十一碳烯酰基苯丙氨酸的合成及其抑制酪氨酸酶二酚酶活性的研究

徐凯;许虎君

【摘 要】以十一烯酸和苯丙氨酸为原料,使用氯化亚砜将十一烯酸酰氯化,采用肖顿-鲍曼法(Schotten-Baumann)缩合反应合成了十一碳烯酰基苯丙氨酸钠,再经酸化分离后得到了十一碳烯酰基苯丙氨酸.利用IR,MS和1H NMR对合成产物的结构进行了表征,同时考察了十一碳烯酰基苯丙氨酸对酪氨酸酶二酚酶活性抑制的机制.结果表明,十一碳烯酰基苯丙氨酸对酪氨酸酶二酚酶活性的抑制作用为竞争性可逆抑制,其半抑制浓度为3.711 g/L,抑制常数(Ki)为3.651 g/L.

【期刊名称】《日用化学工业》

【年(卷),期】2016(046)010

【总页数】5页(P591-595)

【关键词】美白化妆品添加剂;十一碳烯酰基苯丙氨酸;酪氨酸酶抑制剂;竞争性可逆抑制

【作 者】徐凯;许虎君

【作者单位】江南大学化工与材料工程学院,江苏 无锡 214122;江南大学化工与材料

工程学院,江苏 无锡 214122

【正文语种】中 文

【中图分类】TQ658

尽管黑色素可以抵御紫外线的辐射，但是异常的黑色素堆积会引起黄褐斑、雀斑等皮肤病，且影响美观[1，2]。酪氨酸酶抑制剂能够抑制黑色素的合成，并且能够减少色素沉着[3，4]，在化妆品、医药、食品等行业有着广泛的应用[5-7]。大多数酪氨酸酶抑制剂可以从天然植物中提取或合成得到，但它们大多都存在着安全问题。目前常见的酪氨酸酶抑制剂有对苯二酚、抗坏血酸衍生物、壬二酸、维A酸类、熊果苷、曲酸等。其中对苯二酚和曲酸被认为是有害的药物，因为它们会产生细胞毒性、皮肤癌和皮炎等不良的副作用；熊果苷分解会产生对苯二酚；壬二酸因其熔点高、水溶性差的天然缺陷了其使用范围。因此，研发安全有效的美白剂是非常必要的。

十一碳烯酰基苯丙氨酸有着与上述美白剂完全不同的结构，它与黑色素细胞刺激素(α-MSH)的结构相似，能控制α-MSH与黑色素生成因子的结合，进而阻断黑色素形成的过程，从多个环节全面抑制黑色素生成，效果更加明显、持久且安全可靠，可用于治疗皮肤疾病相关的皮肤色素沉着[8]。目前工业上生产氨基酸型的表面活性剂都是用丙酮/水混合溶剂，但是以丙酮作为溶剂会导致最终的产品颜色偏黄，且丙酮的沸点低，在工业生产上安全性差。本文以十一烯酸和苯丙氨酸为原料，以安全性较高的乙醇/水混合溶剂合成一种酪氨酸酶抑制剂十一碳烯酰基苯丙氨酸，并对其结构进行表征，同时采用体外抑制酪氨酸酶二酚酶活性实验对其美白活性及抑制机制进行研究。

1.1 主要试剂与仪器

十一烯酸(AR)、氯化亚砜(AR)、苯丙氨酸(AR)、无水乙醇(AR)、甲醇(色谱纯)，国药集团化学试剂有限公司；氘代二甲基亚砜(DMSO，w>99.8%)、四甲基硅烷(TMS，w=0.03%)，阿达玛斯试剂有限公司；酪氨酸酶、L-多巴，上海宝曼生物科技有限公司；去离子水，实验室自制。Nicolet 6700全反射傅里叶红外光谱仪，美国赛默飞世尔科技有限公司；1525高压液相色谱仪、MALDI SYNAPT MS液相色谱四极杆飞行时间串联质谱联用仪，美国Waters公司；AVANCE Ⅲ HD 400 MHz核磁共振谱仪，瑞士布鲁克公司；Synergy H4多功能酶标仪，美国伯腾仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 十一碳烯酰基苯丙氨酸的合成

本文采用肖顿-鲍曼法(Schotten-Banmann)缩合反应[9]合成十一碳烯酰基苯丙氨酸，即由脂肪酰氯和苯丙氨酸在碱性水溶液或其他有机溶剂中一次完成制得十一碳烯酰基苯丙氨酸盐，然后经无机酸中和分离得到十一碳烯酰基苯丙氨酸。

