人卵巢癌紫杉醇耐药细胞株的建立和生物学特性评价

学版）复里学报（医Ｆｕｄａｎ　Ｕｎｉｖ　Ｊ　ＭｅｄＳｃｉ２【ＵＵ０　ｉＶ１）（】８　Ｍａｒ，３５（２）ａＩ’Ｊ３　，　１７１　人卵巢癌紫杉醇耐药细胞株的建立　和生物学特性评价　韩丽妹　潘　弘　方晓玲　（　复旦大学药学院药剂教研室上海２０００３２；　上海医药（集团）有限公司上海２０００２０）　【摘要】目的建立人卵巢癌紫杉醇耐药细胞株（Ｓｋｏｖ－３／ＰＴＸ），并对其生物学性状进行检测和鉴定。方法采　用紫杉醇浓度梯度递增法，建立人卵巢癌紫杉醇耐药株。通过细胞形态学观察、生长曲线和群体倍增时间测定、　药物敏感试验、细胞内Ｒｈ－１２３和紫杉醇含量研究及ＭＤＲ１、ＭＲＰ和ＧＳＴ－ｎ　ｍＲＮＡ水平的测定，评价Ｓｋｏｖ－３／　ＰＴＸ生物学特性。结果成功建立了Ｓｋｏｖ－３／ＰＴＸ耐药株，耐药指数为４５．９０，对吉非替尼、９一硝基喜树碱和阿　霉素产生明显的交叉耐药性。与Ｓｋｏｖ－３细胞相比，Ｓｋｏｖ－３／ＰＴＸ耐药细胞异形明显；耐药细胞倍增时间显著延　长（Ｐ＜０．０５）；耐药细胞内Ｒｈ－１２３和紫杉醇量显著减少（Ｐ＜０．０５），环孢菌素可以增加细胞内Ｒｈ－１２３和紫杉醇　含量；耐药细胞的ＭＤＲ１、ＭＲＰ和ＧＳＴ＿　ｍＲＮＡ水平显著增高。结论性，为进一步研究耐药逆转途径提供了实验基础。　【关键词】多药耐药；紫杉醇；罗丹明一１２３；卵巢肿瘤；细胞株　【中图分类号】Ｒ　９４５　【文献标识码】Ａ　Ｓｋｏｖ－３／ＰＴＸ细胞具有典型多药耐药特　Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ　ａｎｄ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ—ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　．ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｏｖａｒｉａｎ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ＨＡＮ　Ｌｉ—ｍｅｉ　．ＰＡＮ　Ｈｏｎｇ　．ＦＡＮＧ　Ｘｉａｏ—ｌｉｎｇ　△　（　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｆｕｄａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ　２０００３２，Ｃｈｉｎａ；　Ｓｈａｎｇｈａｉ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ（Ｇｒｏｕｐ）Ｃｏ．，Ｌｔｄ，Ｓｈａｎｇｈａｉ　２０００２０，Ｃｈｉａ）ｎ　［Ａｂｓｔｒａｃｔ］　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈ　ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ—ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｏｖａｒｉａｎ　ｃａｎｃｅｒ（Ｓｋｏｖ一３／　ＰＴＸ）ａｎｄ　ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｉｔｓ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｆｅａｔｕｒｅｓ．　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｐａｃｌｉｔａｘｅｈ　ｅｓｉｓｔａｎｔ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　Ｏ—　ｖａｒｉａｎ　ｃａｎｃｅｒ（Ｓｋｏｖ－３／ＰＴＸ）ｗａｓ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ　ｂｙ　ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ　ｓｔｅｐｗｉｓｅ　ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａ—　ｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐａｃｌｉｔａｘｅ１．Ｃｅｌｌ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ，ｇｒｏｗｔｈ　ｃｕｒｖｅ　ａｎｄ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ　ｄｏｕｂｌｉｎｇ　ｔｉｍｅ，ｃｅｌｌ　ｕｐｔａｋｅ　ｏｆ　Ｒｈ－１２３　ａｎｄ　ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ，ｍＲＮＡ　ｌｅｖｅｌ　ｏｆ　ＭＤＲ１，ＭＲＰ　ａｎｄ　ＧＳＴ一７ｃ　ｗｅｒｅ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ　ｔｏ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ　ｔｈｅ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｆｅａｔｕｒｅｓ　ｏｆ　Ｓｋｏｖ－３／ＰＴＸ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ．　ＲｅｓｕｌＩｓ　Ｔｈｅ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｉｎｄｅｘ（ＲＩ）ｏｆ　Ｓｋｏｖ－３／ＰＴＸ　ｃｅｌｌｓ　ｗａｓ　ｕｐ　ｔｏ　４５．９０．Ｔｈｅｙ　ｓｈｏｗｅｄ　ａｎ　ｏｂｖｉｏｕｓ　ｃｒｏｓｓ—ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｔｏ　ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ，９－ｎｉｔｒｏｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ　ａｎｄ　ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ｕｐｔａｋｅ　ｏｆ　Ｒｈ＿１　２３　ａｎｄ　ＰＴＸ　ｆｕｒｔｈｅｒ　ｐｒｏｖｅｄ　ｔｈａｔ　Ｓｋｏｖ－３／ＰＴＸ　ｃｅｌｌｓ　ｈａｄ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｔｏ　Ｒｈ－１２３　ａｎｄ　ＦｒｒＸ，ａｎｄ　Ｐ－ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ　ｓｕｂｓｔｒａｔｅ，ＣｓＡ　ｃｏｕｌｄ　ｉｎｃｒｅａｓｅ　ｔｈｅ　ｕｐｔａｋｅ　ｏｆ　ｄｒｕｇ　ｉｎ　ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ｃｅｌｌｓ．ＰＴ－ＰＣＲ　ｓｔｕｄｉｅｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｌｅｖｅｌｓ　ｏｆ　ＭＤＲ１，ＭＲＰ　ａｎｄ　ＧＳＴ一７ｃ　ｍＲＮＡ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｓｋ－　ｏｖ－３／ＰＴＸ　ｃｅｌｌｓ　ｗｅｒｅ　ｈｉｇｈｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈｅ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ｃｅｌｌｓ．　Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ　Ｓｋｏｖ－３／ＰＴＸ　ｃｅｌｌｌｉｎｅ　ｓｈｏｗｓ　ｔｙｐｉｃａｌ　ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ　ａｎｄ　ｍｉｇｈｔ　ｓｅｒｖｅ　ａｓ　ａｎ　ｉｄｅａｌ　ｍｏｄｅｌ　ｆｏｒ　ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ　ｔｈｅ　ｎｅｗ　ｒｏｕｔｅ　ｏｆ　ｒｅ—　ｖｅｒｓｉｎｇ　ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．　［Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ］ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ；ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ；　ｒｈｏｄａｍｉｎｅ－１　２３；　ｏｖａｒｉａｎ　ｎｅｏｐｌａｓｍｓ；　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ　恶性肿瘤表现出来的耐药性一直是化学治疗失　败的主要原因之一。肿瘤多药耐药（ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ　ｒｅ—　胞防御机制，是指肿瘤细胞对一种化疗药物耐药的　同时也对与其结构无关、作用机制不同的其他药物　产生交叉耐药的现象　引。克服肿瘤多药耐药性，　ｓｉｓｔａｎｃｅ，愀）是肿瘤细胞免受药物攻击的重要细　国家自然科学基金项目（３０４７２０９４）　ＡＣｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ａｕｔｈｏｒ　Ｅ－ｍａｉｌ：ｘｌｆａｎｇ＠ｓｈｍｕ．ｅｄｕ．ｅｎ　维普资讯 http://www.cqvip.com

１７２　寻找逆转恶性肿瘤细胞多药耐药的新途径，提高肿　瘤细胞对化疗的敏感性是当前肿瘤领域的重要课题　之一。成功建立耐药肿瘤细胞模型是开展此研究的　前提和基础。本文采用浓度梯度递增法，建立了人　卵巢癌紫杉醇耐药细胞株Ｓｋｏｖ－３／ＰＴＸ，并对其生　物学性状进行检测和鉴定。　材料和方法　材料Ｓｋｏｖ－３卵巢癌细胞株：购自中国科学院　上海细胞生物学研究所；紫杉醇（ＰＴＸ）：含量　９９．１　，西安三江生物工程有限公司；阿霉素　（Ｄｏｘ）：浙江海正药业有限公司；９一硝基喜树碱（９一　ＮＣ）：含量９９．５　，上海艾斯可生物技术有限公司；　甲氨蝶呤（ＭＴＸ）：上海华联制药厂；５一氟脲嘧啶（５一　ＦＵ）：中国药品生物制品检定所；吉非替尼（Ｇｅｆ）：中　国药品生物制品检定所；地西泮：对照品，中国药品　生物制品检定所；罗丹明一１２３（Ｒｈ－１２３）：荧光纯，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ，ＵＳＡ；四甲基偶氮唑蓝　（ＭＴＴ）：≥９７．５　ＴＬＣ，Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ。　细胞常规培养条件细胞按一定密度接种到卡　氏培养瓶中，置于３７℃、５　Ｃ０２（相对湿度９０％）　培养箱中培养，约２～３　ｄ更换１次培养液。培养液　为含１Ｏ９／６胎牛血清、１　９，６非必需氨基酸、１　９，６谷氨酰　胺和１　青链霉素的高糖ＤＭＥＭ培养基。　Ｓｋｏｖ－３／ＰＴＸ耐药株的诱导　采用浓度梯度递　增法建立人卵巢癌ＰＴＸ耐药细胞株［５　］。取对数　生长期的Ｓｋｏｖ－３细胞，加入含ＰＴＸ的ＤＭＥＭ培养　液，连续作用４８　ｈ后，用Ｈａｎｋ’Ｓ平衡盐溶液洗涤１　次，更换无ＰＴＸ的新鲜培养液继续生长，见大部分　细胞死亡，存活细胞生长缓慢。待细胞密度达７０　～８０　时传代１次，培养至对数生长期后再次给予　含药培养液，再逐步提高培养液中的药物浓度，耐药　株诱导剂量及过程如下：　２　ｎｇ／ｍＬ２　ｇ５　ｎｇ／ｍＬ　１０　ｎｇ／ｍＬ邀１５　ｎｇ／　ｍＬ邀２０　ｎｇ／ｍＬ　ｉ３ｇ３０　ｎｇ／ｍＬ　４０　ｎｇ／ｍＬ　５０　ｎｇ／ｍＬ邀耐药株Ｓｋｏｖ－３／ＰＴＸ　敏感细胞逐渐死亡，而耐药细胞继续生长。