一种使用混合吸附色谱分离纯化贻贝粘蛋白的方法[发明专利]

[12]发明专利申请公布说明书

[21]申请号200710179491.0

[51]Int.CI.

C07K 1/36 (2006.01)C07K 1/34 (2006.01)C07K 4/12 (2006.01)C07K 14/44 (2006.01)

[43]公开日2009年1月21日[22]申请日2007.12.14[21]申请号200710179491.0

[71]申请人北京康铭优盛生化技术有限公司

地址100086北京市海淀区中关村南大街甲6号

铸诚大厦615室[72]发明人孟桂凤 邢思亮

[11]公开号CN 101348520A

权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 1 页

[]发明名称

一种使用混合吸附色谱分离纯化贻贝粘蛋白的方法[57]摘要

本发明涉及一种使用混合吸附色谱分离纯化贻贝粘蛋白的方法。贻贝粘蛋白中含有L－3，4－二羟基苯丙氨酸(L－DOPA)基团，其酚羟基可作为氢键供体，其苯环可形成疏水作用，其赖氨酸带有强正电荷可形成静电键。利用贻贝粘蛋白的上述性质，采用混合吸附色谱，即氢键吸附、疏水吸附、静电吸附三种原理的吸附色谱，提供一种高选择性、高收率的贻贝粘蛋白分离纯化方法，克服使用传统方法分离纯化贻贝粘蛋白收率低的问题。采用强酸提取，以脱盐柱去除小分子化合物，利用高浓度、高交联度琼脂糖介质分离纯化贻贝粘蛋白，采用乙酸－尿素－聚丙烯酰胺凝胶电泳，通过四氮唑蓝特异性显色鉴别贻贝粘蛋白。在一种分离介质上利用三种原理分离贻贝粘蛋白，形成了高选择性，简化了纯化工艺，降低了生产成本。

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权 利 要 求 书

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1、一种使用混合吸附色谱分离纯化贻贝粘蛋白的方法，采用高浓度、高交联度琼脂糖凝胶分离介质，以混合吸附色谱，即氢键吸附、疏水吸附、静电吸附三种原理的吸附色谱，提供一种高选择性、高收率的贻贝粘蛋白分离纯化方法。 2、如权利要求1所述的使用混合吸附色谱分离纯化贻贝粘蛋白的方法，包括如下的步骤：

1)以0.5-2.5％高氯酸或/和1-10％乙酸为提取溶剂，100g贻贝足丝加300-1000ml提取溶剂，10-25℃浸提10-20min，使用搅拌器将冷冻的贻贝足丝高速打碎使其均匀悬浮于提取溶剂中；

2)以10000-16000r/min离心30-50min或以45μm滤膜过滤去除残渣，保留上清；

3)用Sephadex G-25或G-50去除小分子化合物，流动相为pH 2.0-6.0的10-80mM的醋酸钠缓冲液，添加0.1-0.6M氯化钠，收集穿透峰； 4)以Millipore CENTRIPLUS超滤膜浓缩馏分；

5)采用高浓度、高交联度琼脂糖介质，发挥该介质与贻贝粘蛋白间的氢键吸附、疏水吸附、静电吸附三种原理的吸附作用分离目标蛋白，可使用的商品介质包括：Superose 12、Superose 12pg，色谱柱体积50ml；混合吸附色谱的洗脱液包括0.1-0.7M氯化钠；混合吸附色谱的洗脱液包括有机酸，采用线性梯度洗脱：0-300ml，三氟乙酸0.02-2％；或者0-300ml，乙酸0-20％； 6)以Millipore CENTRIPLUS超滤膜浓缩馏分； 7)用0.5-3％的柠檬酸4℃透析，4℃保存；

8)从分子量的角度鉴定贻贝粘蛋白：采用12-20％浓度十二烷基磺酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，银染色，10-25℃染色2-4h，以高分子量标准蛋白质标记，确认目标蛋白质分子量为130kD；

