮，颜色稳定，阴性菌落均荧光很弱。用M- CIF法对不同菌落进行特异性的荧光染色鉴别细菌，仅需5- 6 h，在食品有害微生物检测方面有着非常大的应用前景。

三、免疫酶技术

免疫酶技术又称酶免疫测定法，是将抗原和抗体的特异免疫反应和酶催化反应的高效性和专一性相结合而建立的一种新技术，常用的酶是辣根过氧化物酶。其原理和免疫荧光技术相似，不同的是用酶代替荧光剂做标记，以及酶的特殊底物处理标本来显示酶标记的抗体，以检测标记物的有无及含量间接反映被测物的存在与多少。该技术具有操作简单、敏感性高、准确性好、易于商品化等特点，正被广泛应用于微量物质检测、免疫相关物质检测等各个领域的分析检测。 免疫酶技术方法很多，最主要的方法为酶联免疫吸附法(ELISA)，简称酶标法，被广泛用于检测抗原或抗体，可进行定性和定量分析。 ELISA法可检测食品中的病原菌沙门氏菌、大肠杆菌等，食品中的微量农药残留，以及酱油生产中能引起中毒的霉菌次级代谢产物黄曲霉毒素、超曲霉毒素等方面。用该法进行李斯特氏菌的快速检测，用三株针对单核细胞增生仅需48 h，在人工模拟肉中检测下限为5 cfu/ g样品。陈琦等采用酶联免疫试剂盒及绘制以氯霉素浓度为半对数坐标的标准曲线对牛肉和蜂蜜中氯霉素残留量进行测定，变异系数为3. 1%一8. 6% ,重复性好，精确度高。有报道用酶联免疫吸附酶标仪分析法和免疫亲和微检荧光仪分析法分别对粮油样品中黄曲霉毒素B1进行测定，对其检测条件和结果进行差异性分析，比较发现酶联免疫吸附分析法适宜大批量样品快速筛选，检出限为0.1μg/kg，可在广大基层实验室推广应用。 四、放射免疫标定法

放射免疫测定法(radioimmuno- assay, RIA)是采用放射性同位素的抗原或抗体来检查相应抗体或抗原的高灵敏度免疫分析方法，此法具有高灵敏度(达10-9或10-12）可进行超微量分析，敏感性高等优点。本法常用的同位素有3H，14C，125

I和131I等。放射免疫分析法应用范围广泛，在食品安全检测中可用来检测肉类药物残留，黄曲霉毒素等。

徐美奕等人用125 I标记的放射免疫试剂盒测定养殖红笛酬与野生红笛酬肌肉中雌二醇、孕酮、睾酮三种性腺激素残留量。在养殖红笛酬与野生红笛酬肌肉中均检出三种激素，野生红笛酬中的激素残留量较低，但仍能被检出，放射免疫分析法放射性活度低、毒性小、样品处理简单、灵敏度高，检出限高于液相色谱法，可达ng-pg级，可作为水产品中激素残留量的有效检测手段。有文献应用Charm II放射免疫分析方法测定猪尿样的磺胺类残留，检测限为200μg/kg，符合欧美等国磺胺类最大残留限量的检测要求，同时快速简便，在30 min内可出初筛结果，假阴性率为0%，有助于大批量样品的初筛，同时本方法为动物养殖过程中的用药监控提供了一种快速检测方法。 五、胶体金免疫技术

采用电子致密物质(通常用辣根过氧化物酶和铁蛋白)标记的抗体与其相应抗原发生特异性结合，借电镜检出这一标记复合物的技术称为免疫电镜技术。近年来逐渐发展到用胶体金作为非放射性示踪剂，即胶体金免疫技术。胶体金免疫技术是20世纪80年代继三大标记技术(荧光素、放射性同位素和酶)后发展起来的固相标记免疫测定技术。

有关胶体金免疫技术的最旱报道是1971年Faulk和T aylor将胶体金与抗

体结合，用于电子显微镜水平的免疫细胞化学研究。此后，胶体金作为一种新型免疫标记技术发展很快。目前在微生物学检验中应用的主要是免疫层析法和快速免疫金渗滤法。胶体金是由氯金酸在还原剂作用下，聚合成特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态。胶体金标记实质上是蛋白等高分子被吸附到胶体金表面的包被过程，利用它在碱性环境中带负电荷的性质，与蛋白质分子或其他生物大分子的正电荷基团借静电吸引而形成牢固结合。 由于胶体金标记蛋白质是物理结合过程，结合牢固，很少引起蛋白质活性改变，所以试剂非常稳定，不受温度等外界因素影响，可在办公室、家中甚至野外进行检测，试验结果也可长期保存。还具有很强的动力学稳定性，可放置数年。胡孔新等人以被列为I类潜在重要生物恐怖因子鼠疫杆菌作为诊断对象，建立了适合于现场快速检测鼠疫杆菌抗原用的胶体金标记免疫层析方法，其检测灵敏度

5

达到1 x 10 cfu/ mL，并对常见的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌无明显非特异作用，该法对出入境口岸的样品安全检测有重要意义。有文献建立了一种简便快速的胶体金免疫层析法来检测沙门氏菌。致病菌污染食物并在其中大量繁殖或产生毒素是细菌性食物中毒发生的首要原因，食入含106-107cfu/ g沙门菌的食品即可发病。该法制备的免疫层析条检测灵敏度为2. 1 x 106cfu/ mL，在沙门菌食物中毒菌量范围内。吉坤美等采用简易快速胶体金免疫层析法(GICA)检测食品中花生蛋白成分。通过胶体金标记建立快速检测花生过敏原GICA试条，具有高灵敏度，GICA测试条与花生蛋白抗原呈特异性反应，检测自制的花生抗原标准品的灵敏度可达50 ng/ mL。可有效地快速检测各种样品，满足我国进出口食品贸易的需求，同时为制定我国食品过敏原标签管理奠定了技术基础。同时，胶体金技术还可用于肉类、蛋类中抗生素残留、激素残留的检测。 六、发光免疫分析技术

一种把化学发光或生物发光反应与免疫测定结合后的高灵敏度分析方法，兼具有发光分析的高灵敏性和抗原抗体反应高度特异性。化学发光剂有荧光醇、光泽精等。利用化学发光反应进行检测是从20世纪60年代中期开始的，20世纪70年代后期将化学发光反应与免疫测定方法结合而建立的化学发光免疫分析法可对多种物质进行微量分析，灵敏度比ELISA高1000倍，且无毒、简便快速。 发光免疫技术可用于激素类的检测和抗生素残留检测，同时也可用于肉毒素等微生物代谢物检测，可定量分析也可定性，且无放射性物质污染，在食品安全检测中有广泛前景，但由于其应用时间不长，在方法上仍需进一步探索。 七、发展及展望

免疫标记技术是一类不断发展和改进的技术，有很多新的方法正在被研究。在实际操作中几种免疫标记技术可结合使用，例如可将荧光技术和酶免疫技术结合成荧光酶免疫分析技术，大大提高了敏感性。随着各种研究技术的不断进步，在将来的食品安全检测中，简便、灵敏、快速的联用技术、免疫技术能为食品安全检测提供快捷方法，也为人们的营养健康做出保证，为疾病预防做出贡献。

参考文献

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