６３０ Ｊ Ｂｅｎｇｂｕ Ｍｅｄ Ｃｏｉｌ，Ｊｕｎｅ ２０１２，Ｖｏ１．３７，Ｎｏ．６ 基础医学・ ［文章编号］１０００—２２００（２０１２）０６－０６３０－０３ ・Ｃａｓｐａｓｅ一３在维Ａ酸致小鼠 胚胎神经管畸形中的表达及意义 张艳萍 ，张美华 ，杨丹彤 ，张爱东 ，刘凯 ［摘要］目的：探讨Ｃａｓｐａｓｅ一３在维Ａ酸（ＲＡ）致小鼠胚胎神经管畸形发生过程中的表达及意义。方法：４０只未经产昆明种小鼠 随机分为实验组和对照组各４小组，每小组５只。分别在花生油及ＲＡ处理１８、４２、６６、９０ ｈ后剖腹取胎、剥离头部神经管， Ｗｅｓｔｅｒｎ—ｂｌｏｔｉｎｇ法检测Ｃａｓｐａｓｅ．３的表达变化。结果：Ｃａｓｐａｓｅ一３在正常胚胎神经管组织中的表达存在时问依赖性。对照组 Ｃａｓｐａｓｅ一３在花生油灌服后１８ ｈ表达升高，４２ ｈ和６６ ｈ时表达最强，之后表达逐渐降低。实验组Ｃａｓｐａｓｅ一３在ＲＡ处理后４２ ｈ 表达水平显著低于对照组（Ｐ＜０．０１），６６ ｈ和９０ ｈ时表达水平均显著高于对照组（Ｐ＜０．０１）。结论：ＲＡ改变丁昆明种小鼠胚 胎神经管中Ｃａｓｐａｓｅ一３的正常时问表达模式，这种异常的基因表达模式可能参与了ＲＡ诱导的神经管畸形发生。 ［关键词］神经管畸形；维Ａ酸；Ｃａｓｐａｓｅ一３；凋亡；小鼠 ［中国图书资料分类法分类号］Ｒ ３２２．８１；Ｒ ９８６ ［文献标识码］Ａ Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｓｉｇｎｉｉｃａｎｃｅ ｏｆ Ｃａｓｐａｓｅ－ｆ３ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｗｉｔｈ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｎｅｕｒａｌ ｔｕｂｅ ｍａｌｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ＺＨＡＮＧ Ｙａｈ—ｐｉｎｇ ，ＺＨＡＮＧ Ｍｅｉ—ｈｕａ ，ＹＡＮＧ Ｄａｎ—ｔｏｎｇ。，ＺＨＡＮＧ Ａｉ—ｄｏｎｇ ，ＬＩＵ Ｋａｉ （Ｊ．Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｉａｌ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ０厂Ｅｕｇｅｎｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｉａｌ Ｆａｍｉｌｙ Ｐｌａｎｎｉｎｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ０厂Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｊｉｎａｎ Ｓｈａｎｄｏｎｇ ２５０００２；２．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ０厂Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｌｏｇｙ， Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ ０厂Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｊｉｎａｎ Ｓｈａｎｄｏｎｇ ２５００１２，Ｃｈｉｎａ） ［Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ ｅｘｐｌｏｒｅ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｃｅ ｏｆ Ｃａｓｐａｓｅ一３ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｗｉｔｈ ｅｍｂ￣ｏｎｉｅ ｎｅｕｒａｌ ｔｕｂｅ ｄｅｆｅｃｔｓ（ＮＴＤ） ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ（ＲＡ）．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｔｈｅ ４０ ｍｉｃｅ ｗｅｒｅ ｒａｎｄｏｍｌｙ ｄｉｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏ ｔｅｓｔ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐｓ．Ｔｈｅ ｎｅｕｒａｌ ｔｕｂａｌ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｅｒｅ ｈａｒｖｅｓｔｅｄ ａｔ １ ８，４２，６６ ａｎｄ ９０ ｈ ａｆｔｅｒ ＲＡ ｏｒ ａｒａｃｈｉｓ ｏｉｌ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ．Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｃａｓｐａｓｅ一３．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｃａｓｐａｓｅ一３ ｄｉｓｐｌａｙｅｄ ｔｉｍｅ ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ ｉｎ ｔｈｅ ｎｏｒｍａｌ ｆｅｔａｌ ｎｅｕｒａｌ ｔｕｂｅ ｔｉｓｓｕｅ．Ｉｎ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ，ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ｏｆ Ｃａｓｐａｓｅ一３ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ａｔ １８ ｈ，ａｎｄ ａｃｈｉｅｖｅｄ ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｐｅａｋ ａｔ ４２ ａｎｄ ６６ ｈ，ｔｈｅｎ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｓｌｏｗｌｙ ａｆｔｅｒ ａｒａｃｈｉｓ ｏｉｌ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ．Ｉｎ ｔｅｓｔ ｇｒｏｕｐ，ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ Ｃａｓｐａｓｅ一３ ｗｅｒｅ ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔ ｌｏｗｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ ａｔ ４２ ｈ（Ｐ＜０．０１），ａｎｄ ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ ｎｏｒｍａｌ ｇｒｏｕｐ ａｔ ６６ ｈ ａｎｄ ９０ ｈ ａｆｔｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ＲＡ（Ｐ＜０．０１）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ：ＲＡ ｃａｎ ｃｈａｎｇｅ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎ ｏｆ Ｃａｓｐａｓｅ一３ ｉｎ ｅｍｂ￣ｏｎｉｃ ｎｅｕｒａｌ ｔｕｂｅ ｏｆ ｍｏｕｓｅ，Ｔｈｅ Ｃａｓｐａｓｅ一３ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ ｍａｙ ｐａｒｔｉｃｉｐａｔｅ ｉｎ ｔｈｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ＮＴＤ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ＲＡ． ［Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ］ｎｅｕｒａｌ ｔｕｂｅ ｄｅｆｅｃｔｓ；ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ；Ｃａｓｐａｓｅ一３；ａｐｏｐｔｏｓｉｓ；ｍｏｕｓｅ 神经管畸形（ｎｅｕｒａｌ ｔｕｂｅ ｄｅｆｅｃｔｓ，ＮＴＤｓ）是较为 常见且危害严重的一类先天性畸形，其确切发生机 １材料与方法 制至今仍不十分清楚。本实验在已建立的维Ａ酸 （ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ，ＲＡ）致昆明种小鼠ＮＴＤｓ动物模型 七¨ｊ，用Ｗｅｓｔｅｒｎ．