9)四氮唑蓝(NBT)特异性染色：采用12-20％浓度乙酸-尿素(Acetic acid-Urea)聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native PAGE)，染色液采用NBT-氨基乙酸溶液(pH10)，10-25℃染色1-3h，贻贝粘蛋白将被特异性显色。

10)用C8反相键合相硅胶色谱柱分析贻贝粘蛋白纯度：C8色谱柱4.6×250mm，5μm，

以乙腈-水(15∶85)为流动相等度洗脱，280nm检测。

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说 明 书

一种使用混合吸附色谱分离纯化贻贝粘蛋白的方法

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技术领域

本发明涉及一种分离纯化蛋白质的方法，具体地是涉及一种使用混合吸附色谱分离纯化贻贝粘蛋白的方法。背景技术

贻贝粘蛋白(Mussel adhesive protein，MAP)，也叫紫贻贝足丝蛋白(Mytilus edulisfoot protein，Mefp)来自海洋贝类紫贻贝，Mytilus edulis，它有在近海耐受波浪影响的能力，它在特殊腺体内生成和储存一种蛋白胶，通过足丝释放到岩石一类的固体表面上，形成抗水的结合，从而将自己固定。在玻璃上的研究显示，蛋白胶形成了斑，从斑延伸开，有很强的抗张强度(10-10newton·meter)，而斑内物质包含了贻贝粘蛋白MAP。

贻贝粘蛋白含有L-3，4-二羟基苯丙氨酸(L-DOPA)，它由酪氨酸酶对酪氨酸残基的作用形成。L-DOPA残基由于氧化反应而相互交联，交联反应导致了贻贝和特殊表面纤维内强而持久的胶接，其生物粘附的机理很有趣。贻贝粘蛋白粘附对人没有毒性和免疫原性，结合能力和寿命不受水的影响，作为医用手术尤其是眼科手术胶已经引起注意。

全世界每年进行1100万例白内障手术，我国白内障的发病率非常高，50岁以上人群中白内障发病率29.％，70岁以上人群发病率高达60％。随着社会老龄化的加剧，这一数字还会上升。目前医生可以用两种闭和方式结束眼科手术：让伤口自行愈合或是用尼龙线缝合切口，每种闭合方法都各有缺点：自愈有感染和眼内液体泄露的危险；缝合会有感染发炎及血管发育异常的危险。而贻贝粘蛋白贻贝粘蛋白能在低浓度下交联，并形成可注射到不规则形状部位的低粘性液体，这种溶液可凝固而填充到指定空间，在几分钟内可封闭切口，少于缝合所需时间。贻贝粘蛋白还形成了一个不可破坏的封条，在大于正常人眼压12倍的压力下不会使眼内液体发生泄露。贻贝粘蛋白具有和眼角膜近似的折射率，不会干扰光线到达视网膜。

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另外，贻贝粘蛋白的生物降解性质使其对环境很友好，也可用于其他领域，如通用的生化粘接试剂、医用组织粘接及密封剂，医用愈伤基质，牙医粘接和密封剂，医用设备表面涂层试剂，水下作业设备涂层等。

贻贝粘蛋白中L-DOPA含量高于11％，富含多酚基团，被认为是多酚蛋白质，它适宜作为氢键色谱吸附剂的理想纯化目标，这种高选择性的反应使从紫贻贝足丝粗提取物中一步纯化贻贝粘蛋白蛋白质成为可能。

贻贝粘蛋白纯化通常将以下技术组合应用：提取、盐析、示差沉淀、离子交换色谱、疏水相互作用色谱、反相色谱、亲和色谱和分子排阻色谱，但活性蛋白质收率低仅为15％。工艺复杂，规模制备成本高、周期长，对pH值和盐浓度敏感而导致稳定性难控制，有必要研究新的色谱方法获取高纯度、高活性的贻贝粘蛋白。 贻贝粘蛋白由于L-3，4-二羟基苯丙氨酸(L-DOPA)的含量高达11％而富含多酚基团被认为是多酚蛋白质。L-DOPA在胶纤维形成过程中的反应性暴露在表面，其酚羟基是氢键供体，可使用包含适当氢键受体的吸附剂的氢键色谱进行分离；其苯环结构可形成疏水键，可利用疏水相互作用进行分离；赖氨酸氨基的正电荷，可形成静电键。可利用贻贝粘蛋白结构中的这些特点，以上述氢键吸附、疏水作用、静电吸附三种原理进行分离。

