医药 笙 第 鲞筮 Ｈｅｂｅｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ，２０１７，Ｖｏｌ ３９ Ｊａｎ Ｎｏ．１ ・） ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－７３８６．２０１７．０１．００１ 论著－ 肝素结合细胞因子影响乳腺癌细胞的增殖、侵袭和 上皮细胞间质化的功能研究 于晓曼朴海龙孙艳李金英钟敏 【摘要】 目的探讨肝素结合细胞因子（Ｍｉｄｋｉｎｅ）的表达对乳腺癌细胞的增殖和侵袭的作用。方法采用慢病 毒介导的ｓｈＲＮＡ干扰技术在乳腺癌细胞中沉默Ｍｉｄｋｉｎｅ的表达，及利用慢病毒高表达Ｍｉｄｋｉｎｅ基因在正常乳腺表皮 细胞中。利用蛋白质印迹（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）法检测ｓｈＲＮＡ干扰或高表达后的正常乳腺表皮细胞和乳腺癌细胞中Ｍｉｄ— ｋｉｎｅ蛋白的表达情况。利用流式细胞仪技术、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ小室实验、及细胞划痕实验，分析Ｍｉｄｋｉｎｅ基因高低表达对正 常乳腺表皮细胞和乳腺癌细胞生长、增殖、侵袭及转移的影响。结果首先观察了不同乳腺癌细胞中Ｍｉｄｋｉｎｅ的表达 情况。其中Ｍｉｄｋｉｎｅ只有在ＢＴ５４９、ＭＤＡ．ＭＢ１５７和ＭＤＡ—ＭＢ４３６间充质乳腺癌细胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｃｅｌ１）中表达，而正 常细胞和上皮细胞乳腺癌细胞（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌ１）中不表达。ＢＴ５４９细胞中两种不同ｓｈＲＮＡ降低Ｍｄｉｋｉｎｅ蛋白表达的效 率分别达到１００％和９０％。ＨＭＬＥ正常乳腺上皮细胞中Ｍｉｄｋｉｎｅ高表达效率非常高。结晶紫染色法检测细胞增殖实 验结果显示，Ｍｉｄｋｉｎｅ－ｓｈＲＮＡｓ转染组ＢＴ５４９细胞的生长速度较阴性对照组降低（Ｐ＜０．０１）。流式细胞仪检测结果显 示，Ｍｉｄｋｉｎｅ．ｓｈＲＮＡｓ转染组ＢＴ５４９细胞的增殖指数为（３６．０６±２．１２）％和（３２．０６±３．４６）％，明显低于对照组５３．０６± ３．６８％。同时观察到ＥＭＴ标识物Ｂ连环蛋白（Ｄ—ｃａｔｅｎｉｎ）、Ｎ钙粘蛋白（Ｎ．ｃａｄｈｅｉｆｎ）在Ｍｉｄｋｉｎｅ－ｓｈＲＮＡｓ转染组ＢＴ５４９ 细胞中表达上调。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ小室实验显示两个Ｍｉｄｋｉｎｅ－ｓｈＲＮＡ转染组ＢＴ５４９细胞迁移（Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）细胞数为零和（７± ４．４）爪／高倍视野，它们的侵袭（Ｉｎｖａｓｉｏｎ）细胞数为（３８±７）和（４６±８） 高倍视野，明显低于对照组的迁移（Ｍｉｇｒａ． ｔｉｏｎ）细胞数（１７８±１４）个／高倍视野，侵袭（Ｉｎｖａｓｉｏｎ）细胞数（２３２±３５）个／高倍视野。同时也观察到高表达Ｍｉｄｋｉｎｅ正 常乳腺上皮细胞表现出问质化（ＥＭＴ）的表型，ＥＭＴ标识物Ｅ钙粘蛋白（Ｅ—ｃａｄｈｅｉｆｎ）、连环蛋白（Ｂ－ｃａｔｅｎｉｎ）在Ｍｉｄｋｉｎｅ 高表达ＨＭＬＥ细胞中表达下调的现象。细胞划痕实验显示Ｍｉｄｋｉｎｅ高表达ＨＭＬＥ细胞组的迁移距离明显高于对照 组。结论在ＢＴ５４９细胞中降低Ｍｉｄｋｉｎｅ的表达，可抑制ＢＴ５４９细胞的迁移和侵袭，同时可明显上调对上皮细胞间质 化标志蛋白Ｂ—Ｃａｔｅｎｉｎ和Ｎ—ｃａｄｈｅｆｉｎ表达，提示在Ｍｉｄｋｉｎｅ高表达的肿瘤患者中，通过抑制其蛋白表达可能抑制肿瘤的 转移和侵袭。 【关键词】 乳腺肿瘤；肝素结合细胞因子；乳腺癌细胞；上皮细胞间质化；ｓｈＲＮＡ干扰；细胞迁移；细胞侵袭 【中图分类号】 Ｒ ７３７．９ 【文献标识码】Ａ 【文章编号】 １００２—７３８６（２０１７）Ｏ１—０００５—０５ Ｅｆｌｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｍｉｄｋｉｎｅ ｏｎ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ．ｉｎｖａｓｉｏｎ ａｎｄ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ＹＵ Ｘｉａｏｍｉｎ’， Ｐ ０ Ｈａｉｌｏｎｇ，ｓ Ｙａｈ ，ｅｔ ａ１． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆＯｎｅｏｌｏｇｙ，Ｃｅｎｔｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆＤａｌｉａｎ Ｃｉｔｙ，Ｌｉａｏｎｉｎｇ，Ｄａｌｉａｎ １１６０００，Ｃｈｉｎａ 【Ａｂｓｔｒａｃｔ】 ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｍｉｄｋｉｎｅ ｏｎ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ｉｎｖａｓｉｏｎ ａｎｄ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ（ＥＭＴ）ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｉｄｋｉｎｅ ｗａｓ ｓｉｌｅｎｃｅｄ ｂｙ ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ—ｍｅｄｉａｔｅｄ ｓｈＲＮＡｓ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ．ａｎｄ ｔｈｅ ｈｉｇｈ．ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｇｅｎｅ ｏｆ Ｍｉｄｋｉｎｅ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｎｏｒｍａｌ ｂｒｅａｓｔ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｃｅｌｌｓ．Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ Ｍｉｄｋｉｎｅ ｉｎ ｎｏｒｍａｌ ｂｒｅａｓｔ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｃｅｌｌｓ（Ｂ ｒ５４９）ａｎｄ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ （ＨＭＬＥ）ａｆｔｅｒ ｓｈＲＮＡｓ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ．Ｔｈｅ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ ｃｈａｍｂｅｒ ｅｘｐｅｆｉｍｅｎｔ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｓｃｒａｔｃｈ ａｓｓａｙ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ａｎａｌｙｚｅ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｍｉｄｋｉｎｅ ｇｅｎｅ ｏｎ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ，ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ｉｎｖａｓｉｏｎ ａｎｄ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｉｎ ｎｏｒｍａｌ ｂｒｅａｓｔ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ ｏｆ Ｍｉｄｋｉｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｅｒｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｏｎｌｙ ｉｎ ｍｅｓｅｎｅｈｙｍａｌ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ＢＴ５４９．ＭＤＡ．ＭＢ１５７ ａｎｄ ＭＤＡ．ＭＢ４３６。ｈｏｗｅｖｅｒ，ｗｈｉｃｈ ｗｅｒｅ ｎｏｔ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｉｎ ｎｏｒｍａｌ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｅｐｉｔｈｅｌｉａ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｂｒｅａｓｅ ｃａｎｃｅｒ．Ｔｈｅ ｔｗｏ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ｓｈＲＮＡ ｉｎ ＢＴ５４９ ｃｅｌｌｓ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｅｆｉｆｃｉｅｎｃｙ ｏｆ Ｍｉｄｋｉｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｙ １００％ａｎｄ ９０％．ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ ｃｒｙｓｔａｌ ｖｉｏｌｅｔ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｓｐｅｅｄ ｏｆ ＢＴ５４９ ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｍｉｄｋｉｎｅ—ｓｈＲＮＡｓ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｇｒｏｕｐ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔｌｙ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ，ａｓ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈａｔ ｉｎ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ （Ｐ＜０．０１．）．Ｔｈｅ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｉｎｄｅｘ ｏｆ ＢＴ５４９ ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｍｉｄｋｉｎｅ．ｓｈＲＮＡｓ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｇｒｏｕｐ ｗａｓ（３６．０６±２．１２）％，（３２．０６±３．４６）％， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ ｌｏｗｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｉｎ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ［（５３．０６±３．６８）％］．Ｍｅａｎｗｈｉｌｅ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ ｏｆ ＥＭＴ ｍａｒｋｅｒｓ—Ｂ．ｃａｔｅｎｉｎｓ ａｎｄ Ｎ．ｃａｄｈｅｒｉｎ ｗｅｒｅ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｉｎ ＢＴ５４９ ｃｅｌｌｓ ｉｕ Ｍｉｄｋｉｎｅ．