如　此反复诱导、换液、传代，历时约１１月，最终得到在　５０　ｎｇ／ｍＬ　ＰＴＸ中稳定生长增殖的耐药株，命名为　Ｓｋｏｖ－３／ＰＴＸ。将该细胞冻存２月后复苏，在不含　ＰＴＸ的培养液中反复传代２月以上仍基本保持原　来的耐药性。　耐药株形态学观察　于倒置显微镜下观察细　胞形态。Ｓｋｏｖ－３和Ｓｋｏｖ－３／ＰＴＸ细胞生长曲线和　群体倍增时间的测定［８］以细胞密度２　Ｘ　１０　ｃｅｌｌｓ／　复旦学报（医学版）２００８年３月，３５（２）　ｍＬ接种于２４孔培养板，连续８　ｄ，每日取３孔计　数，绘制细胞生长曲线，根据Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ公式，计算　群体倍增时间，　＝Ｔｌｇ２／ｌｇ（Ｎ／Ｎｏ），Ｔ为培养时　间，Ｎ为该时刻的细胞数，Ｎ，为起始细胞数。　药物敏感试验（ＭＴｒ法）　将Ｓｋｏｖ－３和Ｓｋ—　ｏｖ－３／ＰＴＸ细胞以３　Ｘ　１０　ｃｅｌｌｓ／：￣ｌ，接种于９６孔板，　４８　ｈ后分别加入不同浓度化疗药物，每一浓度平行　３孔。培养４８　ｈ后弃去上清液，每孔加５　ｍｇ／ｍＬ的　ＭＴＴ液２０　Ｌ，继续培养４　ｈ后小心弃去上清液，　每孔加２００　Ｌ　ＤＭＳＯ，避光振荡１０　ｍｉｎ使结晶物　充分溶解。以酶标仪检测４９０　ｎｍ处的吸光度值　（Ｄ），参比波长为６３０　ｎｍ，计算细胞存活率（ＩＣ）。　用Ｌｏｇｉｓｔｉｃ模型拟合量效关系，求半数抑制浓度　ＩＣ５０Ｄｏ］。耐药指数（ＲＩ）：ＩＣ５０（Ｓｋ０　ｍ【）／ＩＣ５【）（Ｓｋ０吲。　细胞内紫杉醇量　处于对数生长期的Ｓｋｏｖ－３　和Ｓｋｏｖ＿３／ＰＴＸ细胞分别加入１　ｍＬ含药培养基，　置３７℃的培养箱中孵育４５　ｍｉｎ后，加入预冷（４℃）　Ｈａｎｋ’Ｓ液终止细胞摄取，并快速清洗细胞３遍。　收集细胞，加入适量去离子水，将细胞超声粉碎。一　部分采用ＨＰＬＣ法测定ＰＴＸ含量，一部分用考马　斯亮蓝法测定细胞蛋白含量。　细胞内罗丹明－１２３量处于对数生长期的Ｓｋ—　ｏｖ－３和Ｓｋｏｖ－３／ＰＴＸ细胞分别加入１　ｍＬ含药培养　基，３７℃孵育４５　ｍｉｎ，用预冷（４℃）的Ｈａｎｋ’Ｓ液洗　涤细胞４次，除去细胞外吸附的荧光染料。用荧光　显微镜观察细胞内Ｒｈ－１２３的荧光强度。　ＲＴ－ＰＣＲ测定细胞ＭＤＲ１、ＭＲＰ和ＧＳＴ－ｎ　ｍＲ－　ＮＡ水平［１Ｉ．ｎ］总ＲＮＡ提取：取对数生长期的Ｓｋ－　ｏｖ－３和Ｓｋｏｖ－３／ＰＴＸ细胞用Ｔｒｉｚｏｌ试剂盒提取细　胞总ＲＮＡ，合成ｅＤＮＡ。ＰＣＲ［¨］反应条件为：９４℃　预变性３　ｍｉｎ，９４℃变性４０　Ｓ，退火温度５５℃，退火　３０　Ｓ，７２℃延伸３０　Ｓ，共进行３５个循环，７２℃再延　伸４　ｍｉｎ。ＰＣＲ引物见表１—１。用２　琼脂糖电泳　观察ＰＣＲ产物，［３－ａｃｔｉｏｎ为内参基因。　表１　Ｐ（　引物序列、退火温度及片段长度　Ｔａｂ　１　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ｆｏｒ　ＰＣ＇Ｒ　结　；日　果　不　形态学观察Ｓｋｏｖ－３细胞边缘清晰，生长均匀，　维普资讯 http://www.cqvip.com

韩州妹等人卵巢癌紫杉醇耐药细胞株的建立和生物学特性评价，．呈梭形，。而Skov3PTX细胞较亲代细胞重叠聚集／、著性差异(P(P<()05)．>()05)．，在1《)25、、5(’／,gmI／剂量组。，增多胞质空泡形成和颗粒增多细胞伸出许多不规，耐药细胞和亲本细胞中的药物量均有显著性差异，则树突状分支整体呈现蜘蛛状或星状(图1)，。亲本细胞中的药物量显著高于耐药细2)。胞且剂量越高差异越显著(图，单独给予50>g，。PTXv，当药物浓度由5()05)．t~gmL增加至／mI／时Sko，3PTX细胞内的／。PTX量略有增加但没有显著性差异(P>同时给予浓度为耐药细胞内的加(见图()992)．Skov3PTX／。