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人参皂苷Rg3对食管癌细胞放射增敏作用的初步研究

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・886・ 临床肿瘤学杂志2014年10月第19卷第10期Chinese Clinical Oncology,Oct.2014,Vo1.19,No.10 人参皂苷Rg3对食管癌细胞放射增敏作用的初步研究 210009 南京 南京市胸科医院放射治疗科 杨玖,葛小林 ,曹远东 ,洪梅,孙新臣 ' 【摘要】 目的探讨人参皂苷Rg3(简称Rg3)对食管癌EC109细胞的放射增敏作用。方法采用四甲基偶氮唑盐比 色法观察不同浓度的Rg3(1O、2O、50、100、200、400、600mmoVL)作用EC109细胞24、48及72h的细胞存活率,克隆形成实验及 单击多靶模型计算lOmmoL/L Rg3预处理24h经0…1 3 6和9Gy X射线照射后的辐射增敏比(SER)。根据实验设计分为对照 组、单纯照射组及Rg3+照射组,流式细胞仪及Foci焦点形成实验分别检测3组经8Gy X射线照射48h的细胞凋亡率和DNA 分子损伤情况。结果在10-600mmol/L范围内,Rg3可降低EC109细胞的存活率,呈剂量和时间依赖性;10mmol/LRg3处理 EC109细胞的SER为1.28。Rg3+照射组的凋亡率为(62.33_+4.60)%,高于对照组的(6.46±1.23)%和单纯照射组的(30.68± 3.55)%,差异有统计学意义(P<0.05);Rg3+照射组的Foci焦点细胞数为(64±12)个,亦高于对照组的(6+3)个和单纯照射组 的(32_+6)个,差异有统计学意义(P<0。05)。结论Rg3对食管癌EC109细胞有放射增敏作用,能够抑制细胞活性并诱导细 胞凋亡与DNA分子损伤。 【关键词】人参皂苷Rg3;食管癌;放疗增敏;凋亡 中图分类号:R735.1 文献标识码:A 文章编号:1009-0460(2014)10—0886-05 A preliminary study on radiosensitization effect of ginsenoside Rg3 on esophageal carcinoma cells YANG Jiu,GE Xiaolin,CAO Yuandong,HONG Mei,SUN Xinchen.Department ofRadiotherapy。Nanjing Thoracic Hospital,Ⅳ口n ng 210009,China Corresponding author:SUN Xinchen,E—maif:sunxinchen@C¥C0.org.cA 【Abstract】 Objective To investigate the radiosensitivity enhancement of ginsenoside Rg3 on esophageal carcinoma EC109 cells.Methods The survival rates of EC109 cells at 24,48 and 72h after treatment with different concentrations(10,20,50,100, 200,400,600mmol/L)of Rg3 were determined by MTF in vitro.The cloning fomration assay and multi—target single—hit model were employed to calculate the sensitization enhancement ratio(SER)after pretreatment of 10 mmol/L Rg3 following irradiation of 0,1,3, 6 and 9Gy.According to the experimental protocol,the following experiments were carried out in control group,irradiation group and Rg3+irradiation group.The apoptosis rate and DNA damage were evaluated by flow cytometry and Foci focus formation assay in the 3 rgoups after 48h irradiation of 8Gy X—ray.Results The Rg3 ranging from 10 to 600mmol/L could reduce the survival rates of EC109 cells in a dose—and time—dependent manner.The SER of 10mmol/L Rg3 for EC109 ceils was 1.28.The apoptosis rate of Rg3+irradia- tion group was(62.33_+4.60)%,higher than(6.46±1.23)%of control group