ｓｈＲＮＡｓ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｇｒｏｕｐ．Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ ｃｈａｍｂｅｒ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔ ｏｆ ＢＴ５４９ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｗａｓ ０ ａｎｄ ７±４／ｈｉｇｈ ｐｏｗｅｒ ｆｉｅｌｄ ｉｎ ｔｈｅ ｔｗｏ Ｍｉｄｋｉｎｅ－ｓｈＲＮＡ 作者单位：１１６０。０辽宁省大连市中心医院肿瘤科（于晓曼、孙艳、 ｗａｓ ３８±７ ａｎｄ ４６±８／ｈｉｇｈ ｐ。ｗｅｒ ｉｆｅｌｄ，ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ｓｉｇｎ ｉｉｆｃａｎｔｌｙ ｌｏｗ ｅｒ ｔ ｈａｎｔｈｅ ｍ ｉｇｒａｔｉｏｎ ｃｅｌｌ ｃｏｕｎ ｔ（１ ７８± 通讯作者：朴海龙，ｌ１６０２３ 辽宁省大连市，中国科学院大连化学 ．…． 物理研究所生物技术部； ……、． ． … ．． …ｉｎｖａｓＥ．ｍａｉｌ：ｈｌｐｉａｏ０７０９＠ｇｍａｉｌ．ｃｏｍ 三ｎ ｒｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔ （２３２￣３５／。…ｈｉｇｈ ｐｏｗｅｒ ｆｉｅｌｄ）． ６ Ｅ医药２０１７年１月第３９卷第１ Ｈｅｂｅｉ 』 ： ： ！ ： Ｍｏｒｅｏｖｅｒ ｔｈｅ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｏｆ ＥＭＴ ｗａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｉｎ ｎｏｒｍａｌ ｂｒｅａｓｔ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｔｈａｔ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ｍｉｄｋｉｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｈｉｇｈｌｙ，ａｎｄ ｔｈｅ ｄｏｗｎ．．ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ ｏｆ ｏｆ ＥＭＴ ｍａｒｋｅｒｓ－－Ｅ—ｃａｄｈｅｆｉｎ ａｎｄ Ｂ－ｃａｔｅｎｉｎ ｗａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｉｎ ＨＭＬＥ ｃｅｌｌｓ ｔｈａｔ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ｍｉｄｋｉｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｈｉｇｈｌｙ．Ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｓｃｒａｔｃｈ ａｓｓａｙ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｌｅｎｔｈ ｉｎ ＨＭＬＥ ｃｅｌｌｓ ｔｈａｔ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ｍｉｄｋｉｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｈｉｇｈｌｙ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔｌｙ ｌｏｎｇｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｉｎ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔｏ ｒｅｄｕｃｅ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ Ｍｉｄｋｉｎｅ ｉｎ ＢＴ５４９ ｃｅｌｌｓ ｃａｎ ｉｎｈｉｂｉｔ ｔｈｅ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｖａｓｉｏｎ ｏｆ ＢＴ５４９ ｃｅｌｌｓ，ａｔ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｔｉｍｅ，ｗｈｉｃｈ ｃａｎ ｕｐ—ｒｅｇｕｌａｔｅ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍａｒｋｅｒｓ—Ｂ－ｃａｔｅｎｉｎ ａｎｄ Ｎ—ｅａｄｈｅｒｉｎ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ｉｎ ｔｕｍｏｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｈｉ ｇｈ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｄｋｉｎｅ，ｔｕｍｏｒｇ ｉｎｖａｓｉｏｎ ａｎｄ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｃａｎ ｂｅ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｂｙ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｄｋｉｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ． 