细胞对药物的耐药性可能是产生该结果的原因10tlm在后，oL的PgPl／底物CsAPTX5～量在各个浓度组均出现显著增25t~gm／3)。在，I。浓度范围内随着药，物浓度的升高细胞内药物量呈线性增加。(，一=以上结果说明Sko显著耐药性图1。v3PTX细胞对PTX存在／光学显微镜观察Opticalgraph：Skoov3vFIX细胞形态和Skov3／．Fig1ACfSko；3vandSkovPFX3／10K)4(1K)；cells—6c一。¨。-#j_岛。_口0∞4∞I)＼28，】凹广_10T_O6．—c—u_。-—皇＼j丑∞一∞28≈～4SkoSkov3(××1【】K)4l】K)一BD：SkoSk3／PTX(3／PTX(××：v3(；：ovSkov一3PTX细胞生长曲线和群体倍和Skov3／增时间的测定～细胞生长曲线显示两种细胞在，，78d达到峰值Skov3．和Sko7±2．v3PTX细胞的群／体倍增时间分别为(30h．3)h和(45．3±2．．8)，耐药细胞倍增H~lhJ比亲代细胞延长了【)05)．471％其5iug／mL10pg／mL25pg／mL50~g／mI一．生长增殖明显减慢(P(、sA后耐药细胞内显现明显红色荧光．。此结果表性且该细胞。Pgp活性较高。明Skov3PTX细胞对Rh／123具有明显交叉耐药佃R吼胁疗p图Fig4、：5．4罗丹明rosco~o一123在oSkov3和Skov3FrX细胞中的量／nFluo~rescencemicpygraph。fRh123accumulatio．inSkov3andSkoanPv删m眦PTX3／ce、llsv’3IIX’flf㈣ollRI>123inSko，3cells=Ij：5【l／m．1Rlrl23inSkol／v3t’IXcells；C：50lm~ol／IRlv123。d1【l／,n~olI(。sAinSkocellsRTPCR—测定细胞MDRl、MRP。和GSTTt弱；而耐药株Sko和GSTv3PTX均见清晰／．MDRl、MRPmRNA．水平内参f3actin各条带清晰亮度较Sko一兀mRNAv电泳条带条带亮度显著高于亲Sko致故各目的条带的亮度强弱可以代表各目的基因本细胞胞SkoSkol3，即耐药株v3PTX的耐药相关／的水平强弱(图未出现电泳条带5)，。亲本细胞和(jSTv3上的MDRl基因MDRv、MRP和GST丌水平显著高于亲本细MRP7【mRNA的条带较3。bpbpl002(】03001船3000驯嚣800ABGS■Ⅱ8．actinC图Fig5A25RFPCR’测定细胞sMDRI、MRPamv和GSTo：nmRNAa水平r％agarosegelM：electrophoresisarhowingthevplicons3／I’TXbtainedA：fte；RI：：IR2R；am、plification—PCRMker：1：Sko3；2：SkoMI)R1vlJMRP(：(jSI丌耐药细胞Sko，3PTX巾／Rh123含量较亲本细胞o讨论~m显著降低同时给予P精蛋白抑制剂1(’／l／I，CsA后，耐药细胞中Rh123。含量的显著增加均表步证明Sko3／本研究中我们通过紫杉醇浓度梯度递增法以Sko11v明该耐药株PPTXgp活性较高3．细胞为亲本反复诱导换液传代历时约，、、，细胞内紫杉醇含量测定进一v月建立了在PTX50ngmLPTX中稳定生长增殖的／v对PTX会产生显著耐药性，。引起多药耐药的l)卵巢癌耐药细胞株(Sko45．3PTX)／、。其对紫杉机制比较复杂包括多药耐药基因(MDR的过度过度表醇耐药指数达9【)，且对吉非替尼。9v-硝基喜树碱3表达引起其编码的细胞膜，P糖蛋白(P；gP)达；多药耐药相关蛋白的过度表达(GSH)和谷胱甘肽S谷胱甘肽和阿霉素产生明显交叉耐药性，，SkoPTX细胞／，异形明显生长速度减慢倍增时间延长表明肿瘤转移酶((jST)活性增高；DNA修复功能增强；凋亡抗性增加及蛋白激酶C(PKC)活性增高等m“…。细胞受到损伤减慢，。其中“MDRl”，的过度表达产生的RTPCR罗丹明123(Rh123)是Pgp的底物因而可，PgP可将细胞内药物泵出从而导致细胞内药物DR通过检测细胞内Rh123浓度研究PgP活性_1。一“。浓度降低是M的主要产生机制。研究维普资讯 http://www.cqvip.com