ｂｌｏｔｉｎｇ技术探讨Ｃａｓｐａｓｅ一３表达与 ＲＡ致ＮＴＤｓ的关系，以期探明凋亡在过量ＲＡ致 ＮＴＤｓ发生中的可能作用，为ＮＴＤｓ发生机制的研究 １．１ 标本制备未经产昆明种小鼠（山东大学实 验动物中心提供）４０只，体重２５～３０ ｇ，颗粒饲料喂 养，普通饮水。于晚上６时与雄鼠１：１合笼，第２天 早上查阴栓，发现阴栓的当天中午为孕０．５ ｄ （ＧＤ ０．５ ｄ）。孕鼠随机分为实验组和对照组，实验 提供实验依据。 组于受精后第７天下午６时，一次性灌服３０ ｍｇ／ｋｇ 全反式ＲＡ（Ｓｉｇｍａ公司，美国）花生油悬液，对照组 ｃ收稿日期］２０ｉ１－０８－０５ ［雎金项目］山东省自然科学研究罐金资助项目（２００９ＺＲＡ０１１９３） ［作者单位］１．山东省优牛技术重点实验室，ＩＩｌ尔 计划生育科学技 术研究所，Ｉｈ尔济ｌ柯２５０００２；２．山东大学医学院 织学 与 胎 教研室，…尔济ｌ幸』２５００１２ ｆ作者简介］张艳萍（１９７８一），女，助珲研究员． 灌服等量花生油。ＲＡ按照试剂说明 避光配置， 以防光异构化。实验组、埘照组各分为４小组，每小 组５只，分别在服药后１８、４２、６６及９０ ｈ脱Ｆ｛处步匕孕 鼠，取出胚胎，分离神经管，并迅速置于液氮 ＪＩ’１—８Ｏ ℃冷冻保存。 蚌埠医学院学报２０１２年６月第３７卷第６期 １．２ Ｗｅｓｔｅｒｎ—ｂｌｏｔｉｎｇ法半定量分析Ｃａｓｐａｓｅ．３的表 ６３１ 的羊抗兔二抗稀释液（１：５０００）（Ｚｙｍｅｄ公司，ＵＳＡ）， ３７℃孕育１ ｈ，ＰＢＳ漂洗，ＤＡＢ（博士德生物公司）显 达每组５～１８个胚胎（来源于５只孕鼠）用于蛋 白提取。以下步骤全部冰上操作，４℃离心。加 １ ｍｌ溶液Ａ（０．６％ＮＰ４０，１５０ ｍｍｏｌ／Ｌ氯化钠， １０ ｍｍｏｌ／Ｌ羟乙基哌乙硫磺酸，１ ｍｍｏｌ／Ｌ乙二胺四 色。生物电泳图像分析系统（上海复日科技有限公 司）观察电泳结果，对电泳条带进行灰度扫描和丰 度分析。 １．３ 统计学方法 采用方差分析和ｑ检验及ｔ检 验 ２结果 乙酸，０．５ ｍｍｏｌ／Ｌ苯甲基磺酰氟，０．５ ｍｌ二硫苏糖 醇，５ ｇ／ｍｌ抑酞酶，５ ｇ／ｍｌ亮肽素）于液氮研磨的 胚胎粉末，充分匀浆后，转移匀浆液到１．５ ｍｌ的离 心管２ ０００ ｒ／ｒａｉｎ离心３０ Ｓ，取上清液冰上放置５ ｒａｉｎ 后５ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心５ ｒａｉｎ。吸取上清液，一８０℃保 对照组小鼠花生油灌注１８ ｈ后Ｃａｓｐａｓｅ一３表达 较弱，之后表达逐渐加强，４２及６６ ｈ时表达最强，均 存备用。紫外分光光度计法测量蛋白浓度，并经公 式校正（１．４５×Ａ２８０—０．７４×Ａ２６０）。样品经１２％ ＳＤＳ．ＰＡＧＥ，然后电转移至ＰＶＤＦ膜，丽春红染色，根 据标准分子质量确定目的蛋白的位置。三蒸水漂洗 ＰＶＤＦ膜数次，加入封闭液（ＴＴＢＳ＋５％脱脂奶粉），４ 明显高于１８ ｈ时（Ｐ＜０．０１），之后又逐渐降低到与 １８ ｈ时相仿的表达水平（Ｐ＞０．０５）。实验组 Ｃａｓｐａｓｅ一３在ＲＡ处理后４２ ｈ表达水平显著低于对 照组（Ｐ＜０．０１），６６、９０ ｈ时其表达水平均升高，且 均显著高于１８ ｈ和４２ ｈ时（Ｐ＜０．０１），ＲＡ处理后 ℃孕育过夜。加入兔抗鼠Ｃａｓｐａｓｅ．３抗体稀释液 （１：２００）（博士德生物公司）或兔抗鼠Ｂ—ａｃｔｉｎ抗体 稀释液（１：２００）（Ｚｙｍｅｄ公司，ＵＳＡ），３７ ｏＣ孕育２ ｈ， ＴＢＳ漂洗ＰＶＤＦ膜数次，加入辣根过氧化物酶标记 １ ８ ｈ时，对照组及实验组的Ｃａｓｐａｓｅ一３表达水平差异 无统计学意义（Ｐ＞０．０５）（见表１、图１）。 表１过量ＲＡ对小鼠胚胎神经管Ｃａｓｐａｓｅ一３表达的影响（ ±ｓ，ＯＤ） ｑ检验：与１８ ｈ时比较 厂———————］８ｈ ４２ｈ ６６ｈ ９０ｈ Ｐ＜０．叭；与４２ ｈ时比较△△Ｐ＜０．０１；与６６ ｈ时比较槲Ｐ＜０．Ｏ１ 厂—————］１ ８ｈ ４２ｈ ６６ｈ ９０ｈ 常见和最为严重的一组畸形，在世界范围内其发生 率高达千分之一＿４ Ｊ，一般认为ＮＴＤｓ是一种多因子 遗传病，是遗传因素和环境因素综合作用的结 果 Ｊ，其确切病因至今不明。 细胞凋亡或程序性细胞死亡是指在基因控制下 罔１ Ｃａｓｐａｓｅ一３在２组胚胎神经管组织中的表达 的细胞生理性死亡，其生物学意义是在发育中清除 ３讨论 多余的、发育不正常的、已完成任务的细胞以及有害 细胞，以维持胚胎发育过程中的器官模式形成以及 维持机体内环境的稳定等。