【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】 ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ；Ｍｉｄｋｉｎｅ；ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ；ｅｐｉｔｈｅｌｉａ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ；ｓｈＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ； ｃｅｌｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ；ｃｅｌｌ ｉｎｖａｓｉｏｎ 乳腺癌在中国也成为了中国女性最常见的癌症， ２９３Ｔ细胞。４８ ｈ后收获含病毒的上清１０ ｍｌ，利用 每年乳腺癌新发数量和死亡数量分别占全世界的 ０．４ Ｉｘｍ滤膜过滤，去除细胞碎片，吸取３ ｍｌ病毒上清 １２．２％和９．６％ Ｊ。肝素结合细胞因子（Ｍｉｄｋｉｎｅ）是 液加入到已在６孔板细胞培养皿培养好的细胞中。 一种分泌性蛋白，Ｍｉｄｋｉｎｅ蛋白相对分子量为 １．２．２细胞培养和转染：实验分为２个Ｍｉｄｋｉｎｅ—ｓｈＲ— １３ ｋＤ 。Ｍｉｄｋｉｎｅ在许多种恶性肿瘤中，如乳腺癌、 ＮＡ转染组和阴性对照组（即转染无关序列，ｓｈＣｏｎ— 肝癌、食管癌、胃癌、结直肠癌、前列腺癌和恶性胶质瘤 ｔｒｏ１），以及Ｍｉｄｋｉｎｅ—ｃＤＮＡ转染组和阴性对照组（即转 表达上调 Ｊ。Ｍｉｄｋｉｎｅ参与多种生物学功能，细胞增 染空载体，Ｃｏｎｔｒｏ１）。用含１０％胎牛血清及青、链霉素 殖、细胞迁移、促血管生成、抗凋亡等功能影响肿瘤细 以及不同生长因子的ＤＭＥＭ／Ｆ１２和ＭＥＢＭ培养基常 胞的增殖、分化及凋亡 ６ Ｊ。本研究中，我们探讨Ｍｉｄ— 规培养乳腺癌细胞株ＢＴ５４９和乳腺上皮正常细胞 ｋｉｎｅ对乳腺癌细胞增殖、上皮细胞间质化、迁移和侵袭 ＨＭＬＥ，至对数生长期时，以０．２５％的胰酶消化。将 的影响。 ＢＴ５４９和ＨＭＬＥ细胞以２×１０ 个／孔接种于６孔板 １材料与方法 中，培养至细胞生长达７０％融合时，按照实验室常规 １．１材料 方法将３ ｍｌ病毒上清液加入分别感染ＢＴ５４９和ＨＭ— １．１．１ 乳腺上皮细胞和癌细胞：人原乳腺上皮细胞株 ＬＥ细胞。待转染后４８和７２ ｈ后，在荧光倒置显微镜 ＨＭＬＥ，由美国ＭＤ安德森癌症中心提供，ＢＴ５４９细胞 下观察绿色荧光，在感染效率最高时，用Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ和 由ＡＴＣＣ购置。按照ＡＴＣＣ提供信息培养细胞。 Ｂｌａｓｔｃｉｄｉｎ加压筛选稳定表达细胞株，扩大培养。 １．１．２主要试剂：兔抗人Ｍｉｄｋｉｎｅ单克隆抗体购于美 １．２．３ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｏｌｔ方法检测不同转染组ＢＴ５４９和 国Ｏｒｉｇｅｎｅ公司，其他抗体如下；Ｂ—ｃａｔｅｎｉｎ（ＢＤ ＨＭＬＥ细胞中Ｍｉｄｋｉｎｅ蛋白的表达：收集Ｍｉｄｋｉｎｅ—ｓｈＲ— ６１０１５４），Ｅ—ｃａｄｈｅｒｉｎ（ＢＤ ６１０１８２），Ｎ—Ｃａｄｈｅｒｉｎ（ＣＳＴ＃ ＮＡ转染组和阴性对照组ＢＴ５４９细胞，以及Ｍｉｄｋｉｎｅ— ４０６１），Ｖｉｍｅｎｔｉｎ（Ｄ２１Ｈ３）（ＣＳＴ＃５７４１）和Ｂ—ａｃｔｉｎ（Ｓｉｇ— ｃＤＮＡ转染组和阴性对照组ＨＭＬＥ细胞，提取细胞总 ｍａ，Ａ５４４１）。细胞裂解液、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ封闭液、胰酶 蛋白后，利用同等量的蛋白质（４０ Ｉｘｇ），进行十二烷基 细胞消化液购于广州碧云天生物技术研究所。羊抗兔 硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｏｌｔ封闭液封 即用型快捷免疫组化试剂购于Ｍｉｌｉｐｏｒｅ生物技术开发 闭１ ｈ后，加Ｍｉｄｋｉｎｅ多克隆抗体（１：１ ０００）４ｃ【＝过夜， 有限公司。胎牛血清、ＤＭＥＭ培养基购自美国Ｇｉｂｃｏ 二抗（羊抗兔即用型快捷免疫组化试剂）室温孵育１ ｈ， 公司。Ｔｒａｎｓｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ）试剂购自Ｔｈｅｒｍｏ公司、 化学发光试剂增强反应，利用化学发光检测系统显影。 包装辅助质粒、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ小室、购自美国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １．２．４结晶紫染色法检测不同ｓｈＲＮＡ转染组ＢＴ５４９ 公司。 细胞的生长：将Ｍｉｄｋｉｎｅ．ｓｈＲＮＡ转染组和阴性对照组 １．２实验方法 ＢＴ５４９细胞的密度调整为２×１０ 个／ｍｌ，以１００ 孔 １．２．１靶向Ｍｉｄｋｉｎｅ基因的慢病毒载体的构建与生 加入ｌ２孔板，每组设３个复孔，３７℃、饱和湿度、５％ 产：设计Ｍｉｄｋｉｎｅ基因的ｓｈＲＮＡ干扰序列为ｓｈＲＮＡ１：５ ＣＯ：条件下培养。在细胞转染不同时间（转染后１～ ＝ＴＧＡＴＴＡＡＡＧＣＴＡＡＣＧＡＧＣＡ一３’，ｓｈＲＮＡ２：５’一ＴＴＣＴ— ６ ｄ）后，去除培养基加入０．０５％结晶紫试剂２００ ，孔， ＴＡＧＴＡＡＴＧＧＡＡ１ＴｒＧＴ．３’，含干扰片段及无关序列的慢 室温染色１５ ｍｉｎ。去除结晶紫染色液后，利用１ｘＰＢＳ 病毒载体委托上海生工公司合成。将脂质体Ｔｒａｎｓ ｒｅ． 冲洗５次，每次１５ ｍｉｎ，晾干照相。加入１０％冰醋酸 ａｇｅｎｔ（ＴｈｅｒｌＴｌＯ）加入含干扰片段的慢病毒载体与包装 溶液２００ ｌ／，孔，洗脱被结晶紫染色的细胞，洗脱液放 辅助质粒的混合物中，混匀，室温孵育２０ ｍｉｎ，共转入 在９６孑Ｌ板，在酶标仪５９０ ｎｍ处测定吸光度（Ａ）值，记 生 鲞筮 Ｈｅｂｅｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ。２０１７，ｖ０ｌ ３９ Ｊａｎ Ｎｏ．１ ７ 录结果。 胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｃｅｌ１）中表达。