通窍活血汤对血管性痴呆大鼠学习记忆功能及海马神经元细胞内钙离 子浓度的影响 葛朝亮 ，王鑫铭 ，李飞龙 ，汪宁 ，许杜娟 （１．安徽医科大学第一附属医院药剂科，国家中医药管理局中药化学三级实验室，合肥 ２３００２２；２．安徽中医药大学，安徽省中药研究与开发重点实验室，合肥２３００３８） 摘要：目的研究通窍活血汤（ＴＱＨＸＤ）对拟血管性痴呆（ｖａｓｃｕｌａｒ ｄｅｍｅｎｔｉａ，ＶＤ）大鼠学习记忆的作用及对大鼠海马神经元细 通过改良的双侧颈总动脉结扎法（２－ＶＯ）建立拟血管性痴呆大鼠模型，通过Ｍｏｒｒｉｓ水迷宫实 胞内钙离子浓度的影响。方法验对大鼠的学习记忆能力进行检测；流式细胞仪分析检测海马神经元细胞内钙离子（ｃａ２ ）荧光强度。结果 与模型组相比， 通窍活血汤高剂量、中剂量、低剂量能显著减少血管性痴呆大鼠逃避潜伏期和找到并爬上平台的总路程（Ｐ＜０．０１）；高剂量、 中剂量及低剂量能明显增加血管性痴呆大鼠进入所在象限的次数、平台所在象限停留的时间、平台所在象限游动的距离（Ｐ＜ ０．０５），缩短第一次进入平台所在象限的时间（Ｐ＜０．０５）；与模型组相比，通窍活血汤高剂量、中剂量、低剂量能明显降低血管 性痴呆大鼠海马神经元细胞内Ｃａ 的浓度（Ｐ＜０．０１，Ｐ＜０．０５）。结论的损伤作用有关。 通窍活血汤能够明显改善血管性痴呆大鼠的学习、 记忆能力，作用机制可能与其降低血管性痴呆大鼠海马神经元细胞内钙离子浓度，减少异常升高的细胞内钙离子对神经细胞 关键词：通窍活血汤；血管性痴呆；钙离子；学习记忆 ｄｏｉ：１０．１１６６９／ｃｐｊ．２０１５．０８．００４ 中图分类号：Ｒ９６５ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００１—２４９４（２０１５）ｏ８～０６７１一Ｏ５ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｔｏｎｇｑｉａｏ Ｈｕｏｘｕｅ Ｄｅｃｏｃｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ Ｍｅｍｏｒｙ ａｎｄ Ｌｅａｒｎｉｎｇ Ａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ｏｆ Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｃａｌｃｉｕｍ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ Ｎｅｕｒｏｎｓ ｏｆ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｄｅｍｅｎｔｉａ Ｒａｔｓ ＧＥ Ｃｈａｏ．１ｉａｎｇ ，ＷＡＮＧ Ｘｉｎ—ｍｉｎｇ ，ＬＩ Ｆｅｉ－ｌｏｎｇ ，ＷＡＮＧ Ｎｉｎｇ２，ＸＵ Ｄｕ－ｊｕａｎ （１．ＴｈＰ Ｔｈｉｒｄ—Ｇｒａｄｅ ＰｈａｒｒｎａｃｅＭｔｉｃａ１ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｓｔａｔｅ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｔｈｅ Ｆｉｒｓｔ Ａｆｉｌｆｉａｔｅｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｆ ｏＡｎｈｕｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｈｅｆｅｉ ２３００２２，Ｃｈｉｎａ；２．Ａｎｈｕｉ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｃｈｉｅｓｎｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ａｎｈｕｉ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｃｈｉｅｓｎｅ Ｍｅｄｉｃｉｅ Ｃｏｌｎｌｅｇｅ，Ｈｅｆｅｉ ２３００３８，Ｃｈｉｎａ） ＡＢＳＴＲＡＣＴ：ＯＢＪＥＣＴＩＶＥ Ｔｏ ｓｔｕｄｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｏｎｇｑｉａｏ ｈｕｏｘｎｅ ｄｅｃｏｃｔｉｏｎ（ＴＱＨＸＤ）ｏｎ ｍｅｍｏｒｙ ａｎｄ ｌｅａｒｎｉｎｇ ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｒａｔｓ ｗｉｔｈ ｖａｓｃｕｌａｒ ｄｅｍｅｎｔｉａ（ＶＤ）ａｎｄ ｉｔｓ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ｏｆ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｌｃｉｕｍ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ｎｅｕｒｏｎｓ． ＭＥＴＨＯＤＳ Ｖａｓｃｕｌａｒ ｄｅｍｅｎｔｉａ ｍｏｄｅｌ ｗａｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｂｉｌａｔｅｒａｌ ｃａｒｏｔｉｄ ａｒｔｅｒｙ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅ Ｍｏｒｒｉｓ ｗａｔｅｒ ｉｔｙ ｏｆ ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｌｃｉｕｍ ｗａｓ ｍａｚｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｗａｓ ａｄｏｐｔｅｄ ｔｏ ｅｖａｌｕａｔｅ ｔｈｅ ｅｔｈｏｌｏｇｙ ｏｆ ＶＤ ｒａｔｓ．Ｔｈｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓ．ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．ＲＥＳＵＬＴＳ Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｍｏｄｅｌ ｇｒｏｕｐ，ｈｉｇｈ，ｍｉｄｄｌｅ ａｎｄ ｌｏｗ ｄｏｓｅ ｇｒｏｕｐ ｏｆ ＴＱＨＸＤ ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔｌｙ ｒｅ— ｄｕｃｅ ｔｈｅ ｔｉｍｅ ｏｆ ｅｓｃａｐｅ ｌａｔｅｎｃｙ ａｎｄ ｔｈｅ ｄｉｓｔａｎｃｅ ｏｆ ｃｌｉｍｂｉｎｇ ｏｎ ｔｈｅ ｐｌａｔｆｏｒｍ（Ｐ＜０．Ｏ１）．Ｔｈｅ ｅｎｔｒｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓｅｃｏｎｄ ｑｕａｄｒａｎｔ，ｔｈｅ ｔｉｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓｅｃｏｎｄ ｑｕａｄｒａｎｔ ａｎｄ ｔｈｅ ｄｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｔｈｅ ｓｅｃｏｎｄ ｑｕａｄｒａｎｔ ｉｎ ｒｅｌａｔｉｏｎ ｔｏ ｈｉｇｈ，ｍｉｄｄｌｅ ａｎｄ ｌｏｗ ｄｏｓｅ ｇｒｏｕｐｓ ｏｆ ＴＱＨＸＤ ｗｅｒｅ ｉｎ－ ｃｒｅａｓｉｎｇ ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔｌｙ（Ｐ＜０．０５）ａｎｄ ｔｈｅ ｌａｔｅｎｃｙ ｔｏ ｉｆｒｓｔ ｅｎｔｙ ｒｉｎ ｔｈｅ ｓｅｃｏｎｄ ｑｕａｄｒａｎｔ ｗａｓ ｓｈｏｒｔｅｎ（Ｐ＜０．０５）．Ｔｈｅ ｌｆｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎ‘ ｓｉｔｙ ｏｆ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｌｃｉｕｍ ｉｎ ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ｎｅｕｒｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｈｉｇｈ．ｍｉｄｄｌｅ ａｎｄ ｌｏｗ ｄｏｓｅ ｇｒｏｕｐｓ ｏｆ ＴＱＨＸＤ ｗａｓ ｌｏｗｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ ｔｈｅ ｏｒｏｄ— ｅｌ ｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０１，Ｐ＜０．０５）．ＣＯＮＣＬＵＳＩＯＮ ＴＱＨＸＤ ｃａｎ ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ ｍｅｍｏｒｙ ａｎｄ ｌｅａｒｎｉｎｇ ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｒａｔｓ ｗｉｔｈ ＶＤ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ． Ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｍａｙ ｂｅ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｒｅｄｕｃｅ ｔｈｅ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｌｃｉｕｍ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ，ｔｈｅｒｅｂｙ ｔｈｅ ｄａｍａｇｅ ｏｆ ｎｅｒｖｅ ｃｅｌｌｓ ｉｓ ｒｅｄｌｌｃｅｄ． ＫＥＹ ＷＯＲＤＳ：ｔｏｎｇｑｉａｏ ｈｕｏｘｕｅ ｄｅｃｏｃｔｉｏｎ；ｖａｓｃｕｌａｒ ｄｅｍｅｎｔｉａ；ｃａｌｃｉｕｍ；ｌｅａｒｎｉｎｇ ａｎｄ ｍｅｍｏｒｙ 血管性痴呆（ｖａｓｃｕｌａｒ ｄｅｍｅｎｔｉａ，ＶＤ）是指发生 在脑血管疾病基础上的以记忆、认知功能缺损为主 要表现，或伴有语言、视觉、空间技能及情感及人格 障碍的获得性智能的持续性损害；其特点是起病突 然、病程起伏不定ｎ 。目前通过多种脑缺血动物模 型的研究表明，脑部损伤如缺氧、缺血时，兴奋性神 基金项目：安徽省年度重点科研计划项目（１３０１０４３０４７） 作者简介：葛朝亮，男，硕士，副主任药师 研究方向：中药药效及物质基础相关ｆ生研究中国药学杂志２０１５年４月第５Ｏ卷第８期 Ｔｅｌ：（０５５１）６２９２２４３８ Ｅ－ｍａｉｌ：ｇｅｃｈａｏｌｉａｎｇ＠１２６．ｃｏｎｒ Ｃｈｉｎ Ｐｈｎ Ｊ，２０１５ Ａｐｒｉｌ，Ｖｏ１．５０ Ｎｏ．８ ６７１・ 经递质就会过量释放，使突触后神经元处于持续去 极化状态，大量钙离子内流，从而介导细胞内一系列 依赖钙离子的生化反应以致神经细胞凋亡 ，进而 造成学习记忆功能的障碍。中药传统名方通窍活血 汤（ＴＱＨＸＤ）具有活血化瘀，开窍通闭之功效，可以 抗血小板凝集，抗血栓形成，清除氧自由基，改善血 液流变学等作用。对中风（包括脑梗死、ＶＤ、脑供血 不足等）、偏头痛等疾病的防治及症状的改善有良 好的效果，且作用确切，是临床治疗ＶＤ的常用方 剂 Ｊ。目前关于ＴＱＨＸＤ对调节拟ＶＤ大鼠海马神 经元内钙离子浓度的机制少见报道，故本实验通过 改良的双侧颈总动脉结扎的方法复制拟ＶＤ大鼠模 型，初步探讨其对ＶＤ大鼠学习记忆的作用与海马 神经元内钙离子浓度的关联性，从而为其在临床的 应用提供合理的理论实验依据。 １材料 １．１实验动物 Ｓｐａｇｕｅ—Ｄａｗｌａｙ（ＳＤ）大鼠，早、６各半，（２５０ ４－ １０）ｇ［安徽医科大学实验动物中心，许可证号：ｓｃｘｋ （皖）２０１１４３０２，ＳＰＦ级］。实验前在本实验室适应性 饲养一周。 １．２药品与试剂 ＴＱＨＸＤ（川芎，赤芍，桃仁，红花，麝香等药材购 自合肥和义堂中药饮片有限公司）；尼麦角林片（商 品名：思尔明，１０ ｍｇ，美国辉瑞公司，批号： １３００１０８）；庆大霉素注射液（上海中西制药有限公 司，批号：１３０５０２）；０．２５％胰蛋白酶（１Ｘ）溶液（美国 Ｔｈｅｒｍｏ公司，批号：Ｊ１３００４１）；胎牛血清（美国Ｃｌａｒｋ 公司，批号：ＪＣ２６１６１）；Ｆｌｕｏ．３／ＡＭ钙离子荧光探针 （日本同仁化学研究所，批号：ＦＫ８５３）；ＤＭＳＯ（美国 Ｓｉｇｍａ公司，批号：ＳＨＢＣ３３１３Ｖ）。 １．３实验仪器 ＸＲ—ＸＭ１０１型Ｍｏｒｒｉｓ水迷宫（上海欣软信息 科技有限公司）；Ｒ一１００５旋转蒸发仪（郑州长城科 工贸有限公司）；ＴＧＬ一１８５型台式高速冷冻离心机 （长沙平凡仪器仪表有限公司）；３７１型ＣＯ 培养箱 （美国Ｔｈｅｒｍｏ公司）；ＩＣ１０００型Ｃｏｕｎｔｓｔａｒ全自动细 胞计数分析仪（美国Ｉｎｎｏ．ａｌｌｉａｎｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ公司）； Ｎａｖｉｏｓ流式细胞仪（美国Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ公司）。 ２方法 ２．１ ＴＱＨＸＤ的制备 将川芎、赤芍、红花、桃仁、葱、大枣、姜加入１０ Ｃｈｉｎ尸 口 ｎ，，２０１５ ａｐｒｉｌ．Ｖｏ１．５０ Ｎｏ．８ 倍量的黄酒，浸泡１ ｈ，加热回流提取３次，每次２ ｈ， 趁热过滤，合并３次滤液，旋转蒸发浓缩，残留物中 加入麝香及黄酒的稀释液，过滤，滤液配制成每１ ｍＬ含原药材１．２０ ｇ。 ２．２ 改良ＶＤ模型的制备 用３．５％的水合氯醛腹腔注射大鼠麻醉后， 碘酒消毒，仰卧颈正中切口，钝性分离肌肉层，暴 露右侧的颈总动脉（ＣＣＡ）和迷走神经，分离迷走 神经和ＣＡＡ，将右侧ＣＣＡ用手术线结扎，１ ｄ后 同样的方法结扎左侧ＣＣＡ。假手术组采用相同 的步骤，只分离出ＣＣＡ不结扎，缝合内外切口， 常规消毒切口。造模过程用人工加热器加热，保 持大鼠体温在３７ ｑＣ，防止低温对于动物的损伤 作用。术后予适量红霉素软膏手术部位涂敷２ 次・ｄ一，同时庆大霉素８ ０００ Ｕ腹腔注射１次・ ｄ～，连续５ ｄ，防止感染。 ２．３动物分组与给药 ＳＤ大鼠适应性喂养１周后，随机分为造模组和 假手术组分别为８０只和１０只，第８天开始连续 Ｍｏｒｒｉｓ水迷宫训练５ ｄ，一周之后将造模组大鼠经过 水迷宫筛选后将符合ＶＤ标准的大鼠按照平均体重 分为５组，模型组对照１１只，阳性药组１２只， ＴＱＩａＸＤ高剂量１１只，中剂量ｌ２只，低剂量１１只， 另假手术组１０只。除去灌胃给药中死亡大鼠，最终 结果为活血通窍汤高剂量组９只（１２．０４ ｇ・ｋｇ ）， ＴＱＨＸＤ中剂量组９只（６．０２ ｇ・ｋｇ ），ＴＱＨＸＤ低 剂量１０只（３．０１ ｇ・ｋｇ ），阳性药组９只（６ ｍｇ・ ｋｇ ），模型组８只，假手术组９只。模型对照组，假 手术组按照等量给予蒸馏水。每天１次，连续灌胃 ３１ ｄ。 ２．４标本的采集 用３．５％水合氯醛腹腔注射大鼠麻醉，腹主动 脉取血后，立即于冰台上快速断头处死，取出全脑， 并且在层流洁净台中分离出海马组织。用生理盐水 冲尽海马组织上残血，置于试管中用眼科手术剪机 械剪碎，用于流式细胞仪检测各组ＶＤ大鼠海马神 经元细胞内钙离子荧光强度。 ２．５检测指标及方法 ２．５．１拟ＶＤ标准 以假手术组大鼠在１２０ Ｓ内 寻找到并爬上平台的搜索持续时间即逃避潜伏期 （ｅｓｃａｐｅ ｌａｔｅｎｃｙ，ＥＬ）的平均值作参考值，计算造模 组大鼠隐匿平台逃避潜伏期平均值与参考值的差占 该鼠隐匿平台逃避潜伏期的比值，若该值大于２０％ 为拟ＶＤ大鼠模型。 中国药学杂志２０１５年４月第５Ｏ卷第８期 ２．５．２学习记忆能力检测采用Ｍｏｍｓ水迷宫 Ｊ。 ３实验结果 灌胃３０ ｄ后用Ｍｏｒｒｉｓ水迷宫法对大鼠学习和记忆 功能进行评估。水温控制在２２—２３℃，水中加入黑 ３．１ ＴＱＨＸＤ对ＶＤ大鼠定向航行实验的影响 ＶＤ大鼠连续灌胃给药３１ ｄ后，与假手术组相 比，模型对照组ＥＬ和总路程均有显著的延长，结果 色食用色素，使其呈黑色不透明状。在水池壁的上 沿等距分布４个不同形状的标记，由此将水池等分 为一、二、三、四个象限，选第二象限正中放置直径 存在显著性差异（Ｐ＜０．００１）；在给予高、中、低剂量 的ＴＱＨＸＤ后ＥＬ和总路程明显缩短（Ｐ＜０．０１，Ｐ＜ ０．００１）。见表１。 ３．２ ＴＱＨＸＤ对ＶＤ大鼠空间探索实验的影响 ８ ｃｍ的平台，没入水下２ ｃｍ，迷宫外参照物保持固 定，并且隔绝自然光，用屋中灯光照明。①定向航行 实验（ｐｌａｃｅ ｎａｖｉｇａｔｉｏｎ）：将大鼠从第四象限面朝向 池壁轻轻放入水中，记录其ＥＬ和１２０ Ｓ内找到并爬 上平台所用的路程，若大鼠１２０ Ｓ内尚未找到平台， 则将其引导至平台停留３０ Ｓ，逃避潜伏期记录为 ＶＤ大鼠给药３１ ｄ之后，与模型组相比， ＴＱＨＸＤ高剂量、中剂量及低剂量明显增加ＶＤ大鼠 穿过平台所在象限的次数和平台所在象限游动的距 离（Ｐ＜０．