猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)病的RT-PCR诊断

２结果　猪繁殖与呼吸综合征（ＰＲＲＳ）　ＰＣＲ产物在１％琼脂糖凝胶电泳中　出现了与预期大小一致的片段（见图　病的ＲＴ—ＰＣＲ诊断　１），经测序为高致病性猪蓝耳病毒株　ＲＮＡ片段。对照用的蓝耳病毒株　ｃＤＮＡ、猪瘟毒株的ｃＤＮＡ、未加高致病　李雅志　何剑斌　刘金玲　性猪蓝耳病毒株ｃＤＮＡ模版的ＰＣＲ反　ｆ沈阳农业大学畜牧兽医学院，辽宁　沈阳　１１０１６１）　应管检测结果均为阴性。序列测定结　中图分类号：￥８５８．２８　文献标识码：Ｂ　文章编号：１００８—０４１４（２００８）０３—００２５—０１　果表明。高致病性猪蓝耳病ＳＹ株和高　致病性猪蓝耳病ＪＸ株扩增区的同源性　达９９．５％。（ＳＹ代表沈阳毒株，ＪＸ代表　网上公布的毒株编号）　２００７年９月某猪场出现猪体温升　１＿２方法　达４１℃或更高，食欲减少甚至废绝，大　１＿２．１病料的ＲＮＡ提取：取１～２　ｇ肺、淋巴结　Ｍ　１　２　３　４　５　多数病猪有呼吸道症状。表现为呼吸　等组织于研磨器充分研磨。用Ｈａｒｒｋｓ液１：３　６００　ｂｐ　粗厉，腹式呼吸明显　咳嗽，有的出现　稀释，反复冻融３次以上。８　０００　ｒ／ｍｉｎ。离心　５００　ｂｐ　呼吸困难；皮肤发紫，首先是后部乳头　１０　ｍｉｎ，取上清液２５０　Ｌ，加入７５０　Ｌ的　４００　ｂｐ　５　ｂｐ　３００　ｂｐ　发紫。然后是乳头周围皮肤出现紫点，　ＴＲＩＺＯＬ，反复颠倒几次混匀后，室温下放置　２００　ｂｐ　由少到多。由不明显到明显，重者可发　５　ｍｉｎ。加入２５０　Ｌ氯仿，旋涡振荡１５　ｓ混　１００　ｂｐ　展到整个腹下及大腿内侧皮肤。其次　匀，室温孵育５～１５　ｍｉｎ，４￣Ｃ、１２　０００　ｄｍｉｎ离　图１　高致病性猪蓝耳病病毒的　是眼圈、鼻尖端、阴门、肛门的皮肤发　心１５　ｍｉｎ，取上清置于新的ＥＰ管中，再加入　特异性ＰＣＲ扩增试验　青发紫。死亡前期在耳部、腹部、后躯　５００　Ｌ异丙醇混匀，轻轻混匀，室温孵育　部出现明显的发青发紫症状。就当地　１０　ｍｉｎ。４℃，１２　０００　ｒ／ｍｉａ离心１０　ｍｉｎ，弃上　１．蓝耳病病毒对照；２．空白对照；３猪　瘟病毒ＰＣＲ对照；４高致病性猪蓝耳病　流行病学及临床症状来看疑似ＰＲＲＳ。　清，再加入１　０００　Ｌ　７５％乙醇旋涡振荡清　ＰＣＲ产物；５．高致病性猪蓝耳病ＰＣＲ产物；　来我院进行进一步确诊。我们采取分　洗两次，每次１０　０００　ｄｍｉｎ离心５　ｍｉｎ。晾干　Ｍ．ＤＬ６ｏ０　Ｍａｒｋｅｒ对照　子生物学手段进行进一步诊断。现报　ＥＰ管中的ＲＮＡ，加入１０　Ｌ　ＤＥＰＣ水溶解　告如下：　ＲＮＡ。一７０℃冻存备用或即用。　３结语与讨论　１材料与方法　１．２．２病毒ｃＤＮＡ的合成：反转录体系　（１０　Ｌ）：ＭｇＣｌ２　２　Ｌ，１０ｘＲＴ　Ｂｕｆｆｅｒ　１　Ｌ，　３．１　通过流行病学调查、临床表现、　１．１　材料　ｄＮＴＰ（各１０　ｍＭ）１　Ｌ，ＲＮａｓｅ　０．２５　Ｌ，　剖检变化与实验室诊断，ＲＴ—ＰＣＲ确　１．