下一步为了研究Ｍｉｄ． ｋｉｎｅ的功能，建立了Ｍｉｄｋｉｎｅ的功能缺失（Ｌｏｓｓ．ｏｆ－ｆｕｎｃ— ｔｉｏｎ）和功能增加（Ｇａｉｎ—ｏｆ－ｆｕｎｃｔｉｏｎ）细胞系。Ｗｅｓｔｅｒｎ １．２．５ 流式细胞仪检测不同转染组ＢＴ５４９细胞的细 胞增殖：收集Ｍｉｄｋｉｎｅ．ｓｈＲＮＡ转染组和阴性对照组 ＢＴ５４９细胞，经一２０℃预冷的７５％乙醇固定，４℃过 Ｂｏｌｔ结果显示两种不同的Ｍｉｄｋｉｎｅ ｓｈＲＮＡ显著降低了 在ＢＴ５４９细胞中Ｍｉｄｋｉｎｅ蛋白的表达，反而Ｍｉｄｋｉｎｅ ｅＤＮＡ显著上调了在ＨＬＭＥ细胞中Ｍｉｄｋｉｎｅ蛋白的表 达。见图１。 夜，０．２５％胰酶消化，制成单细胞悬液，２ ０００ ｒ／ｒａｉｎ离 心５ ｍｉｎ。加入ＰＩ和ＢｒｄＵ溶液，室温避光染色 １５ ｍｉｎ，上流式细胞仪进行检测，根据细胞周期计算增 殖指数。 １．２．６ Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ小室实验检测不同ｓｈＲＮＡ转染组 ＢＴ５４９细胞的体外迁移和侵袭能力：①迁移：应用不含 胎牛血清的ＤＭＥＭ培养基，Ｍｉｄｋｉｎｅ—ｓｈＲＮＡ转染组和 阴性对照组ＢＴ５４９细胞培养４８ ｈ后，转至Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ 小室（２４孑Ｌ板，８ ｍ小孔）、不含胎牛血清的ＤＭＥＭ ＭＤＫ Ａｃｔｉｎ 培养基中。在小室下层加入含１０％胎牛血清的 ＤＭＥＭ培养基作为趋化剂，孵育２４ ｈ后，应用棉签拭 去非侵袭性细胞。②侵袭：应用不含胎牛血清的冷 ＤＭＥＭ培养基，按１：５稀释Ｍａｔｒｉｇｅｌ基质胶，将Ｔｒａｎ－ ｓｗｅｌ１小室置于２４孔板中，取１００ ｌ稀释胶加至上室， 室温干燥过夜。Ｍｉｄｋｉｎｅ—ｓｈＲＮＡ转染组和阴性对照组 ＢＴ５４９细胞培养４８ ｈ后，转至Ｍａｔｒｉｇｅｌ包被小室（２４ 孔板，８ ｍ小孔）、不含胎牛血清的ＤＭＥＭ培养基中。 在小室下层加入含１０％胎牛血清的ＤＭＥＭ培养基作 Ｂ 为趋化剂，孵育２４ ｈ后，应用棉签拭去非侵袭性细胞。 迁移和侵袭的细胞以甲醛固定，苏木精染色。在２００ 倍荧光显微镜下计数细胞。 １．２．７细胞划痕实验检测细胞的迁移能力：取对数生 长期的Ｍｉｄｋｉｎｅ．ｃＤＮＡ转染组和阴性对照组ＨＭＬＥ细 圈 ＭＤＫ Ａｃｔｉｎ ＢＴ５４９ ＨＭＬＥ 图１ Ｍｉｄｋｉｎｅ在乳腺癌细胞中表达，以及建立低表达和高表达细胞系 （Ａ：Ｍｉｄｋｉｎｅ在正常乳腺上皮细胞和６中乳腺癌细胞表达。Ｂ：在 ＢＴ５４９细胞中建立的隐性对照和两种不同Ｍｉｄｋｉｎｅ—ｓｈＲＮＡ细胞 胞，以每孑Ｌ ２ Ｘ ｉ０ 个接种于６ ｒ孔板。当细胞呈现出单 壁生长状态时，用１０ １移液头将单层细胞沿培养 板底部呈“一”字型划痕。以１ Ｘ ＰＢＳ液清洗３次，分 别于无胎牛血清的ＭＥＢＭ培养基中培养０、１８ ｈ时，在 制系。Ｃ：在ＨＭＬＥ细胞中建立的隐性对照和高表达细胞系） ２．２ Ｍｉｄｋｉｎｅ．ｓｈＲＮＡ转染组ＢＴ５４９细胞增殖受到抑 结晶紫法检测细胞增殖结果显示，ＢＴ５４９细胞生 倒置显微镜下观测划痕的宽度，计算划痕迁移率。细 胞划痕迁移率＝（初始划痕宽度一实验时间点划痕宽 度）／初始划痕宽度Ｘ １００％。实验重复３次。 长至第３—６天，两种Ｍｉｄｋｉｎｅ．ｓｈＲＮＡ转染组的细胞生 长速度明显低于阴性对照组，利用酶标仪测定相对细 胞增殖发现，在细胞种植后４ ｄ后开始Ｍｉｄｋｉｎｅ—ｓｈＲＮＡ 转染组细胞的增殖明显慢于阴性对照组（Ｐ＜０．０１）。 １．３统计学分析计量资料以元４－ｓ表示，采用ｔ检验 和方差分析，Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。 ２结果 同时流式细胞仪检测结果显示两种Ｍｉｄｋｉｎｅ—ｓｈＲＮＡ转 染组Ｓ期细胞的比例分别为（３６．０６ ４－２．１２）％和 （３２．０６ ４－３．４６）％，明显低于阴性对照组（５３．０６ ４－ ３．６８）％。这些结果提示ｓｈＲＮＡ干扰Ｍｉｄｋｉｎｅ基因表 达后，可成功的抑制ＢＴ５４９乳腺癌细胞的生长。见 图２。 ２．１ 检测Ｍｉｄｋｉｎｅ在不同乳腺癌细胞中表达，以及建 立Ｍｉｄｋｉｎｅ—ｓｈＲＮＡ低表达和Ｍｉｄｋｉｎｅ—ｃＤＮＡ高表达细 胞系为了探索Ｍｉｄｋｉｎｅ在乳腺癌中的功能，首先检 测了不同的乳腺癌细胞中的Ｍｉｄｋｉｎｅ蛋白的表达量。 Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｏｌｔ结果显示Ｍｉｄｋｉｎｅ在正常细胞和上皮细 胞乳腺癌细胞（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌ１）中不表达，只有在 ＢＴ５４９、ＭＤＡ．ＭＢ１５７和ＭＤＡ．ＭＢ４３６间充质乳腺癌细 ２．３ Ｍｉｄｋｉｎｅ．ｓｈＲＮＡ转染组ＢＴ５４９细胞的迁移和侵 袭能力明显降低 为了检测Ｍｉｄｋｉｎｅ—ｓｈＲＮＡ转染组 ＢＴ５４９细胞的迁移和侵袭能力，首先分析了Ｍｉｄｋｉｎｅ－ ＾ｌ３ ∞ ２ ；ｉ１０≯ｎ《 ｌ ７（】ｌ！ ０ 筮 鳖 期Ｈｅ１）ｅｉ Ｍ ｈｅａｌ Ｊ．ｕｌ・ｎａｌ，２０１７，Ｖｄ ３９ Ｊ Ｌｕ１ Ｎ０ Ｃ … ｓｈＣｏｎＰ ｏｌ Ａ Ｅ 里 Ｂ ３ ● ５ ｔ蛳ｓ ＢＴ５鹌 图３ Ｍｉ（ｔｋｉｎ￣ 影响乳 螂的细胞迁移乖¨ 爱Ａ：￣ｔｉ ｎｉｄｋ＿ｉ１ｌ・．ｓｈｔ／ＮＡ转 染绀 １＂５４９细胞，利』ｔ Ｊ ＭＤＫ。Ｅ ⅢＩＩｌｆ－ｒｉｎ．１３ ａｔ（１ＩＩ ，Ｎ ｌｔ ｉｎ科Ｉ 图２ Ｍｉｄｋｉ）．‘影响乳腺癌的细胞增艄［Ａ：１ ｘ １０ 细胞移ｆｆｆ １２孔舨 第６人结｝； 紫染色结粜Ｂ：Ｍｉｄｋｉｎｅ ｓｈｌｔＮ＾转染 和隐 ｒ¨ ｆ｛ ｃ １ＩＳＩ＇９０特片性抗ｆ小做ｗｒｓｈ＞ｌ『 ｌ１）ｈ）ｉ Ｂ－Ｃ：Ｍｉｄｋｉ ｒ． 一ｓｈＩＩＮＡ转染组 ｆＩＩ隐 ｒｌ：埘照ＢＴ５４９邹ＩＩ胞的迁移实验（，Ｊ＜０ ０１） 嫩 实验组３ 个孔 复Ｄ—Ｅ：Ｍｉｄｋｉｎ（ 一ｓｈｌ｛ＮＡ转染 和隐忡对照Ｈ １５４９细胞 ＢＴ５４９细胞 托曲线（，’＜０．