and(30.68_+3.55)%ofiradiation rgoup with signiif— cant difference(P<0.05).The number of Foci-positive cells in Rg3+iradiation group was 64±12.higher than 6±3 of control group and 32_+6 of irradiation group with signiifcnat difference(P<0.05).Conclusion Rg3 can exert radiosensitizing effect on esophageal carcinoma ECl09 cells,inhibite cell activity and induce cell apoptosis and DNA damage. 【Key Words】 Ginsenoside Rg3;Esophageal carcinoma;Radiosensitivity:Apoptosis 食管癌是全球第九大恶性疾病,死亡率居癌症 发病人数占全球50%以上 。中晚期食管癌预后 死亡率第6位。食管癌是我国常见的恶性肿瘤之 较差,就诊患者常常不能手术或无法行根治性手 一,目前我国是世界上食管癌死亡率最高的国家, 术。对于无法接受手术的患者,放疗是主要的治疗 1 210009南京医科大学第一附属医院放疗科 2 通讯作者,E-mail:sunxinchen@CSCO.org.ell 临床肿瘤学杂志2014年l0月第19卷第10期Chinese Clinical Oncologv,Oct.2014,Vo1.19,No.10 ・887・ 手段 J,由于放疗疗效受肿瘤细胞放射敏感性的限 育4h后,弃上清,每孔加入1501xl DMSO,低速震荡 10min使紫色结晶充分溶解后,在490nm波长下检 制,食管癌的局部控制率仍不尽如人意。目前食管 癌单纯放疗的局部复发率高达60%一80%_3 J,因此 寻找新治疗途径,提高食管癌放疗敏感性及降低局 部复发率是食管癌防治研究的重要内容之一。人 参皂甙Rg3(以下简称Rg3)是存在于人参中的一种 微量四环三萜皂甙,具有选择性抑制肿瘤细胞生 测各孔吸光值(A)。细胞存活率(%)=(实验组A/ 对照组A)X100%。 1.5克隆形成实验取对数生长期细胞制成单细 胞悬液,以200个/:E密度接种于6孔板中,细胞贴 壁后分别给予0、lOmmol/L Rg3处理,于乏氧罐中 乏氧培养24h后,分别给予0、1、3、6、9Gy 6MV-X射 线照射,每4天换液1次,当出现肉眼可见克隆时终 长、浸润和转移的药理作用 J。有关放射与Rg3联 合应用对食管癌细胞的杀伤作用,尚未见报道。本 研究旨在探讨Rg3对食管癌EC109细胞体外放射 敏感性的影响。 1材料与方法 1.1主要试剂和仪器RPMI 1640培养基购自南 京凯基生物公司,10%新生牛血清购自杭州四季青 生物公司,二甲基亚砜(DMSO)和Rg3均购自美国 Sigma公司,四甲基偶氮唑盐(MYr)购自碧云天生 物公司,4’,6’一二脒基.2.苯基吲哚(DAPI)染色试 剂盒、Giemsa染色液和羊抗鼠.FITC标记荧光二抗 购自南京凯基生物公司,Vybrant Apoptpsis Assay Kit 凋亡试剂盒购自美国Initrogen公司,抗 -H2AX兔 多克隆抗体购自美国Millipore公司,羊抗兔.FITC 二抗购自南京海普飞公司。仪器:CO:恒温培养箱 购自美国Thermo Forma公司,酶标仪购自美国Bio Rad公司,激光共聚焦显微镜购自德国Zesis公司, 流式细胞仪购自英国BD公司,医用直线加速器购 自瑞典Elekta公司。 1.2细胞培养人食管癌EC109细胞株由南京医 科大学中心实验室提供,细胞于含10%新生牛血清 的RPMI 1640培养液中培养,置于37 ̄C、5%CO 饱 和湿度培养箱中。细胞贴壁生长良好,每3天传代 1次。自制密闭低氧罐,充入含氧量小于3%的混合 气体(97%N2+3%O2)。 1.3 细胞照射条件采用医科达直线加速器,剂量 率为200cGy/min的6MV X射线照射,源皮距为 100cm,照射野面积为20cmX20cm。 1.4 MTI"比色法 取对数生长期细胞,以6x 10 个/ml接种于96孔培养板,终体积100 ̄1,待细胞贴 壁后,分别加入Rg3使终浓度为0、10、20、50、100、 200、400、600mmol/L(以0mmol/L为对照组,其余浓 度为实验组),每个浓度设6个复孔,分别培养24、 48、72h后弃去药物,并加入PBS清洗1—2遍,每孔 加入含5mg/ml的MTY 201xl,继续置于培养箱中孵 止培养,无水甲醇固定,Giemsa染色,于倒置显微镜 下计数大于50个细胞的克隆数并计算存活分数。 根据单击多靶模型SF=1一(1一e-啪。)“,用Graph Prism 5.0软件统计拟合细胞存活曲线,式中D。为 曲线指数下降63%所需的剂量。以Ommol/L Rg3 的D。与10mmol/L的D。的比值表示辐射增敏比 (sensitizatiom enhancement ratio,SER)。实验重复 3次。 1.6流式细胞术将单细胞悬液接种于培养皿中, 根据实验设计分为对照组、单纯照射组及Rg3+照射 组。