０５），缩短ＶＤ大鼠第一次进入平台所在 象限的时间（Ｐ＜０．０５）；高剂量、中剂量明显增加 ＶＤ大鼠平台所在象限停留的时间（Ｐ＜０．０５），低剂 量呈增加趋势（Ｐ＞０．０５）。见表２。 ３．３ ＴＱＨＸＤ对大鼠海马神经元细胞内钙离子荧光 强度的影响 １２０ Ｓ。取４ ｄ的平均成绩作为测试的成绩。②空间 探索实验（ｓｐａｃｅ ｎａｖｉｇａｔｉｏｎ）：定向航行结束后撤除 平台，让大鼠在水池中游１２０ Ｓ来寻找平台，记录大 鼠１２０ Ｓ内跨越平台所在象限次数、在平台所在内 象限游动的距离、在平台象限停留的时间、第一次进 人平台所用时间，取４ ｄ的平均成绩作为测试的成 绩以判断大鼠记忆及重现能力。 ２．５．３ 含荧光探针单细胞悬液的制备 用４４．２ ｔｘＬ ＤＭＳＯ溶解５０ ｇ的Ｆｌｕｏ－３／ＡＭ粉末制成１ ｍｍｏｌ・Ｌ 荧光探针母液，１ ｍＬ的Ｈａｎｋｓ液加入５ 与假手术组比较，模型组大鼠海马神经元细胞 内的ｃａ。 荧光强度明显增加（Ｐ＜０．０５）；与模型组 比较，ＴＱＨＸＤ高、中剂量及低剂量组大鼠海马神经 元细胞内的ｃａ¨荧光强度均明显降低（Ｐ＜０．０１， Ｐ＜０．０５），见表３，图１。 表１ 通窍活血汤（ＴＱＨＸＤ）对ＶＤ大鼠逃避潜伏期（ＥＬ）和 爬上平台所用路程（ｄｉｓｔａｎｃｅ）的影响．面±ｓ Ｔａｂ．１ Ｔｈｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ＴＱＨＸＤ ｏｎ ｔｈｅ ＥＬ ａｎｄ ｔｈｅ ｄｉｓｔａｎｃｅ ｏｆ ｃｌｉｍｂｉｎｇ ｏｎ ｔｈｅ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｏｎ ＶＤ ｒａｔｓ．孟±ｓ 荧光探针母液配制成探针工作液。 将剪碎的海马组织加入０．２５％的胰蛋白酶溶 液，３７℃水浴消化１０ ｍｉｎ，经２００目尼龙筛网过滤， 滤液离心后所得沉淀，用Ｄ．Ｈａｎｋｓ液漂洗后加入 Ｆｌｕｏ一３／ＡＭ工作液，放入ＣＯ，培养箱，３７ ｃｌＣ孵育３０ ｍｉｎ，离心，沉淀加入ＨＢＳＳ制成单细胞悬液，用细胞 计数仪测定细胞浓度，并用Ｈａｎｋｓ 溶液调整细胞浓 度为２×１０。个・ｍＬ～，３７ ｃ【＝孵育，上机检测。 ２．６统计学处理 采用ＳＰＳＳ１２．０统计软件进行单因素方差分析， 数据用均数４－标准差（元４－ ）表示，显著性差异水平 以Ｐ＜０．０５为标准。 注：与假手术组比较， ）Ｐ＜Ｏ．００１；与模型组比较， ）Ｐ＜０．０１， ）Ｐ＜Ｏ．００１ Ｎｏｔｅ：１）Ｐ＜Ｏ００１，ＶＳ ｓｈａｍ ｇｒｏｕｐ；２）ｐ＜００ｌ，３）Ｐ＜０００１，ＶＳｍｏｄｅｌ ｇｒｏｕｐ ．．．表２ ＴＱＨＸＤ对ＶＤ大鼠空间探索（第二象限）实验的影响．元±ｓ Ｔａｂ．２ Ｔｈｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ＴＱＨＸＤ ｏｎ ｔｈｅ ｓｐａｃｅ ｎａｖｉｇａｔｉｏｎ（ｉｎ ｔｈｅ ｓｅｃｏｎｄ ｑｕａｄｒａｎｔ）ｔｅｓｔ ｏｎ ＶＤ ｒａｔｓ．面４－ｓ 注：与假手术组比较， ）Ｐ＜０．０１；模型组比较，２）Ｐ＜０．０１，３）Ｐ＜０．０５ Ｎｏｔｅ：１）Ｐ＜Ｏ０１，ＶＳ ｓｈａｍ ｇｒｏｕｐ；２）Ｐ＜００ｌ，３）Ｐ＜００５，ＶＳ ｍｏｄｅｌ ｇｒｏｕｐ ．．．中国药学杂志２０１５年４月第５Ｏ卷第８期 Ｃｈｉｎ｜Ｐ＾口ｍ Ｊ．２０１５ ａｐｒ／１．Ｖｏ１．５０ Ｎｏ．８ 的痴呆大鼠学习记忆能力具有明显的改善作用，表 明红花黄色素可能降低了脑组织中的氧化应激水 平，从而对缺血脑起到保护作用 。现代医学研究 证明，赤芍、川芎、桃仁均有抗血小板凝集，抗血栓形 成，扩张血管，增加器官血流量的功效。 本课题组前期研究已经发现ＴＱＨＸＤ可以提高 ＶＤ大鼠海马组织乙酰胆碱的含量，改善形态异常 的海马ＣＡ１区的锥体细胞¨ ，降低ＶＤ大鼠海马组 织丙二醛（ＭＤＡ）的含量及提高自由基清除剂如超 氧化物歧化酶（ＳＯＤ）的含量 ，从而对痴呆大鼠起 到良好的治疗效果。故本次实验在前期研究基础上 进一步探究ＴＱＨＸＤ在治疗ＶＤ时对于海马神经元 细胞内钙离子浓度的影响。 ｃａ 作为细胞内重要的第二信使，参与神经 细胞中重要生理活动。Ｃａ 浓度升降对调节细胞 活动起着决定性作用，并且存在两面性。