韩丽妹，等．人卵巢癌紫杉醇耐药细胞株的建立和生物学特性评价　１７５　表明该耐药株的ＭＤＲ１、ＭＲＰ和ＧＳＴ－￣ｍＲＮＡ水　平均显著高于亲本细胞。故Ｓｋｏ、卜３／ＰＴＸ对ＰＴＸ　产生的高度耐药性可能与Ｐ－ｇｐ、ＭＲＰ和ＧＳＴｌｒ的　高度表达有关。　参考文献　［１］　Ｂｏｓｃｈ　Ｉ，Ｃｒｏｏｐ　Ｊ．Ｐ－ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ　ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ａｎｄ　ｃａｎｃｅｒ口］．ＢＢＡ－ＲｅｖＣａｎｃｅｒ，１９９６，１２８８（２）：Ｆ３７一Ｆ４９．　［２］　Ｔａｋａｒａ　Ｋ，Ｓａｋａｅｄａ　Ｔ。Ｏｋｕｍｕｒａ　Ｋ　Ａｎ　ｕｐｄａｔｅ　ｏｎ　ｏｖｅｒｃｏ—　ｍｉｎｇ　ＭＤＲ１一ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｉｎ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｈｅｍｏ－　ｔｈｅｒａｐｙ口］．Ｃｕｒｔ　Ｐｈａｒｍ　Ｄｅｓｉｇｎ，２００６，１２（３）：２７３—２８６．　［３］　Ｌｅｈｎｅｒｔ＾，Ｌ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｉｎ　ｃａｎｃｅｒ：Ａ　ｍｕｌｔｉ—　ｆａｃｔｏｒｉａｌ　ｐｒｏｂｌｅｍ　Ｉ－Ｊ］．Ｆｕｒ　Ｊ　Ｃａｎｃｅｒ，１９９６，３２Ａ（６）：９１２—　９２０．　［４］　Ｍａｒｔｉｎ　Ｎ，Ｃａｔａｌｉｎ　Ｊ，Ｂ１ａｃｈｏｎ　ＭＦ，ｅｔ　ａ１．Ａｓｓａｙ　ｏｆ　ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ　（Ｔａｘｏ１）ｉｎ　ｐｌａｓｍａ　ａｎｄ　ｕｒｉｎｅ　ｂｙ　ｈｉｇｈ－ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　ｌｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏ—　ｍａｔｏｇｒａｐｈｙＩ－Ｊ］．ＪＣｈｒｏｍａｔｏｇｒＢ，１９９８，７０９（２）：２８１—２８８．　［５］　程国钧，田方，李亚里，等．应用ｍＲＮＡ差异显示技术筛选　卵巢癌耐药相关基因Ｉ－Ｊ］．中华医学杂志，２０００，８０（７）：５４１　—５４３．　［６］　Ｐａｒｅｋｈ　Ｈ，Ｗｉｅｓｅｎ　Ｋ。Ｓｉｍｐｋｉｎｓ　Ｈ．Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔａｘｏｌ　ｒｅ—　ｓｉｓｔａｎｃｅ　ｖｉａ　Ｐ－ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ－ａｎｄ　ｎｏｎ－Ｐ—。ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ—。ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｏｖａｒｉａｎ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，１９９７，５３（４）：４６１—４７０．　［７］　Ｓｈａ　ＸＹ，Ｆａｎｇ　ＭＬ　Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　ｏｆ　９－ｎｉｔｒｏｃａｍｐ—　ｔｏｔｈｅｃｉｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｈｕｍａｎ　ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ　Ｃａｃｏ－２　ａｎｄ　ｅｖｅｒｔｅｄ　ｇｕｔ　ｓａｃｓ１，Ｊ］．