称取适量的十一烯酸放入四颈烧瓶中，开动搅拌器并加热升温至40 ℃后滴加足量的氯化亚砜，加料时间1 h左右。加料完成后，升温至80 ℃，继续反应4 h，反应生成的HCl和SO2气体经导管引出，经过2个分别装有水和质量分数为15%的氢氧化钠溶液气体吸收瓶，回收HCl和SO2气体，最后经水抽泵导入水池。反应结束后，将未反应的氯化亚砜蒸出去，然后减压蒸馏，切取合适馏分。

称取适量的乙醇/水混合溶剂来溶解苯丙氨酸和氢氧化钠，将溶解后的苯丙氨酸钠溶液倒入装有机械搅拌器的四颈烧瓶中，在充分搅拌的情况下，2只滴液漏斗中同时分别向其中滴加十一烯酸酰氯和质量分数为15%的氢氧化钠水溶液，调节pH=9～10，30 min内滴完十一烯酸酰氯，继续搅拌，反应时间为2.5 h，控制反应温度为25 ℃。反应完毕后，旋蒸除去有机溶剂，再用质量分数为15%的稀盐酸酸化至pH=1～2，酸化后出现大量白色固体，直接减压抽滤，然后用40 ℃温水洗涤至中性，之后烘干即可。采用IR，MS和 1H NMR对最终产物进行表征。

1.2.2 酪氨酸酶二酚酶活性和抑制率的测定

酪氨酸酶活力的测定是以L-多巴为底物的酶催化氧化产物多巴色素在475 nm处有最大吸收(消光系数ε=3 700 L/(mol·cm))来测定[10]。酪氨酸酶活力的定义：以每分钟多巴色素在475 nm处的吸光度(A475)增加0.001为一个酶活力单位，即1 U/min。因此，通过测定酶催化反应体系A475随时间增长的直线斜率可以求得酶活力[11]。

酪氨酸酶二酚酶活力的测定：将十一碳烯酰基苯丙氨酸用三乙醇胺中和，配成质量浓度分别为0.2，0.5，2，5，8，10，12，15，20和25 g/L的水溶液；在pH=6.8的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液体系中，以L-多巴为底物，加入不同质量浓度的十一碳烯酰基苯丙氨酸三乙醇胺溶液，在25 ℃下恒温孵育10 min，加入酪氨酸酶水溶液后迅速测定其A475。测活体系中，L-多巴终浓度为1.0 mmol/L，酶的终质量浓度为6.25 mg/L。

按下式计算十一碳烯酰基苯丙氨酸对酪氨酸酶二酚酶活性的抑制率，以此评价其美白

功效。

抑制率

式中A1为含有底物，不含酪氨酸酶和十一碳烯酰基苯丙氨酸的测活体系的吸光度值；A2为含有酪氨酸酶和底物，不含十一碳烯酰基苯丙氨酸的测活体系的吸光度值；A3为含有底物和十一碳烯酰基苯丙氨酸，不含酪氨酸酶的测活体系的吸光度值；A4为含有酪氨酸酶、底物和十一碳烯酰基苯丙氨酸的测活体系的吸光度值。

2.1 结构表征

十一碳烯酰基苯丙氨酸的IR谱图见图1。由图1可知，3 302 cm-1处是N-H伸缩振动吸收峰；2 924和2 850 cm-1处是C-H伸缩振动吸收峰；1 707 cm-1处是C=O的伸缩振动吸收峰；1 1 cm-1 处是C=C双键和酰胺键的伸缩振动吸收峰；1 533 cm-1处是苯环的伸缩振动吸收峰；1 247 cm-1处是C-N键的伸缩振动吸收峰；910 cm-1 处是O-H键弯曲振动吸收峰；750和698 cm-1处是苯环面外弯曲振动吸收峰，说明是单取代。

十一碳烯酰基苯丙氨酸的MS谱图如图2所示。由图2可知，m/z=166为苯丙氨酸季铵化产物的峰，m/z=167为十一碳烯酰基的峰，m/z=332为[M+H]+的峰，m/z=3为[M+Na]+的峰。

图3为十一碳烯酰基苯丙氨酸的1H NMR图。1H NMR(400 MHz，DMSO，δ)：12.55(s，1H)，8.07(d，J=8.2 Hz，1H)，7.41～6.96(m，5H)，5.80(ddt，J=16.9，

