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•诊治分析
CTC-EGFR^fEGFR-TKIs—线治疗
非小细胞肺癌的预后评价
姜忠于胡春秀刘学武王立杨征奇
【摘要】
目的探究CTC-EGFR表达在EGFR-TKIs—线治疗非小细胞肺癌（NSCLC)的预后评价上的作用。方法选择NSCLC晚期患
者81例，接受三种TKI类药物（吉非替尼、厄洛替尼、盐酸埃克替尼）中任何一种治疗1个月，治疗前随机抽取15例患者采集空腹静脉血，流 式细胞分选技术分选外周血CTC并验证。采用流式细胞术检测所有患者治疗前及治疗后1个月的外周血CTC-EGFR表达，比较EGFR高表达 者和低表达者的治疗效果（有效率和控制率）及生存情况。结果经流式分选技术筛选的CD45-CK18+细胞在光镜下可见如细胞核经染色加
深、染色质变粗、细胞核质比增大等恶性肿瘤特征，证实CD45-CK18+细胞是外周血CTC; EGFR高表达者治疗有效率（74.1%)显著高于低
表达者（23.8%) , P<0_05; EGFR高表达者疾病控制率（89.7%)显著高于低表达者（40.5%) , P<0.05; EGFR高表达者的中位PFS、中位OS 以及2年生存率均显著高于低表达者（P均<0.05)。结论EGFR高表达者采用EGFR-TKIS有较好的预后和治疗效果，临床上可通过检测外周 血CTC-EGFR表达水平来判断EGFR-TKIs在治疗NSCLC上是否具有可行性。
【关键词】
外周血CTC EGFR EGFR-TKIs非小细胞肺癌流式细胞分选技术
【Abstract 】 Objective To explore the role of CTC-EGFR expression in the prognosis evaluation of non—small cell lung cancer ( NSCLC )
treated with first—line EGFR-TKIs chemotherapy. Methods 81 patients with advanced NSCLC were selected and treated with either of three TKI drugs ( gefitinib, enotinib, and ektinib hydrochloride ) for one month. Before treatment, 15 patients were randomly sampled to collect fasting venous blood, and CTC of peripheral blood was sorted by flow cytometry. Flow cytometry was used to detect the expression of CTC-EGFR in peripheral blood of all patients before and 1 month after treatment. The therapeutic effect ( efficiency and control rate ) and survival of patients with high and low expression of EGFR were compared. Results CD45—CK18+ cells screened by flow cytometry showed that the nuclei of CD45—CK18+ cells were stained deeper, the chromatin became thicker and the ratio of nucleus to cytoplasm increased, showing the characteristics of malignant tumor celk. It was confirmed that CD45—CK18+ cells were CTC of peripheral blood.The effective rate of treatment in patients with high expression of EGFR ( 74.1% ) was significandy higher than that in those with low expression ( 23.8% ) , P<0.05. The disease control rate in patients with high expression of EGFR ( 89.7%) was significantly higher than that in patients with low expression ( 40.5% ) , P<0.05. The median PFS, OS and 2-year survival rate in patients with high expression of EGFR were higher than those with low expression ( P<0.05 ) . Conclusion EGFR-TKIS has better prognosis and therapeutic effect in patients with high expression of EGFR. Clinically, the feasibility of EGFR-TKIs in the treatment of NSCLC can be judged by detecting the expression level of CTC-EGFR in peripheral blood .【Key words 】