（）１）每个实验组４个孔五 Ｆ：隐 埘照（ｃ）ＢＴ５４９￣１ｉｌ胞的增殖速率叫｛ｌｌｌ快Ｊ：Ｍｉｄｋｉｎ＊一 Ｎ、 １＇１９心袋实验（Ｐ＜０．０１）每个实验 ３个孔 复 转染 Ｂ＇Ｉ、５４９细胞（Ｄ和 ：），Ｍｉｄｋｉｎｅ—ｓｈｌ／ＮＡ车々染组的Ｓ 细胞 ＬｔｌＴｔ 埘照少于３０％Ａｉ （｝、） 每个实验纠【订３次匝复 问质化（ＥＭＴ）和辽移有非常重要的作用。见 ４ Ａ ｓｈＲＮＡ转染纽和隐性对照ＢＴ５４９细胞中与卜皮细胞 问质化有关的Ｍａｒｋｅｌ‘货［１ｊ。Ｗｅｓｔｅｒｎ １）ｌｏｔ结果显，Ｊ 皮细胞 质化Ｍａｒｋｅｒ蛋 Ｂ—ｃａｔｅｎｉｌ１干¨Ｎ ａ（１ｈｅｌ‘ Ｍｉｄｋｉｎｅ—ｓｈｌ｛ＮＡ转染组ＢＴ５４９细胞｝ｆ月 升、Ｔｉ・ａｌｌ ＿ 一， Ｃ ＨＭＬＥ・ｐＬｏｃ Ｃｏｎ ＨＭＬＥ －ＭＤＫ ●●ＭＤＫ Ｅ－ｃａｄｈｅ １８ ｈＦ ｓｗｅｌｌ小室实验检测结粜 示，两种Ｍｉｄｋｉｎｅ—ｓｈＲＮＡ转 染组Ｂ＇１＂５４９细胞迁移（Ｍ ａｔｉｏｎ）细胞数各为零和 ’ 一 脯ｉ；－ｃａ￣ｅｎｉｎ ＩＩ Ｖｉｍｅｎ （７±４）个／高倍视野，明 低于阴性对照组的迁移细 胞数（１７８±ｌ４）个／高倍视野（Ｐ＜０．０１），两种Ｍｉｄ— ｋｉｎｅ—ｓｈＲＮＡ转染组侵袭（Ｉｎｖａｓｉｏｎ）的细胞数为（３８± Ｈ ＨＳ￣Ｏ０ ＨＭＬＥ 图４ ￣１ｉ（１ｋｉｌｌｌ‘影响 芷圳ｎ也川艇化（｝３１ １ ）ｆ｛Ｉ钏胞迁移（、：ｌＩＭ１ ｌ 绑胞 ７）个和（４６±８）个／高倍视野，同样ｆ月娃低于阴性对照 ｊ组的侵袭细胞数（２３２±３５）个／高倍视野（Ｐ＜０．０１） 这些结果提示ｓｈＲＮＡ干扰Ｍｉｄｋｉｎｅ 表达后，｜】ｒ成 『Ｉｊ转 ＣｏｔｉｌｌＯＩ隐州：刈照 城体棚Ｍｉ（１ｋｉｎｅ ＤＮＡ 是达找伴的 Ｊ ；Ｂ：Ｍｉｄｋｉｎ，、．ｒ－Ｉ）Ｎ＾转染组ＨＭＩ 细胞，利用ＭＩ）Ｋ，ｈ－ａ（ｔｈｅｒ一 ＿ｌｌ＿Ｂ ｕＩｅｎｉｉ１，ＶＩ『１……Ｉｌ和ｔｌＳＰ９０特片性抗体做ｗ 『１ ｈｈ）０；Ｃ： 划 良 Ｍｉ（１ｋｉｎ￣ Ｉ）ＮＡ转染 【ｆ¨隐一Ｐ＇ｔ－ｘ ｊ暇ＩＩＭＩ 阿胞的戈０ 『 ，ｊ、 验功的抑制ＢＴ５４９乳腺癌细胞的迁移和授袭。见 ３ 、 ２．４ Ｍｉｄｋｉｎｅ—ｅＤＮＡ转染组ＨＭＬＥ细胞 现上皮细胞 问质化（ＥＭＴ）表型，以及迁移能力叫娃上升 为ｒ进 一／ ０ ｈ和ｌ８ ｈ＾ｉ 的细胞愈合的震 ） ３讨论 肝索结合 胞凶子（Ｍｉｄｋｉｎｅ），同时也命名 ＮＥＣ， （１ｌｅｕｒｉｔｅ ｇｒｏｗｌｌ卜ｐ／＇ｏｌｎｏｔｉｔｌｇ ｆａｃｈ｝ｒ ２）： Ｍｊ（１ｋｉｉｉｅ 步验证Ｍｉｄｋｉｎｅ对细胞形态的功能，在ＨＭＬＥ细胞 中转染Ｍｉ（ｔｋｉｎｅ—ｅＤＮＡ。高表达Ｍｉｄｋｉｎｅ结果显 ，町 以诱导ｔｔＭＩ Ｅ细胞的卜皮细胞间质化（ＥＭＴ）。Ｗｅｓｌ— 基『尺ｊ定 于人染色体１ １ ｑｌ １ ｔ：－，主要由碱性氨基酸和 半胱氦酸组成、分子量为（１３ ｋ１））的分泌货ｌ ｊ。卜 。 分泌剑胞外的Ｍｉ（Ｉｋｉｎｅ蛋白，通过受体的 体依赖性 激活卜游的信号通路，并参与凋节不同的生物学过 程 、Ｍｉｄｋｉｎｅ町多种生物学功能，如细胞增殖， 细胞辽移，巾ｌ管生成和纤维蛋 溶解等，并以 体形式 与受体型酪氨酸磷酸酶∈（ＰＴ１ ‘），低密度脂 ｒＩ受体 （Ｌｆ／Ｐ１），问变性 ｍ病激酶（Ａ１ Ｋ）和ｓｙｎｄｅ（・￣ｔｌｌＳ等受 体结合 。本研究发现，Ｍｉｄｋｉｎｅ胞内蛋白 限于住 ｅｌ‘１１ ｂｌｏｔ结果显示，上皮细胞ＩｔＪ质化Ｊ 皮细胞蛋白（ 一 ｉｔｈｅｌｉａ）Ｍａｒｋｅｒ蛋白Ｅ ａｄｈｅｒｉｎ和１３．ｃａｌｅｎｉｎ在Ｍｉ（Ｉｋｉｎｅ— ｅＤＮＡ转染组ＨＭＬＥ细胞中明显下降，反而问叶细胞 （Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａ１）Ｍａｒｋｅｉ 蚩ｎ明 上升 细胞划痕实验 的检测结果 示，第１８小时后Ｍｉｄｋｉｎｅ－ｃ：Ｉ）ＮＡ转染组 ＨＭＩ Ｅ细胞的迁移距离叫显高于阴性对照组ＨＭＩ Ｅ细 胞和空白埘照组。这些结果提示Ｍｉ￣ｌｋｉｎｅ对上皮细胞 可北医药２０１７年１月第３９卷第１期Ｈｅｂｅｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ，２０１７，Ｖｏｌ ３９ Ｊａｎ Ｎｏ．１ ９ 问充质乳腺癌细胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｃｅｌ１）中表达（图 参考文献 １ Ｆａｎ Ｌ，Ｓｔｒａｓｓｅｒ・Ｗｅｉｐｐｌ Ｋ，Ｌｉ ＪＪ，ｅｔ １．Ｂｒａｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｉｎ Ｃｈｉｎａ．Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎ— ｃｏｌｏｇｙ，２０１４，１５：ｅ２７９一ｅ２８９． １ Ａ），这一现象有可能提示Ｍｉｄｋｉｎｅ在恶性程度较高的 癌症中同过不同受体影响生物学表型和信号通路。 大量的研究已证实，Ｍｉｄｋｉｎｅ在各种恶性肿瘤的表 达显著高于正常组织，如肺癌、乳腺癌、前列腺癌和肠 癌等 ¨］。此外，在成神经细胞瘤（ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ）、 星形细胞瘤（ａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａｓ）、胰腺癌（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ） 和胃肠道间质瘤（ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｓｔｒｏｍａｌ ｔｕｍｏｒｓ）Ｍｉｄ－ ２ Ｋａｎａｍｅ Ｔ，Ｋｕｗａｎｏ Ａ，Ｍｕｒａｎｏ Ｉ，ｅｔ ａ１．Ｍｉｄｋｉｎｅ ｇｅｎｅ（ＭＤＫ），ａ ｇｅｎｅ ｆｏｒ ｐｒｅｎａｔａｌ ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｎｅｕｒｏｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，ｍａｐｓ ｔｏ ｂａｎｄ一１ ｌ ｐｌ １．