ＩｎｔＪ　Ｐｈａｒｍ，２００４，２７２（１—２）：１６１—１７１．　［８］　周友珍，陈惠祯，杨庆忆，等．人卵巢癌顺铂耐药细胞株的　建立及其耐药机制的研究Ｉ－Ｊ］．中华医学杂志，１９９６，７６（９）：　６８０—６８３．　［９］章静波．组织和细胞培养技术Ｉ－Ｍ］．北京：人民卫生出版社，　２００２：１１１．　［１０］王楠，赵德化，盛宝恒．一个用ｌｏｇｉｓｔｉｃ模型分析量效关系的　程序Ｉ－Ｊ］．中国药理学报，１９９０，１１（２）：１８７—１９２．　［１１］Ｄｅ　Ｐａｕｌａ　ＳＯ，Ｄｅ　Ｍｅｌｏ　Ｌｉａｍ　Ｃ，Ｔｏｒｒｅｓ　ＭＰ，ｅｔ口ｆ．Ｏｎｅ－ｓｔｅｐ　ＲＴ—ＰＣＲ　ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｍｐｒｏｖｅ　ｔｈｅ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ｄｅｎｇｕｅ　ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　ｃｏｍ～　ｐａｒｅｄ　ｔｏ　ｔｗｏ－ｓｔｅｐ　ＲＴ－ＰＣＲ　ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ［Ｊ］．Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｖｉｒｏｌ，　２００４，３０（４）：２９７—３０１．　［１２］程国钧，李亚里，田方，等．不同方式诱导人卵巢癌顺铂耐　药细胞株的比较Ｉ－Ｊ］．中华肿瘤杂志，２００１，２３（４）：３０５—　３０８．　［１３］臧国庆，周霞秋，王朝夫，等．肿瘤坏死因子一ａ介导凋亡肝一　细胞内胱门蛋白酶一３的表达口］．中华传染病杂志，２００１，１９　（４）：２３２—２３５．　［１４］Ｓｔｏｒｍｅｒ　Ｅ，Ｐｅｒｌｏｆｆ　ＭＤ，Ｖｏｎ　Ｍｏｌｔｋｅ　ＬＬ，ｅｔ　ａ１．Ｍｅｔｈａｄｏｎｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｓ　ｒｈｏｄａｍｉｎｅ１２３　ｔｒａｎｓｏｐｒｔ　ｉｎ　Ｃａｃｃｒ２　ｃｅｌｌｓ　Ｉ－Ｊ］．Ｄｒｕｇ　Ｍｅｔａｂ　Ｄｉｓｐｏｓ，２００１，２９（７）：９５４—９５６．　－１１５］Ｊｉｎ　Ｊ，Ｗａｎｇ　ＦＰ，Ｗｅｉ　ＨＬ，ｅｔ　ａ１．Ｒｅｖｅｒｓａｌ　ｏｆ　ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ　ｒｅ．—　ｓｉｓｔａｎｃｅ　ｏｆ　ｃａｎｃｅｒ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐ－ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ　ｂｙ　５一　ｂｒｏｍｏｔｅｔｒａｎｄｒｉｎｅ［Ｊ］．Ｃａｎｃｅｒ　Ｃｈｅｍｏｔｈ　Ｐｈａｒｍ，２００５，５５　（２）：１７９—１８８．　，１１６］Ｓａｎｄｓ　Ｈ，Ｍｉｓｈｒａ　Ａ，Ｓｔｏｅｃｋｌｅｒ　ＪＤ，ｅｔ　ａ１．Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ａｎ　ｖ．ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒｕｂｉｔｅｃａｎ　ｉｎ　ＩＤＤ－Ｐ（ＴＭ）ａｇａｉｎｓｔ　ｈｕｍａｎ　ｓｏｌｉｄ　ｔｕｍｏｒ　ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ１，Ｊ］．Ａｎｔｉ－Ｃａｎｃｅｒ　Ｄｒｕｇ，２００２，　１３（９）：９６５—９７５．　，１１７］赵健竹，赵文嫣．多药耐药机制的探究Ｉ－Ｊ］．现代医药卫生，　２００７，２５（１６）：２　４３３—２　４３５．　，１１８］李国青，张育．肿瘤多药耐药机制的研究进展Ｉ－Ｊ］．现代肿瘤　医学，２００５，１３（６）：８４１—８４３．　（收稿日期：２００７—０９—２２；编辑：王蔚）