Peripheral blood CTC EGFR EGFR-TKIs Non—small cell lung cancer Flow cytometry
循环肿瘤细胞（circulating tumor cell, CTC)是存 在于外周血中的各类肿瘤细胞的总称，有研究显示，
1资料与方法
CTC存在于所有肿瘤患者体内，即使原发性病灶已被
切除[1]。目前CTC在转移肿瘤患者的预后评估中应用 最为广泛，尤其是恶性肿瘤患者[2]。CTC存在由细胞 表皮因子受体（EGFR)信号转导通路异常所引起的
1.1 一般资料选自2017年4月至2018年3月期间 由本院收治确诊的晚期NSCLC患者81例，男55例， 女26例；年龄35~78岁，平均（45 ± 5.8 )岁；病程 1~15个月，平均（0.5±6.5)个月。本研究在医院医 学伦理会同意下并征得所有患者及家属同意且签署知 情同意书。纳人标准：（1) NSCLC患者需经病理组织 检查并确诊EGFR突变阳性；（2 )经影像学检查（CT 或MRI)病灶大小可测量；（3)入组前从未接受过
EGFR表达过度及变异等可促进癌细胞增殖且抑制凋
亡的生长调节异常的现象[3_5]。近年来，随着分子靶 向药物逐渐成为肺癌靶向治疗位点的热点研究方向[6]。 对于晚期非小细胞肺癌（NSCLC)的靶向治疗药物目 前以EGFR酪氨酸激酶抑制剂（TKI)类药物为主[7]。 本资料探讨CTC-EGFR表达水平对EGFR-TKIs —线 治疗晚期NSCLC的预后影响。现报道如下。
TKI类药物治疗;（4)预计生存期>3个月。排除标准：
(1 )不能经组织病理检查确诊为NSCLC，EGFR野生型； (2 )已使用过TKI类药物治疗；（3 )合并有其它恶性 肿瘤合并；（4 )肝肾功能异常；（5 )具有TKI类药物 严重不良反应D
1.2治疗方法根据患者的经济情况进行用药，36例 患者服用吉非替尼250mg，1次/d ; 19例患者服用厄 洛替尼150mg，1次/d以及26例患者服用盐酸埃克替
基金项目：浙江省衝州市科技计划项目（20111092) 作者单位：324004浙江衢化医院
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尼125mg, 3次/d。均持续服用1个月。TKI治疗进展 后腺癌采用培美曲塞或多西他赛联合抗血管靶向药(贝 伐单抗），鳞癌采用多西他赛联合销类后续治疗。1.3外周血CTC分选及验证使用流式细胞分选技 术。治疗前随机抽取15例患者在空腹状态下采集肘 部静脉血20ml,使用肝素抗凝后，将其均分成20管， 每管lml。在每管中加人CD45-PC5、CK18-FITC各 200 jU后，避光处放置30min;再加人氯化铵（NH4C1) 溶血素4ml,反复溶血直至管中液体透亮后，进行离 心后再加人培养液，开启流式细胞仪进行分选。对
过光镜可观察到细胞核颜色加深、染色质变粗及细胞 核质比增大等现象，即恶性肿瘤细胞特征现象，从而 证实CD45-CK18+细胞是外周血CTC。
2.2病理检查病理分型为腺癌73例，鱗癌8例；
TNM分期为El b期6例和IV期75例；功能状态（ps)
评分为〇〜1分54例以及為2分27例。
2.3 EGFR高表达和低表达者比较81例晚期NSCLC 中，EGFR表达的中位数为52.6%。治疗前EGFR高 表达者和低表达者分别为35例和46例，治疗1个 月后的EGFR高表达者和低表达者分别为39例和42 例。EGFR高表达者有效率（74.1%)显著高于低表达 者（23.8% )，P<0.05 ; EGFR 髙表达者控制率（89.7% ) 显著高于低表达者（40.5%)，P<0.05。EGFR高表达 与低表达者的疗效评价见表1。
表1
治疗1个月末疗效情况及EGFR表达情况观察[n ( % > ]
CR
5 (12.8)1 (2.4)6 (7.4)
SORT的左右进行设置，左侧收集CD45-PC5细胞群，
右侧收集CK18-FITC细胞群。再根据要求以1500个 为收集数目，同时装配分选管，并以10000~25000个 /s流速收集细胞，收集需全程震荡。分选出的CD45-
CK18+细胞用玻片最后收集微球，进行HE染色后，
在光镜下观察细胞特征表现。
1-4外周血CTC-EGFR表达检测使用流式细胞分 选技术。81例患者在TKI类药物治疗前及治疗1个 月后空腹状态下采集肘部静脉血5ml经肝素抗凝处理 后，取 100|xl 加人有 CD45-PC、5EGFR-PE 和 CK18-
2.4
EGFR表达情况EGFR高表达者
EGFR低表达者
总计
PR
20 (51.3)9 (21.4)29 ( 35.8 )
SD
10 (25.6)7 (16.7)17 (21.0)
PD
4 (10.3)25 (59.5)29 (35.8)
RR
74.1%23.8%43.2%
DCR
89.7%40.5%64.2%
EGFR髙表达者和低表达者预后比较由表2可
2
知EGFR高表达者中位PFS、中位0S及高于低表达者（P均
<〇.〇5)。
年生存率均
FITC各20jjl1的5ml无菌试管中，摇匀，在室温下
避光处放置30min ;再加人NH4C1溶血素进行溶血 处理，15min后上流式细胞仪同时检测外周血CTC-