２ ｂｙ ｌｕｏｒｆｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ．Ｇｅｎｏｍｉｅｓ。１９９３．１７：５１４－５１５． ３ Ｒｅｂｂａａ Ａ，Ｃｈｏｕ ＰＭ，Ｍｉｒｋｉｎ ＢＬ．Ｆａｃｔｏｒｓ ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｂｙ ｈｕｍａｎ ｎｅｕｍｂｌａｓｔｏ． ｍａ ｍｅｄｉａｔｅ ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｂｙ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ＳＴＡＴ３ ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ａｐ－ ｏｐｔｏｓｉｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００１，７：３９３－４００． ４ Ｋａｔｏ Ｍ，Ｍａｅｔａ Ｈ．Ｋａｔｏ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄ— ｉｚａｔｉｎ ａｎａｌａｙｓｅｓ ｏｆ ｍｉｄｋｉｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｈｙｒｏｉｄ ｐａｐｉｌｌａｒｙ ｃａｒｃｉｎｏｍａ． Ｍｏｄｅｒｎ Ｐａｔｈｏｌ，２０ｏＯ，１３：１０６０．１０６５． ｋｉｎｅ蛋白的表达已被证明是强力的不良预后的指 标 Ｊ。本研究中发现在乳腺癌ＢＴ５４９中抑制Ｍｉｄ－ ｋｉｎｅ表达，显著的抑制了ＢＴ５４９的细胞生长和增殖 （图２）。由此可以推断抑制癌细胞中高表达Ｍｉｄｋｉｎｅ， 可能抑制恶性肿瘤细胞的增殖和肿瘤生长。 肿瘤发生转移过程中可观察到上皮细胞间质化 （ＥＭＴ），是肿瘤细胞转移过程中的第一个形态学的变 化。研究报道，Ｍｉｄｋｉｎｅ在永生化ＨａＣａＴ细胞中促进 上皮细胞间质化（ＥＭＴ），并激活Ｎｏｔｃｈ２信号传导，导 致Ｈｅｓｌ基因和ＪＡＫ２／Ｓｔａｔ３蛋白质相互作用 。本研 究中发现高表达Ｍｉｄｋｉｎｅ—ｃＤＮＡ在ＨＭＬＥ细胞中，可诱 导上皮细胞间质化（ＥＭＴ）（图４Ａ），因而影响了上皮 细胞间质化（ＥＭＴ）标志蛋白；Ｅ—ｃａｄｈｅｆｉｎ、Ｂ－ｃａｔｅｎｉｎ和 ｖｉｍｅｎｔｉｎ的表达（图４Ｂ）。同时，Ｍｉｄｋｉｎｅ—ｃＤＮＡ的高表 达明显上升了划痕后细胞的迁移速率（图４Ｃ）。这些 结果提示Ｍｉｄｋｉｎｅ对细胞的上皮细胞间质化（ＥＭＴ）和 迁移有重要的作用。 一直以来肿瘤侵袭和转移是肿瘤研究中最热门、 最难攻克的研究领域。大于９０％的肿瘤患者死亡与 肿瘤转移有密切相关，并严重影响着患者的预后。因 此，探索抑制肿瘤转移因素可对延迟肿瘤患者的生存 率有重要意义。本研究中发现，在ＢＴ５４９细胞中降低 Ｍｉｄｋｉｎｅ的表达，可抑制ＢＴ５４９细胞的迁移和侵袭（图 ３Ｂ和ｃ），同时，可明显上调对上皮细胞间质化标志蛋 白Ｂ．ｃａｔｅｎｉｎ和Ｎ．ｃａｄｈｅｆｉｎ在表达（图３Ａ）。这些结果 提示，在Ｍｉｄｋｉｎｅ高表达的肿瘤患者中，通过抑制其蛋 白表达可能抑制肿瘤的转移和侵袭。 本研究中虽然没有对分泌的Ｍｉｄｋｉｎｅ蛋白做功能 性研究，但有些研究证实已开始对分泌的Ｍｉｄｋｉｎｅ蛋 白研究＿１ ｊ。分泌的Ｍｉｄｋｉｎｅ蛋白研究还处于，初步 阶段希望更多的科学家们探索其研究。 ５ Ｉｋｅｍａｔｓｕ Ｓ．Ｙａｎｏ Ａ，Ａｒｉｄｏｍｅ Ｋ，ｅｔ ａ１．Ｓｅｒｕｍ ｍｉｄｋｉｎｅ ｌｅｖｅｌｓ ａｒｅ ｉｎ— ｃｒｅａｓｅｄ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ＶＳｒｉＯＵＳ ｔｙｐｅｓ ｏｆ ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ．Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ， ２０００，８３：７０１－７０６． ６ Ｍｕｒａｍａｔｓｕ Ｔ．Ｍｉｄｋｉｎｅ ａｎｄ ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｈｉｎ：ｔｗｏ ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｓｕｒｖｉｖａｌ，ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ．Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ，２００２， １３２：３５９－３７１． ７ Ｍａｔｓｕｂａｒａ Ｓ．Ｓｔｕｒｃｔｕｒｅ ｏｆ ａ ｒｅｔｉｎｏｉｅ ａｃｉｄ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｇｅｎｅ，ｍｋ，ｗｈｉｃｈ ｉｓ ｔｒａｎｓｉｅｎｔｌｙ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｏｆ ｅｍｂｒｙｏｎａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ— ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｍｉｄｇｅｓｔａｔｉｏｎ ｐｅｒｉｏｄ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ｒｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｊ Ｂｉｏｌｏｇｉ Ｃｈｅｍ，１９９０，２６５：９４４１－９４４３． ８ Ｍｕｒａｓｕｇｉ Ａ．Ｔｏｈｍａ．