蛋白质这类生物药物或生物医学材料的分离纯化主要通过色谱技术及其组合，所用介质材料主要是凝胶过滤、离子交换、疏水相互作用、亲和、反相介质，其基质材料有琼脂糖、葡聚糖、聚苯乙烯和硅胶等。琼脂糖介质是目前生物医药研发和生产中使用最为普遍的规模制备用分离介质，该基质具有高孔度(90-96％)，即使在高浓度下也能保持高的孔度；具有连接纤维的开放的结构；高的连通性有效保证了分子内物质传递；大比表面积可提供了很高的吸附能力易制备成不同琼脂糖浓度、不同尺寸的球形颗粒以满足不同领域的需求；在氢氧化钠中稳定可满足苛刻的在位清洗步骤；低的非特异性吸附使应用面较广；具有弹性及非脆性(较易实现柱子的再装填)又可通过足够的交联步骤使介质具有刚性(有较高的耐压性能)；可用不同的活化步骤进行共价交联而活化，可被大量配基取代而应用于多种吸附色谱技术。本发明所涉及分离纯化的核心技术采用琼脂糖基质介质。 发明内容

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本发明的目的在于克服使用传统方法纯化贻贝粘蛋白收率低的问题，采用混合吸附色谱，即氢键吸附、疏水吸附、静电吸附三种原理的吸附色谱，提供一种高选择性、高收率的贻贝粘蛋白分离纯化方法，简化工艺，降低成本。 本发明的目的是通过如下的技术方案实现的。

本发明提供的使用以混合吸附色谱为核心的分离纯化贻贝粘蛋白的方法，包括如下步骤：

1)以0.5-2.5％高氯酸或/和1-10％乙酸为提取溶剂，100g贻贝足丝加300-1000ml提取溶剂，10-25℃浸提10-20min，使用搅拌器将冷冻的贻贝足丝高速打碎使其均匀悬浮于提取溶剂中；

2)以10000-16000r/min离心30-50min或以45μm滤膜过滤去除残渣，保留上清；

3)用Sephadex G-25或G-50去除小分子化合物，流动相为pH 2.0-6.0的10-80mM的醋酸钠缓冲液，添加0.1-0.6M氯化钠，收集穿透峰； 4)以Millipore CENTRIPLUS超滤膜浓缩馏分；

5)采用高浓度、高交联度琼脂糖介质，分离目标蛋白，可使用的商品介质包括：Superose 12、Superose 12pg，色谱柱体积50ml；混合吸附色谱的洗脱液包括0.1-0.7M氯化钠；混合吸附色谱的洗脱液包括有机酸，采用线性梯度洗脱：0-300ml，三氟乙酸0.02-2％；或者0-300ml，乙酸0-20％； 6)以Millipore CENTRIPLUS超滤膜浓缩馏分； 7)用0.5-3％的柠檬酸4℃透析，4℃保存；

8)从分子量的角度鉴定贻贝粘蛋白：采用12-20％浓度十二烷基磺酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，银染色，10-25℃染色2-4h，以高分子量标准蛋白质标记，确认目标蛋白质分子量为130kD；

9)四氮唑蓝(NBT)特异性染色鉴定贻贝粘蛋白：采用12-20％浓度乙酸-尿素(Acetic acid-Urea)聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native PAGE)，染色液采用四氮唑蓝-氨基乙酸溶液(pH10)，10-25℃染色1-3h，贻贝粘蛋白将被特异性显色。

10)用C8反相键合相硅胶色谱柱分析贻贝粘蛋白纯度：C8色谱柱4.6×250mm，5μm，

以乙腈-水为流动相等度洗脱，280nm检测。

本发明提供的使用以混合吸附色谱为核心的分离纯化贻贝粘蛋白的方法，该法首次将基于高浓度、高交联度琼脂糖基质介质的氢键吸附、疏水吸附、静电吸附三种原

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理的混合吸附色谱用于贻贝粘蛋白这类多酚蛋白质的分离纯化，选择性高，工艺简单，蛋白质收率高。附图说明