一方面， 在生理浓度范围内Ｃａ¨的升高，可通过激活Ｃａ¨． ＣａＭ—ＣａＭＫＩＩ—ＣＲＥＢ信号转导通路，可促进学习记 忆的形成¨ 。另一方面在长期低灌注的情况下， 由于在长期低灌注后脑组织中ＡＴＰ酶活性降低使 维持脑组织中细胞内离子浓度Ｎａ ．Ｋ ．ＡＴＰ酶和 Ｃａ¨．ＡＴＰ酶活性降低，从而造成钙超载。钙超载 使脑部神经元发生不同程度的损伤或丢失，逐步 引起认知功能损害，导致痴呆。与此同时多种异 常的酶促反应因此而激发，产生如膜降解、线粒体 功能失调、自由基的形成、炎症反应及激活内源性 核酸内切酶使ＤＮＡ链降解和凋亡等有害过程，介 导不可逆性细胞死亡¨ 。由上述可知，慢性脑缺 血和脑部低灌注引起的Ｃａ 超载是造成ＶＤ病情 的原因之一。 本次实验在给予ＴＱＨＸＤ之后，大鼠的学习记 忆明显改善，海马神经元细胞内钙离子Ｃａ“荧光强 度下降明显。其可能的原因是麝香可以透过血脑屏 障，对脑损伤有较好的保护作用；赤芍、川穹，红花的 活血化瘀，扩血管增加脑灌注作用，加之红花中红花 黄素的ｃａ“的拮抗作用¨ ，３种因素共同影响下提 高脑组织能量供应恢复Ｎａ ．Ｋ 一ＡＴＰ酶和Ｃａ¨ ＡＴＰ酶活性，改善细胞内Ｃａ 向胞外转运，减轻其 对神经的损伤作用有关。 本实验表明，ＴＱＨＸＤ可明显改善拟ＶＤ大鼠的 学习记忆能力，降低海马组织细胞中Ｃａｎ的含量， 并且有一定的剂量依赖性。并从另一方面证实神经 元细胞内Ｃａ 离子浓度的改变在ＶＤ发病及治疗过 程中起着重要的作用。 中国药学杂志２０１５年４月第５０卷第８期 ＲＥＦＥＲＥＮＣＥＳ ［１］ＣＨＥＮ Ｊ Ｔ，ＬＩＮ Ｙ．Ｄｅｍｅｎｔｉａ Ｔｈｅｒａｐｙ（痴呆治疗）［Ｍ］．Ｂｅｉｊｉｎｇ： Ｐｅｏｐｌｅ ｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｈｏｕｓｅ，２００２：１３９．１４４． ［２］ＨＵＡＮＧ Ｗ．Ｔｈｅ ｐｒｏｇｒｅｓｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｄｅｍｅｎ— ｔ－ａ［Ｊ］．Ｇｕｉｄｅ Ｃｈｉｎａ Ｍｅｄ（中国医药指南），２０１２，１０（５）：６２－ ６４． ［３］ ＷＡＮＧ Ｎ，ＤＥＮＧ Ｙ，ＨＥ Ｑ，ｅｔ ａ１．Ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｓｅ－ Ｆｉｌｍ ｗｉｔｈ Ｔｏｎｇ ｑｉａｏ Ｈｕｏｘｕｅ ｄｅｃｏｃｔｉｏｎ（ＴＱＨＸＤ）ａｇａｉｎｓｔ ｇｌｕｔａ— ｍａｔｅ．ｉｎｄｕｃｅｄ ｎｅｕｍｔｏｘｉｅｉｔｙ ｉｎ ＰＣ１２ ｃｅｌｌｓ『Ｊ］．Ｃｈｉｎａ Ｊ Ｃｈｉｒ￣Ｍａｔｅｒ Ｍｅｄ（中国中药杂志），２０１０，３５（１０）：１３０７．１３１０． 『４］ ＷＵ ｚ Ｆ，ＧＡＯ Ｘ Ｐ，ＬＩ Ｇ Ｗ．Ａ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆｍｏｄｉｆｉｅｄ ｂｉｌａｔｅｒａｌ ｃｏｍｍｏｎ ｃａｒｏｔｉｄ ａｒｔｅｒｉｅｓ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｗｉｔｈ ｓｔａｎｄａｒｄ ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｉｎｇ ｒａｔｓ ｃｈｒｏｎｉｃ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｈｙｐｏｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｍｏｄｅｌｓ［Ｊ］．Ｃｈｉｎ ＪＲｅｈａｂｉｌＭｅｄ（中国康复医学杂志），２０１２，２７（３）：２０６－２１０． ５ １ ＺＨＥＮＧ Ｘ Ｚ，ＭＡ Ｇ Ｙ，ＬＩＮＧ Ｊ Ｌ＿Ｅ雎ｃｔｓ ｏｆ ｎａｌｏｘｏｎｅ ｏｎ ｌｅａｍｉｎｇ ａｎｄ ｍｅｍｏｒｙ ａｂｉｌｉｔｉｅｓ ｔｏｇｅｔｈｅｒ ｗｉｔｈ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｐｐｅｃａｍｐａｌ ［ｃａ ］ｉｎ ｒａｔｓ ｗｉｔｈ ｖａｓｃｕｌａｒ ｄｅｍｅｎｔｉａ［Ｊ］．Ｃｈｉｎ ＪＮｅｗＤｒｕｇｓ Ｃｌｉｎ Ｒｅｍ（中国新药与『临床杂志），２０Ｏ５，２４（３）：１８５—１８８． ［６］ＷＡＮＧＸ Ｐ，ＧＵＯ Ｄ Ｊ，ＣＨＥＮＧ Ｙ，ｅｔ ａ１．Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ ｌｅａｒｎｉｎｇ ａｎｄ ｍｅｍｏｒｙ ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｄｅｍｅｎｔｉａ ｒａｔｓ ｕｓｉｎｇ Ｍｏｒｒｉｓ ｗａｔｅｒ ｍａｚｅ［Ｊ］．Ｃｈｉｎ Ａｒｃｈ Ｔｒａｄｉｔ Ｃｈｉｎ Ｍｅｄ（中华中医药学刊），２０１３， ３１（１）：９９－１００． 『７ １ ＷＡＮＧ Ｈ．ＺＨＡＮＧ Ｘ Ｇ．Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｘｉｎｇｎａｏｑｉｚｈｉ Ｐｉｌｌ ｏｎ ｔｈｅ ｍｅｍｏｒｙ ａｎｄ ｌｅａｒｎｉｎｇ ａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｔｈｅ ｃａｌｃｉｕｍ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｂｒａｉｎ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｄｅｍｅｎｔｉａ ｒａｔｓ ｌＪ】．Ｓｈａａｎｘｉ Ｊ Ｔｒａｄｉｔ Ｃｈｉｎ Ｍｅｄ （陕西中医），２０１２，３３（１Ｏ）：１４２１ １４２３． 『８］ ＯＬＳＳＯＮ Ｙ，ＢＲＵＮ Ａ，ＥＮＧＩＵＵＮＤ Ｅ．Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｌｅｓｉｏｎｓ ｉｎ ｖａｓｃｕｌａｒ ｄｅｍｅｎｔｉａ［Ｊ］．Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｌ Ｓｃａｎｄ Ｓｕｐｐｌ， １９９６．１６８（１）：３１．３８． ［９］ ＺＨＯＵ Ｑ Ｇ，ＬＩ Ｊ，ＳＨＵ Ｘ Ｙ，ｅｔ ａ１．Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｃｏｍｐｏｕｎｄ ｙｉｓｈｅｎ ｙａｎｇｎａｏ ｃａｐｓｕｌｅ ｏｎ ｍｕｌｔｉ－ｉｎｆａｒｃｔ ｄｅｍｅｎｔｉａ ｒａｔｓ［Ｊ］．Ｃｈｉｎ Ｊ Ｅｘｐｅｒ Ｔｒａｄｉｔ Ｍｅｄ Ｆｏｒｍ（中国实验方剂学杂志），２０１４，２０（４）：１０８－ｌｌＯ． ｆ １Ｏ１ ＢＵＲＤＡ Ｊ，ＭＡＴＩＡＳＯＶＡ Ｍ，ＧＯＴＴＬＩＢＥ Ｍ，ｓｔ ａ１．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ａ ｒｏｌｅ ｏｆ ｓｅｃｏｎｄ ｐａｔｈｏ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｔｒｅｓｓ ｉｎ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｄｅｌａｙｅｄ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｄｅａｔｈ ｉｎ ｔｈｅ ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ＣＡ１ ｒｅｇｉｏｎ［Ｊ］．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ Ｒｅｓ．２００５，３０（１１）：１３９７ １４０５． ［１ １］ ＦＡＮＧ Ｓ．Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ－ｒｅｌａｔｅｄ ｓｐａｔｉａｌ ｌｅａｒｎｉｎｇ ａｎｄ ｍｅｍｏｒｙ ｉｎ Ｍｏｒｒｉｓ ｗａｔｅｒ ｍａｚｅ『Ｊ］． Ｊ Ｐａｔｈｏｌ Ｃｌｉｎ Ｍｅｄ（国际病理学与临床杂志），２０１０，３０（４）：３２１－３２５． 『１２］ ＳＵＮ Ｒ，ＺＨＡＮＧ Ｚ Ｐ，ＨＵＡＮＧ Ｗ，ｅｔ ａ１．Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｍｕｓｋｏｎｅ ｏｎ ｒａｔｓ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ『Ｊ］．