10.1和6.7 Hz，1H)，4.97(dd，J=23.7和13.7 Hz，2H)，4.43(td，J=9.5 和 4.7 Hz， 1H)， 3.06(dd，J=13.8和4.6 Hz，1H)，2.84(dd，J=13.7和10.0 Hz，1H)，2.02(dt，J=11.4和7.2 Hz，4H)，1.49～1.29(m，4H)，1.18(dd，J=45.7和12.8 Hz，8H)，其中l峰为氘代DMSO中的溶剂残留峰。综合以上结果可确定，反应的最终产物是十一碳烯酰基苯丙氨酸。

2.2 十一碳烯酰基苯丙氨酸对酪氨酸酶二酚酶活性的影响

图4为不同质量浓度十一碳烯酰基苯丙氨酸对酪氨酸酶二酚酶活性抑制作用催化进程曲线。由图4可以看出，酪氨酸酶二酚酶催化氧化L-多巴为通过原点的曲线，不存在迟滞效应。随着十一碳烯酰基苯丙氨酸质量浓度的增加，曲线的斜率不断降低，即二酚酶催化L-多巴氧化的速率降低，说明十一碳烯酰基苯丙氨酸对酪氨酸酶二酚酶有抑制作用。

十一碳烯酰基苯丙氨酸质量浓度对酪氨酸酶二酚酶活性抑制率的影响如图5所示。

由图5可见，酪氨酸酶二酚酶活性的抑制率和十一碳烯酰基苯丙氨酸明显存在着剂量依赖性，在低质量浓度时(0～4 g/L)抑制率随着质量浓度的升高迅速提高，随着质量浓度的继续升高，抑制率趋于平缓，当质量浓度达到15 g/L以上时，抑制率几乎不再改变，最大抑制率达到81%。经计算，十一碳烯酰基苯丙氨酸的半抑制浓度为3.711 g/L。

2.3 十一碳烯酰基苯丙氨酸对酪氨酸酶二酚酶活性抑制的可逆性判断

在不同质量浓度十一碳烯酰基苯丙氨酸存在下，酪氨酸酶二酚酶的酶活力与其质量浓度的关系见图6。由图6可以看出，由酶活力对酶质量浓度作图得到一组交于原点的直线，

随着十一碳烯酰基苯丙氨酸质量浓度的增加，直线斜率降低，这表明十一碳烯酰基苯丙氨酸对酪氨酸酶二酚酶活性的抑制作用是可逆过程[12]。十一碳烯酰基苯丙氨酸和酪氨酸酶结合导致酶活力受到了抑制，降低了催化效率，而不是降低有效酶含量导致酶活力下降[13]。

2.4 十一碳烯酰基苯丙氨酸抑制酪氨酸酶二酚酶活性的动力学分析

在测定的体系中，固定酶的质量浓度不变，改变L-多巴的质量浓度，测定不同质量浓度的十一碳烯酰基苯丙氨酸对酶活力的影响，以Lineweaver-Burk双倒数作图法判断抑制剂的抑制类型。由图7可知，所有的直线均交于纵轴上的一点，随着抑制剂浓度的增加，Km逐渐增大，Vmax则基本保持不变，这种曲线特征符合竞争性抑制的特点。Lineweaver-Burk双倒数方程可以表示为：

式中v为反应速率，g/(L·min)；vmax为最大反应速率，g/(L·min)；Km为米氏常数，mmol/L；ρ为美白剂质量浓度，g/L；cS为底物浓度，mmol/L；Ki为抑制常数，g/L。

由方程的斜率和截距可得Km与Vmax，数据列于表1。以Km值对抑制剂质量浓度进行二次作图，得到一条直线，由图中直线计算出十一碳烯酰基苯丙氨酸对酪氨酸酶二酚酶的抑制常数Ki=3.651 g/L。

以十一烯酸与苯丙氨酸为原料合成了一种新型的美白剂十一碳烯酰基苯丙氨酸，并通过IR，MS和 1H NMR 确认了最终产物的结构。抑制酪氨酸酶二酚酶活性研究发现，十

一碳烯酰基苯丙氨酸对酪氨酸酶二酚酶活性的抑制作用表现为竞争性可逆抑制，其半抑制浓度为3.711 g/L，抑制常数Ki=3.651 g/L。

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