胚胎发育过程中细胞凋 亡异常将导致各种先天性缺陷发生。Ｃａｓｐａｓｅ一３是 一ＲＡ为一种小分子量的脂溶性信号分子，一般 通过结合维Ａ酸受体，调节下游靶基因表达来实现 其生物学效应。生理剂量的ＲＡ在细胞的增殖、分 种细胞凋亡执行阶段诱导细胞死亡的活性蛋白 化、凋亡及各种动物的胚胎模式形成等生物学事件 【ｆ＿１发挥着重要作用 Ｊ。然而在胚胎发育过程中，过 多摄人ＲＡ或ＲＡ缺乏均会导致各种发育缺陷形 成 Ｊ。发育中的中枢神经系统常常是ＲＡ致畸的敏 感部位，神经胚期一次性灌服昆明种小鼠３０ ｍｇｉｋｇ ＲＡ可敏ＮＴＤｓ发牛 。ＮＴＤｓ是人类出生缺陷中最 酶，是细胞凋亡下游过程的关键执行者。细胞凋亡 的某些特征性标志，如染色质凝聚、ＤＮＡ片段化等， 均与Ｃａｓｐａｓｅ一３有着直接关系 Ｊ。在Ｃａｓｐａｓｅ一３纯 合突变转基因小鼠中，由于Ｃａｓｐａｓｅ一３功能缺失而抑 制神经元捌亡过程，从而导致明显ＮＴＤｓ发生 Ｉ９ Ｊ。 本实验中，对照组Ｃａｓｐａｓｅ一３于花生油灌注后４２ ｈ ６３２ （ＧＤ ９．５ｄ）表达达高峰，并持续至花生油处理后 ６６ ｈ（ＧＤ １０．５ｄ），此时正值神经管闭合期，之后表 达下降。Ｇｅｅｌｅｎ等¨ 研究发现，ＧＤ ９．０ ｄ小鼠胚胎 的表面外胚层与神经外胚层连接处出现大量细胞死 亡。Ｊｅｆｆｓ等… 报道，第８期鸡胚的中脑顶板处有大 量细胞死亡，即使神经沟关闭以后，仍有大量细胞凋 亡发生在背侧中线。结合我们的实验结果和上述文 献提示，正常细胞凋亡参与神经管关闭以及神经管 关闭后中枢神经系统的进一步形态发生过程，其确 切生物学意义可能有助于神经管与外胚层脱离以及 有助于神经管头端脑的形态发生，使其具备头端发 育为脑泡、尾段发育为脊髓的形态学基础。本研究 实验组Ｃａｓｐａｓｅ一３在ＲＡ处理后４２ ｈ（ＧＤ ９．５ ｄ）时 表达水平显著低于对照组，而６６ ｈ（ＧＤ １０．５ ｄ）及 ９０ ｈ（ＧＤ １１．５ ｄ）时表达水平升高，且显著高于对照 组。已有研究＿８ 证明，在Ｃａｓｐａｓｅ一３纯合突变小鼠 中，Ｃａｓｐａｓｅ一３功能缺失通过抑制神经元凋亡致 ＮＴＤｓ明显发生。另有报道‘１ ＲＡ可以抑制过氧 化氢或吡咯烷二硫氨基甲酸诱导的细胞凋亡。ＲＡ 抑制细胞凋亡有两种方式：一种方式是通过与维Ａ 酸受体ＲＡＲ／ＲＸＲ结合，降低ｃ—ｆｏｓ／ｃ－ｊｕｎ基因表达 来抑制细胞凋亡；另一种则是以维Ａ酸受体非依赖 方式，抑制ｃ－ｊｕｎ氮末端激酶活性从而抑制细胞凋 亡¨ 。另外，ＲＡ可通过上调腭突中表皮细胞生 长因子受体（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＥＧＦＲ） 表达，促进表皮细胞生长因子与ＥＧＦＲ结合，从而阻 止腭突内侧缘上皮细胞凋亡¨ 。因此推测ＲＡ可 能以ＲＡＲ依赖的形式或其他核受体非依赖形式干 扰了正常细胞凋亡，从而导致神经管闭合缺陷的 发生。 另外，本实验结果还显示，Ｃａｓｐａｓｅ－３在实验组 ＲＡ处理后，于神经管闭合期表达明显被抑制，神经 管闭合后其表达水平有明显回升过程，可能是因为 前期细胞凋亡过度抑制而由机体反馈机制产生的一 种代偿作用。 在胚胎生长发育过程中，一系列相关基因严密 控制着细胞的增值、分化、凋亡，也控制着各种器官 的形态发生，干扰这些基因的正常表达，可能会影响 一些关键的相关发育生物事件，从而导致各种畸形 发生。本实验中，ＲＡ于神经管闭合期同时下调了 ＲＡＲｅｒ／１３、Ｂ－ｃａｔｅｎｉｎ及Ｃａｓｐａｓｅ．３的基因表达水平。 ＲＡ诱导的基因表达失调可能干扰了神经管闭合早 期的相关发育生物学事件而致ＮＴＤｓ的发生，然而 其确切机制有待进一步验证。 Ｊ Ｂｅｎｇｂｕ Ｍｅｄ Ｃｏｉｌ，Ｊｕｎｅ ２０１２，Ｖｏ１．３７，Ｎｏ．６ ［ 参 考 文 献 ］ ［１］Ｚｈａｎｇ ＹＰ，Ｌｊｕ Ｋ，Ｇａｏ ＹＭ，ｅｔ ａ１．Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ ａｎｄ ｖａｎｇ［２ ｂｙ ａｌｌ－－ｔｒａｎｓ—－ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｍｏｕｓｅ ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ ｉｔｓ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｔｏ ｔｅｒａｔｏｇｅｎｅｓｉｓ［Ｊ］．