随访2年中EGFR高表
达者和低表达者死亡数分别是22例、30例。
表2 EGFR高表达者和低表达者预后比较
中位PFS (月）
中位0S (月）
159
2年生存率[« (%)]
17 (43.5)12 (28.6)
EGFR表达。用外周血CTC-EGFR表达的中位数为界
值，EGFR表达的中位数为52.6%将大于中位数的定 为EGFR高表达，低于中位数则为EGFR低表达。1.5疗效评价及随访观察（1)疗效评价：参照
EGFR高表达者（\"=39)EGFR低表达者（\"=42 )
9.5 2
3讨论
临床检测EGFR突变情况的方法较多，但均需依
RECIST1.1标准对患者进行抗癌治疗1个月后的疗效
进行区别划分，即所有目标病灶消失且所有淋巴结直 径减小至<10mm为完全缓解（CR)、目标病灶短直径 和减少>30%为部分缓解（PR)、目标病灶短直径之和 增加>20%或出现新病灶为疾病进展（PD)、目标病 灶短直径之和减小程度未达到PR或是增加程度未达
赖组织标本进行检测。目前以手术切除或穿刺活检的 肺癌组织作为检测标本是NSCLC患者进行EGFR基 因突变检测的主要方法，但此时患者的诊断多处于早 期，或是中晚期且尚未进行靶向治疗，而晚期手术患 者又难以获得足量标本。因而晚期NSCLC患者虽然可 从TKIs药物靶向治疗中获益，但因缺乏简单方便的临 床检测方法而导致在制订使用TKIs类药物的治疗方 案时，缺乏确定性证据。若患者的临床治疗方案不适 用，则影响生存时间，甚至涉及疾病发展。而如何利 用CTC-EGFR从组织标本获取量不足的患者中筛选出 适宜TKI靶向治疗患者是临床医生目前所需解决的重 要问题。
外周血CTC-EGFR的表达情况依据其表达的中位 数作区分点，将其分为EGFR高表达和低表达两种情 况，本次研究在治疗前后的比较中发现，治疗后1个
月EGFR高表达例数有所降低，提示EGFR的表达同
PD则为疾病稳定（SD);其中治疗有效率（RR)以 CR+PR表示，疾病控制率(DCR测用CR+PR+SD表示。
(2)预后情况观察：完成治疗后随访2年，记录所有 患者的无进展生存期（PFS)、总生存期（0S)以及2 年的生存率。并对EGFR高表达者和低表达者的RR、
DCR、中位PFS、中位0S以及2年生存率进行比较。
1.6统计学方法采用SPSS 19.0统计软件。计量资料 以U±s)表示，组间比较采用t检验；计数资料采用
X 2检验；PFS、生存率采用Kaplan-Meier方法中Log- Rank 检验。 P<0.05 为差异有统计学意义。
2结果
TKI类药物的使用可能有某种相关性。进一步研究发
现，晚期NSCLC患者中EGFR高表达者的RR和DCR 均显著高于低表达者。说明应用TKIs类药物进行靶向
(下转第1373页>
2.1外周血CTC验证染色后的CD45-CK18+细胞通
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死，并且支架与食管壁间的空隙易导致食物残渣或坏 死组织滞留，进一步引发炎症或溃疡，术后并发症较多， 对后期放疗造成不利影响，因此，可对此类患者单纯 应用放疗技术改善预后，减少患者治疗期间痛苦。
本资料中，与治疗前比较，治疗后2周两组患者
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Stooler分级均明显改善，但两组间差异无统计学意义，
治疗组总有效率高于对照组，但差异无统计学意义， 提示内镜直视与X线机荧屏监测下放置支架术疗效相 当。术前应利用钡餐充分了解患者病变狭窄位置及狭 窄程度，无论内镜直视下还是X线机荧屏监测下置人 操作动作都要轻柔，对于确定或者是高度怀疑狭窄程 度严重者建议直接给予X射线下置人操作，以免增加 患者痛苦。两组患者术后均出现胸痛、出血、支架移 位等并发症，结果显示，两组患者术后胸痛、出血发 生率均为100%，经对症治疗均得到有效缓解，两组术 后并发症发生情况比较无明显差异，但治疗组术后并 发症较低，可见在内镜直视下，医务人员能够明确观 察置人操作全过程，对于穿孔、出血等情况可及时发 现，从而降低支架植人难度，并尽可能避免术后并发症， 改善预后。
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EGFR的表达水平来判断在临床上是否进行TKIs类
药物治疗，这是一种对于无法获取足量组织标本进 行EGFR突变检测患者的有效补充。同时，对于晚期
NSCLC且进行一线化疗的患者，因生存期较短，使用
的化疗方案需尽可能确保病灶被有效控制，临床治疗 中不需花费过多的时间在化疗方案的调整上。此外， 本研究结果表示，在中位PFS、中位0S及2年生存率 的比较中EGFR高表达者均显著高于EGFR低表达者， 表明EGFR髙表达的晚期NSCLC患者经TKI类药物靶 向治疗后具有更好的预后。进一步说明对于EGFR高 表达的一线晚期NSCLC患者，基本确定了使用TKI类 药物有更好的预后，化疗方案无需进行试验性使用， 减少因化疗方案选择不当引起的时间浪费。
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EGFR低表达者强。提示采用TKI靶向治疗的晚期 NSCLC患者可通过检测外周血CTC-EGFRDE表达水
平来筛选，提高患者临床治疗效果。
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