Ｔｒａｄｉｔ Ｃｈｉｎ Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ（中药新药与临床药理杂志），２００９， ２Ｏ（３）：１９７＿２０ｏ． 『１３］ＸＵ Ｈ，ＭＡ Ｑ，ＷＡＮＧ Ｚ Ｘ，ｅｔ ｏ１．Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｓａｆｆｏｗｅｒ ｙｅｌｌｏｗ ｏｎ ｌｅａｒｎ． ｉｎｇ ａｎｄ ｍｅｍｏｒｙ ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔｓ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｄｅｍｅｎｔｉａ ｉｎ ｒａｔｓｌ Ｊ １．Ｃｈｉｎ Ｐ地ｍ Ｊ（中国药学杂志），０２１４，４９（１２）：ｌｏ３２．１０３５． 『１４］ ＧＥ Ｃ Ｌ．ＷＡＮＧ Ｎ．Ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ａｅｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＴＱＨＸＤ ｏｎ ｔｈｅ ｌｅａｒｎｉｎｇ ａｎｄ ｍｅｍｏｒｙ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｄｅｍｅｎｔｉａ ｉｎ ｒａｔｓ［Ｊ］．Ｃｈｉｎ Ｐｈａｒｍ．，（中国 药学杂志），２０１２，４７（８）：５９０－５９４． １ １５ ＷＡＮＧ Ｎ，ＬＩＵ Ｑ Ｙ，ＰＥＮＧ Ｄ Ｙ，ｅｔ ａ１．Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ａｎｄ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｔｏｎｇｑｉａｏ ｈｕｏｘｕｔａｎｇ ｉｎ ｒａｔｓ ｏｆ ｃｅｒｅｂｒａｌ ［Ｊ］．Ｃｈｉｎ Ｊ，凡厂Ｔｒａｄｉｔ Ｃｈｉｎ Ｍｅｄ（中国中医药信息杂志）， ２００４，ｌｌ（５）：４０７－４０９． 『１６］ＤＯＮＧ Ｙ Ｍ．ＦＥＮＧ Ｇ．ＳＨＵ Ｚ，ｅｔ ａ１．Ｔｈｅ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃａ“／ ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ／ＣａＭＫＩＬ／ＣａＶ１．２ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅ ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ｖａｓｃｕｌｒａ ｄｅｍｅｎｔｉａ［Ｊ］．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｌｅｔ， ２０１３，２（１）：１－６． ［１７］ ＶＡＮＮＵＣＣＩ Ｒ Ｃ，ＢＲＵＣＫＬ Ａ Ｒ Ｍ，ＶＡＮＮＵＣＣＩ Ｓ Ｊ．ＩｎｔｒａｅｅＵｕｌａｒ ｃａｌｃｉｕｍ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｈｙｐｏｘｉｃ－ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｂｒａｉｎ ｄａｍａｇｅ ｉｎ ｔｈｅ ｉｍｍａｔｕｒｅ ｒａｔＩ Ｊ Ｉ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ Ｄｅｖ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ， ２００１，１２６（１）：ｌ】７－１２０． ［１８］ＰＥＩ Ｙ Ｎ．Ｔｈ。ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｓａｆ－ ｆｌｏｗｅｒ［Ｊ］．Ｌｉｓｈｉｚｈｅｎ Ｍｅｄ Ｍａｔｅｒ Ｍｅｄ Ｒｅｓ（时珍国医国药）， ２００５，１６（２）：１４４—１４６． （收稿日期：２０１４－０７－１３） Ｃｈｉｎ ０ Ｊ．２０１５ ａｐｒ／１．Ｖｏ１．５０Ｎｏ．８ ・６７５・