Ａｌｂａ Ｙ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎａｔｉｖｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｍｉｄｋｉｎｅ ｉｎ ｔｈｅ ｙｅａｓｔ，ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｉｆｃａｔｉｏｎ， ２０ｏ３．２７：２４４－２５２． ９ Ｋａｄｏｍａｔｓｕ ＫＪ，Ｍｕｒａｍａｔｓｕ Ｔ．Ｍｉｄｋｌｎｅ ａｎｄ ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｈｉｎ ｉｎ ｎｅｕｒｌａ ｄｅｖｅ１． ｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｃａｎｃｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２００４，２０４：１２７．１４３． １０ Ｇａｒｖｅｒ ＲＩ，Ｃｈａｎ ＣＳ，Ｍｉｌｎｅｒ ＰＧ．Ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｈｉｎ ｎａｄ ｍｉｄｋｉｎｅ ｉｎ ｎｏｒｎｌａｌ ｖｅｒｓｕｓ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｌｕｎｇ ｔｉｓｓｕｅｓ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌｒａ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９３，９：４６３－４６６． １１ Ｇａｒｖｅｒ ＲＩ．Ｍｉｄｋｉｎｅ ａｎｄ ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｈｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｎｏｒｍａｌ ａｎｄ ｍａｌｉｎｇａｎｔ ｂｒｅａｓｔ－ｔｉｓｓｕｅ．Ｃａｎｃｅｒ，１９９４，７４：１５８４．１５９０． １２ Ｋｏｎｉｓｈｉ Ｎ，Ｎａｋａｍｕｒａ Ｍ，Ｎａｋａｏｋａ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎａｌｙ－ ｓｉｓ ｏｆ Ｍｉｄｋｉｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，１９９９， ５７：２５３ ５７． １３ Ｙｅ ｃ，Ｑｊ Ｍ，Ｆａｎ ＱＷ，ｅｔ ａ１．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｉｄｋｉｎｅ ｉｎ ｔｈｅ ｅａｒｌｙ ｓｔａｇｅ ｏｆ ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ．Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ， １９９９，７９：１７９—１８４． １４ Ｎａｋａｇａｗａｒａ Ａ，Ｍｉｌｂｒａｎｄｔ Ｊ，Ｍｕｒａｍａｓｔｕ Ｔ，ｅｔ ａ１．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｘｐ￣＇ｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｈｉｎ ａｎｄ ｍｉｄｋｉｎｅ ｉｎ ａｄｖａｎｃｅｄ ｎｅｕｒｅｂｌａｓｔｏｍａｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， １９９５，５５：１７９２—１７９７． １５ Ｍｉｓｈｉｍａ Ｋ．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｉｄｋｉｎｅ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａｓ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９９７，２３３：２９ ３２． １６ Ｍａｅｄａ Ｓ，Ｓｈｉｎｃｈｉ Ｈ，Ｋｕｒａｈａｒａ Ｈ，ｅｔ ａ１．Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ｍｉｄｋｉｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｈｅａｄ ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ，２００７，９７： ４０５－４ｌ１． １７ Ｋａｉｆｉ ＪＴ．Ｍｉｄｋｉｎｅ ａｓ ａ ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｓｔｒｏｍａｌ ｔｕｍｏｒｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２００７，１３３： ４３１４３５． １８ Ｈｕａｎｇ Ｙ．Ｍｉｄｋｉｎｅ ｉｎｄｕｃｅｓ ｅｐｉｔｈｅｌｉｌａ－ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｔｈｒｅｕ ｇｈ Ｎｏｔｅｈ２／Ｊａｋ２－Ｓｔａｔ３ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ．Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ，２００８， ７：１６１３—１６２２． １９ Ｎｏｒｄｉｎ Ａ．Ｍｉｄｋｉｎｅ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ｄｉｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｃａｓｔｒａｔｉｏｎ—ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ．Ｐｒｏｓｔａｔｅ，２０１３，７３：６５７－６６７． （收稿日期：２０１６—０７—１２）