１．１主要试剂：ＴＲＩＺＯＬ　ＲＮ．Ａ试剂　ＡＭＶ　０．５　ｗＥ，提取的ＲＮＡ　２　Ｌ上下游引物　诊。该起疫情主要是由ＰＲＲＳＶ变异株　盒、高致病性猪蓝耳病ＰＣＲ产物Ｍ．　引起的。从而引起了高发病率和高死　各１　Ｌ，加入ｄＨ２０　２．２５　Ｌ混匀后于ＰＣＲ　亡率。　ＤＬ６００　Ｍａｒｋｅｒ、ｄＮＴＰ、Ｒｎａｓｅ，Ｏｎｅ　Ｓｔｅｐ　仪中４２℃１　ｈ。９９℃５　ｍｉｎ，５℃５　ｍｉｎ，进　３．２猪蓝耳病属于高度传染性的免　ＲＮＡ　ＰＣＲ　Ｋｉｔ（ＡＭＶ）反转录酶、ＥＸ　行反转录．将反转录产物冻存或即用。　疫抑制性病毒，除直接对猪产生危害　Ｔａｑ　ＨＳ、１０ｘＲＴ　Ｂｕｆｆｅｒ、５ｘＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ　１－２．３目地基因片段的扩增体系（２５　Ｌ）：　外，还可破坏机体免疫系统，引起细胞　（以上均为凯基生物公司）氯仿、异丙　５ｘＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ　５　Ｌ，Ｅｘ　Ｔａｑ　ＨＳ　０．１２５　Ｌ，　免疫和体液免疫抑制。猪场一旦发生　醇、乙醇等氯仿、异丙醇、乙醇等（兽医　上游引物０．５　Ｌ，ｄＨ２０　１４．３７５　Ｌ，反转录　蓝耳病。就会影响其它疫病的免疫效　微生物实验室提供）。　产物ｃＤＮＡ　５　Ｌ。ＰＣＲ反应参数：９５℃。预变　果．增加了其它疫病的易感性。　１．１＿２引物设计：参考ＡＴＣＣ　ＶＲ一２３３２　性５　ｍｉｎ；９４℃变性４５　ｓ：５３℃退火４５　ｓ；７２℃　３．３猪蓝耳病病毒变异株是蓝耳病　序列，利用ＤＮＡＳｔｒａ和ＰＲＩＭＥＲ５．０，设　延伸１　ｍｉｎ．共３０个循环；７２￣Ｃ再延伸１０　ｍｉｎ。　病毒基因序列的缺失现象，其毒力比　计一对引物在上、下游引物。预计扩增　反应结束后取５　Ｌ　ＰＣＲ产物在１％的琼脂　普通蓝耳病强。至２００７年ｌ０月份以来我　片段为３４５　ｂｐ　ｆ引物的合成是由大连　糖凝胶上电泳．在凝胶成像系统上观察。　国２６个省发生了“猪高热病，，，在息猪体　宝生公司提供１　１．２．４参考国内外重点实验室公布的病原　内就分离到了猪蓝耳病病毒变异株，在　上游引物　序列，设计了蓝耳病非变异毒株及猪瘟病　我国发生猪高热病前美国曾发生过非　Ｐｌ　５　ＣＣＴＡＡＣＧＧＴＩ℃ＧＧＡＡＧＡＡＡＣ１、Ｇ３　典型蓝耳病，病猪死亡率也较高。　下游引物、　毒引物。对患猪的扁桃体、脾、肺、脑等组织　总之．ＰＲＲＳ病毒在不断的变异，给　Ｐ２　５　ＴＧＣＡＧＧＧＴＩＩＧＧＴＧＴＣＡＴＩＴｒ＾ＧＴ　３　分别研磨浸毒，经过与上述过程类似的　养猪业带来了严重的损失，所以说在　ＤＮＡ与ＲＮＡ提取．利用ＰＣＲ对提取的ＤＮＡ　兽医工作者不断攻克这些病毒的同　收稿日期：２００７—１２—２６　或ＲＮＡ进行扩增或反转录，然后对扩增结　时．做好其预防工作才是首位。　作者简介：李雅志（１９７９一），女，沈阳农业大　学２００５级临床硕士研究生，主要从事兽医　果通过琼脂糖凝胶电泳，运用凝胶成像系　临床诊断　统观察。