图1为实施例1采用Superose 12介质混合吸附色谱分离贻贝粘蛋白，使用紫外检测器280nm进行在线检测的色谱图。

图2为实施例2采用Superose 12pg介质混合吸附色谱分离贻贝粘蛋白，使用紫外检测器280nm进行在线检测的色谱图。 具体实施方式

实施例1、采用Superose 12介质混合吸附色谱分离贻贝粘蛋白

1)以0.5％高氯酸和2％乙酸为提取溶剂，100g贻贝足丝加400ml提取溶剂，18℃浸提12min，使用搅拌器将冷冻的贻贝足丝高速打碎使其均匀悬浮于提取溶剂中；

2)以12000r/min离心35min，保留上清；

3)用Sephadex G-50去除小分子化合物，流动相为pH 2.5的20mM的醋酸钠缓冲液，添加0.15M氯化钠，收集穿透峰；

4)以Millipore CENTRIPLUS超滤膜浓缩馏分；

5)Superose 12，柱体积50ml，洗脱液包括0.15M氯化钠，0-300ml，三氟乙酸0.02-2％进行梯度洗脱；

6)以Millipore CENTRIPLUS超滤膜浓缩馏分； 7)用1％的柠檬酸4℃透析，4℃保存；

8)从分子量的角度鉴定贻贝粘蛋白：采用18％浓度十二烷基磺酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，银染色，15℃染色2h，以高分子量标准蛋白质标记，确认目标蛋白质分子量为130kD；

9)四氮唑蓝(NBT)特异性染色鉴定贻贝粘蛋白：采用15％浓度乙酸-尿素(Aceticacid-Urea)聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native PAGE)，染色液采用四氮唑蓝-氨基乙酸溶液(pH10)，15℃染色2h，贻贝粘蛋白将被特异性显色。

10)用C8反相键合相硅胶色谱柱分析贻贝粘蛋白纯度：C8色谱柱4.6×250mm，5μm，

以乙腈-水(15∶85)为流动相等度洗脱，280nm检测；

得到95％纯度的贻贝粘蛋白。

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实施例2、采用Superose 12pg介质混合吸附色谱分离贻贝粘蛋白 1)以1％高氯酸为提取溶剂，100g贻贝足丝加300ml提取溶剂，15℃浸提15min，使用搅拌器将冷冻的贻贝足丝高速打碎使其均匀悬浮于提取溶剂中； 2)以45μm滤膜过滤去除残渣，保留上清；

3)用Sephadex G-25去除小分子化合物，流动相为pH 3.0的30mM的醋酸钠缓冲液，添加0.2M氯化钠，收集穿透峰；

4)以Millipore CENTRIPLUS超滤膜浓缩馏分；

5)采用Superose 12pg，柱体积50ml，洗脱液包括0.2M氯化钠，0-300ml，乙酸0-20％梯度洗脱；

6)以Millipore CENTRIPLUS超滤膜浓缩馏分； 7)用3％的柠檬酸4℃透析，4℃保存；

8)从分子量的角度鉴定贻贝粘蛋白：采用15％浓度十二烷基磺酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，银染色，20℃染色2h，以高分子量标准蛋白质标记，确认目标蛋白质分子量为130kD；

9)四氮唑蓝(NBT)特异性染色鉴定贻贝粘蛋白：采用12.5％浓度乙酸-尿素(Acetic acid-Urea)聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native PAGE)，染色液采用四氮唑蓝-氨基乙酸溶液(pH10)，20℃染色1.5h，贻贝粘蛋白将被特异性显色。

10)用C8反相键合相硅胶色谱柱分析贻贝粘蛋白纯度：C8色谱柱4.6×250mm，5μm，

以乙腈-水(15∶85)为流动相等度洗脱，280nm检测；

得到92％纯度的贻贝粘蛋白。

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说 明 书 附 图

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图1

图2

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