Ａｅｔａ Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｓｉｎ，２００７，３９（９）：６４１—６４８． ［２］Ｒｕｔｌｅｄｇｅ ＪＣ，Ｓｈｏｕｒｂａｊｉ ＡＧ，Ｈｕｇｈｅｓ ＬＡ，ｅｔ ａ１．Ｌｉｍｂ ａｎｄ ｌｏｗｅｒ— ｂｏｄｙ ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｒｅｔｉｎｏｉｅ ａｃｉｄ ｉｎ ｍｉｃｅ［Ｊ］．Ｐｍｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，１９９４，９１（１２）：５４３６—５４４０． ［３］ Ａｌｌｅｓ ＡＪ，Ｓｕｌｉｋ ＫＫ．Ｒｅｔｉｎｏｉｃ－ａｃｉｄ—ｉｎｄｕｃｅｄ ｌｉｍｂ—ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｄｅｆｅｘ：ｔｓ： ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ ｏｆ ｚｏｎｅｓ ｏｆ ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ａｓ ａ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ［Ｊ］．Ｔｅｒａｔｏｌｏｇｙ，１９８９，４０（２）：１６３—１７１． ［４］ Ｃａｒｔｅｒ ＣＯ．Ｓｐｉｎａ ｂｉｉｆｄａ ａｎｄ ａｎｅｎｃｅｐｈａｌｙ：Ａ ｐｒｏｂｌｅｍ ｉｎ ｇｅｎｅｔｉｃ— ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｊ Ｂｉｏｓｏｃ Ｓｃｉ，１９６９，１（１）：７１—８３． ［５］Ｆｒｅｙ Ｌ，Ｈａｕｓｃｒ ＷＡ．Ｅｐｉｄｉｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｎｅｕｒａｌ ｔｕｂｅ ｄｅｆｅｃｔｓ［Ｊ］． Ｅｐｉｌｅｐｓｉａ，２００３，４４（１３）：４—１３． ［６］Ｆｅｌｄｓｔｅｉｎ ＡＥ，Ｃａｎｂａｙ Ａ，Ａｎｇｕｌｏ Ｉ，ｅｔ ａ１．Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ａｐｏｐｔｏｓｉｓａｎｄ ｆａｓ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｓ ｐｒｏｍｉｎｅｎｔ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ［Ｊ］．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，２００３，１２５（２）：４３７—４４３． ［７］ Ｆｅｌｄｓｔｅｉｎ ＡＥ，Ｃａｎｂａｙ Ａ，Ｇｕｉｃｃｉａｒｄｉ ＭＥ，ｅｔ ａ１．Ｄｉｅｔ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｈｅｐａｔｉｃ ｓｔｃａｔｏｓｉｓ ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｓ ｔｏ Ｆａｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｌｉｖｅｒ ｉｎｊｕｒｙ ｉｎ ｍｉｃｅ ［Ｊ］．Ｊ Ｈｅｐａｔｏ，２００３，３９（６）：９７８—９８３． ［８］Ｋｕｉｄａ Ｋ，Ｚｈｅｎｇ ＴＳ，Ｎａ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｔｈｅ ｂｒａｉｎ ａｎｄ ｐｒｅｍａｔｕｒｅ ｌｅｔｈａｌｉｔｙ ｉｎ ＣＰＰ３２－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ， １９９６，３８４（６６０７）：３６８—３７２． ［９］Ｈａｋｅｍ Ｒ，Ｈａｋｅｍ Ａ，Ｄｕｎｃａｎ ＧＳ，ｅｔ ａ１．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ ｆｏｒ ｃａｓｐａｓｅ ９ ｉｎ ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｐａｔｈｗａｙｓ ｉｎ ｖｉｖｏ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ，１９９８，９４ （３）：３３９—３５２． ［１０］Ｇｅｅｌｅｎ ＪＡ，Ｌａｎｇｍａｎ Ｊ．Ｃｌｏｓｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｎｅｕｒｌａ ｔｕｂｅ ｉｎ ｔｈｅ ｃｅｐｈａｌｉｃ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏ［Ｊ］．Ａｎａｔ Ｒｅｃ，１９７７，１８９（４）：６２５— ６４０． ［１１］Ｊｅｆｆｓ Ｐ，Ｏｓｍｏｎｄ Ｍ．Ａ ｓｅｇｍｅｎｔｅｄ ｐａｔｔｅｒｎ ｏｆ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｄｕｒｉｎｇ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｃｈｉｃｋ ｅｍｂｒｙｏ［Ｊ］．Ａｎａｔ Ｅｍｂｒｙｏｌ（Ｂｅｒ１）， １９９２，１８５（６）：５８９—５９８． ［１２］ Ｋｉｔａｍｕｒａ Ｍ，Ｉｓｈｉｋａｗａ Ｙ，Ｍｏｒｅｎｏ—Ｍａｎｚａｎｏ Ｖ，ｅｔ ａ１．Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ ｂｙ ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ［Ｊ］．Ｎｅｐｈｒｅｌ Ｄｉａｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，２００２，１７（９）：８４—８７． ［１ ３］Ｘｕ Ｑ，Ｋｏｎｔａ Ｔ，Ｋｉｔａｍｕｒａ Ｍ．Ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｓａｎｇｉａｌ ｃｅｌｌ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ［Ｊ］．Ｅｘｐ Ｎｅｐｈｒｏｌ，２００２，１０（３）：１７１—１７５． ［１４］Ｋｏｎｔａ Ｔ，Ｘｕ Ｑ，Ｆｕｒｕｓｕ Ａ，ｅｔ ａ１．Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｒｏｌｅｓ ｏｆ ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｄ ｒｅｔｉｎｏｉｄ ｘ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎ ｔｈｅ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｂｙ ａｌｌ—ｔｒａｎｓ—ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ［Ｊ］．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２００１．２７６（１６）：１２６９７— １２７０１． ［１５］ Ｍｏｒｅｎｏ—Ｍａｎｚａｎｏ Ｖ，Ｉｓｈｉｋａｗａ Ｙ，Ｌｕｃｉｏ－Ｃａｚａｎａ Ｊ，ｅｔ ａ１． Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｂｙ ａｌｌ—ｔｒａｎｓ－ｒｅｔｉｎｎｉｃ ａｃｉｄ．Ｄｕａｌ ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｃ－Ｊｕｎ ｎ—ｔｅｒｍｉｎａｌ ｋｉｎａｓｅ—ＡＰ－１ ｐａｔｈｗａｙ［Ｊ］．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，ｌ９９９，２７４（２９）：２０２５１—２０２５８． ［１６］Ｃｉｔｔｅｒｉｏ ＨＩ ，Ｇａｉｌｌａｒｄ ＤＡ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｎｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ａｌｐｈａ（ＴＧＦ ａｌｐｈａ），ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｐａｌａｔｏｇｅｎｅｓｉｓ：ａｎ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｔｕｄｙ［Ｊ］．Ｉｎｔ Ｊ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ，１９９４，３８（３）：４９９—５０５． （本文编辑姚仁斌）
