北京索莱宝科技有限公司NAD-苹果酸脱氢酶(NAD-MDH)活性检测试剂盒说明书紫外分光光度法注意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定。货号：BC1040规格：50T/48S产品内容：提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存；试剂一：液体40mL×1瓶，4℃保存；试剂二：粉剂×2支，-20℃保存；临用前加入360μL双蒸水，用不完的试剂仍-20℃保存；试剂三：粉剂×2支，-20℃保存；临用前加入327μL双蒸水，用不完的试剂仍-20℃保存。产品说明：MDH（EC1.1.1.37）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，线粒体中MDH是TCA循环的关键酶之一，催化苹果酸形成草酰乙酸；相反，胞浆中MDH催化草酰乙酸形成苹果酸。草酰乙酸是重要的中间产物，连接多条重要的代谢途径。因此，MDH在细胞多种生理活动中扮演着重要的角色，包括线粒体的能量代谢、苹果酸-天冬氨酸穿梭系统、活性氧代谢和抗病性等。根据不同的辅酶特异性，MDH分为NAD-依赖的MDH和NADP-依赖的MDH，细菌中通常只含有NAD-MDH，在真核细胞中，NAD-MDH分布于细胞质和线粒体中。NAD-MDH催化NADH还原草酰乙酸生成苹果酸，导致340nm处光吸收下降。需自备的仪器和用品：紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL石英比色皿和蒸馏水。操作步骤：一、样品测定的准备：1、细菌、细胞样品的制备：细菌或培养细胞：收集细菌或细胞到离心管内，弃上清，按照每200万细菌或细胞加入400μL提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率20％，超声3s，间隔10s，重复30次），8000g4℃离心10min，取上清，置冰上待测。第1页，共3页北京索莱宝科技有限公司2、组织：称取约0.05g组织，加入1mL提取液进行冰浴匀浆；8000g4℃离心10min，取上清，置冰上待测。3、血清（浆）样品：直接检测。二、测定步骤和加样表：紫外分光光度计提前预热30min，调节波长至340nm，蒸馏水调零，试剂一37℃预热15min。试剂名称（µL）样本蒸馏水试剂一试剂二试剂三测定管20-7601010空白管-207601010将上述试剂按顺序加入1mL石英比色皿中，充分吸打混匀后立即在340nm波长下记录初始吸光度A1和反应1min后的吸光度A2，尽量保持反应温度为37℃。计算ΔA=A1-A2。记录ΔA测定、ΔA空白。三、NAD-MDH活力单位的计算：1、血清（浆）NAD-MDH活力的计算单位的定义：每毫升血清（浆）在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。NAD-MDH（U/mL）=(ΔA测定-ΔA空白)÷(ε×d）×V反总÷V样本÷T=6430×(ΔA测定-ΔA空白)2、组织中NAD-MDH活力的计算:（1）按样本蛋白浓度计算：单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。NAD-MDH（U/mgprot）=(ΔA测定-ΔA空白)÷(ε×d）×V反总÷(V样本×Cpr)÷T=6430×(ΔA测定-ΔA空白)÷Cpr（2）按样本鲜重计算：单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。NAD-MDH（U/g鲜重）=(ΔA测定-ΔA空白)÷(ε×d）×V反总÷(W÷V提取×V样本)÷T=6430×(ΔA测定-ΔA空白)÷W第2页，共3页北京索莱宝科技有限公司3细菌或培养细胞中NAD-MDH活力的计算:（1）按样本蛋白浓度计算：单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。NAD-MDH（U/mgprot）=（ΔA测定-ΔA空白）÷（ε×d）×V反总÷(V样本×Cpr)÷T=6430×(ΔA测定-ΔA空白)÷Cpr（2）按细菌或细胞密度计算：单位的定义：每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。NAD-MDH（U/10cell）=(ΔA测定-ΔA空白)÷(ε×d）×V反总÷(500×V样本)÷T=13×(ΔA测定-ΔA空白)V反总：反应总体积，0.8mL；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10mL/nmoL/cm；T：反应时间，1min；500：细菌或细胞密度，10/mL注意事项：1、粗酶液的提取必须在0℃-4℃中操做完成，以防止酶变性失活。2、实验时，试剂二、试剂三和样本在冰上放置，以免变性和失活。3、当初始读值小于0.7或者ΔA大于0.5时建议稀释后测量。4、建议一人加样一人比色。5、空白管测1-2管即可。4
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V样本：加入样本体积，0.02mL；d：比色皿光径，1cm；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；第3页，共3页