对照组细胞乏氧24h后不予以任何处理,单纯 照射组细胞乏氧24h后给予6MV X射线照射8Gy 继续孵育48h,Rg3+照射组细胞加入10mmol/L Rg3,乏氧24h给予6MV X射线照射8Gy,48h后收 集细胞,用稀释后PBS悬浮细胞,使其密度>1x10。/ ml。取lO01xl细胞悬液于5ml流式管中,加入5txl Apoptpsis Assay Kit和20txg/ml碘化丙啶溶液混匀 后于室温避光孵育15min,于流式细胞仪上机检测。 1.7 Foci焦点形成检测将细胞以5x10 /ml密度 接种,分组同1.6。处理后2h加入4%多聚甲醛固 定,PBS洗涤后封闭1.5h,加入^y-H2AX多克隆抗 体(1:250)4 ̄C过夜,加入羊抗兔-FITC标记的二抗 (1:150)孵育1.5h,PBS洗涤后DAPI染核3min, 20%甘油封片后置于湿盒中,激光共聚焦显微镜下 检测Foci焦点形成情况。 1.8统计学分析采用SPSS 19.0版软件进行数 据处理。实验数据以均数4-标准差表示,多组间比 较用单因素方差分析,两组比较用t检验。以P< 0.05为差异有统计学意义。 2结果 2.1 Rg3对EC109细胞的抑制作用 不同浓度 Rg3(10、20、50、100、200、400、600mmol/L)作用 EC109细胞株24h后,从20mmol/L开始各浓度细 ・890・ 临床肿瘤学杂志2014年l0月第19卷第10期Chinese Clinical Oncolo ̄,Oct.2014,Vo1.19,No.10 of combined HIF—lct,p53 and p21 expression is a useful and sen— sitive indicator of response to radiation and chemotherapy in e- 疗效分析[J].中华放射肿瘤学杂志,2009,18(1):47-51. [6] 吴广银,侯盘长,王伟,等.人食管癌EC9706细胞乏氧环 境中放射敏感性变化及其机制[J].中华放射医学与防护杂 志,2013,3(2):138—141. sophageal cancer[J].Int J Cancer,2004,110(6):838—844. [1O] Stoehzing O,McCarty MF,Wey JS,et a1.Role of hypoxia-in- ducible factor-la in gastric cancer cell growth,angiogenesis,and [7] 冉凤明,魏万里,胡红艳,等.STAT3、p-STAT3、HIF-1 、 VEGF蛋白表达与肺癌侵袭和转移的相关性研究[J].实用医 学杂志,2011,27(14):2570—2572. [8] 于静萍,孙志强,倪新初,等.食管癌患者放疗前后血清血管 vessel maturation[J].J Nail Cancer Inst,2004,96(12):946 -956. 孙一燕,林洪生,朱允中,等.长春瑞滨合并顺铂(NP)加参 胶囊或安慰剂治疗晚期非小细胞肺癌的多中心双盲随机 内皮生长因子变化的临床意义[J].中华放射医学与防护杂 志,2011,31(6):671—674. 临床研究报告[J].中国肺癌杂志,2006,9(3):254—258. 收稿日期:2014-05-29;修回日期:2014-06-29 [9] Sohda M,Ishikawa H,Masuda N,et a1.Pretreatment evaluation CSCO一默克雪兰诺肿瘤研究基金(SCORE)正式签约 2014年9月21日,默克雪兰诺中国公司与北京希思科,I盏床肿瘤学研究基金会在福建省厦门市正式签 立了“CSCO一默克雪兰诺肿瘤研究基金(SCORE)”。在启动“CSCO.默克雪兰诺肿瘤研究基金(SCORE)”的 同时,“CSCO.默克雪兰诺科学日”项目也首次在中国肿瘤界亮相。 “CSCO一默克雪兰诺肿瘤研究基金(SCORE)”专为临床肿瘤医生设立,默克雪兰诺投入1000万人民币, 旨在识别并培养具有潜力的与EGFR(表皮生长因子受体)单克隆抗体有关的创新型研究,治疗领域为消化 道肿瘤及头颈部肿瘤,尤其鼓励个体化治疗方面的探索。在2014年至2016年的3年时间内,通过3轮项目 公示,邀请全国肿瘤专家向“CSCO.默克雪兰诺肿瘤研究基金(SCORE)”提交方案,在评选委员会对方案进 行评审后公布获奖者。该项目预计将提高中国消化道肿瘤及头颈部肿瘤治疗的临床研究和实验水平,更好 造福于广大肿瘤患者。 “CSCO-默克雪兰诺科学日”由中国临床肿瘤学会和默克雪兰诺公司共同举办,旨在实现中国肿瘤专家 与默克雪兰诺全球及中国研发部门的创新化合作,结合中国肿瘤专家的医学专长和洞察与默克雪兰诺在肿 瘤领域的研发实力和丰富资源,通过识别信号传导通路的独特目标,加速针对中国高发癌种的创新型治疗 和本地临床试验进程。 CSCO一默克雪兰诺肿瘤研究基金(SCORE)的正式签约不仅仅是一项抗击癌症的公益事业,也是反映中 国的肿瘤研究正在快速发展以及融入到全球化的肿瘤研究进程之中的标志,这必将更好地造福于肿瘤患者。 

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