发酵工程综合实验报告 (1)

《发酵工程综合实验》实验报告

实验题目：蛋白酶产生菌的分离筛选与培养优化

姓 名 学 号 院 系

专 业 生物技术 年 级 13级 任课教师

2015年 12 月 25 日

《发酵工程综合实验》实验报告

1 实验目的

1、学习从土壤样品中分离筛选蛋白酶产生菌的基本技术及测定蛋白酶活力的方法。

2、掌握富集、平板稀释涂布法、平板划线培养法分离筛选蛋白酶产生菌的基本原理。

3、掌握蛋白酶产生菌培养优化的原理与方法。 4、熟悉用正交实验优化发酵培养基的方法。 5、了解蛋白酶产生菌生产的实际意义。

2 实验原理

蛋白酶产生菌的分离筛选：在土壤中有许多细菌和霉菌能产生蛋白酶，本实验将土壤样品悬液稀释进行划线分离得到可能含有目的菌株的菌落，将其接种到酪蛋白平板上进行培养，根据酪蛋白平板的水解圈作初筛。将初筛的蛋白酶产生菌接入产酶培养基进行培养，测定蛋白酶的活力，最终筛选到产蛋白酶的目的菌。

蛋白酶活力测定原理：蛋白质或多肽在275nm波段处具有最大吸收值，利用蛋白酶同酪蛋白底物反应前后在三氯乙酸中可溶物的紫外吸收增值，可表示蛋白酶活力高低。

蛋白酶产生菌的培养优化：本实验采用正交实验进行目的菌株的培养优化方案。正交实验是利用已经设计好的表格“正交表”来安排、实验并进行数据分析的一种方法。

数据处理可采用直观分析法（极差分析法），通过对每一因素的平均极差来分析问题。

3 实验材料

3.1 实验试剂

葡萄糖、乳糖、蔗糖、蛋白胨、尿素、酪氨酸、酵母膏、碳酸钠、琼脂粉、牛肉膏、硫酸铵、硫氨酸、三氯乙酸、氯化钙、氯化钠、MgSO4、KH2PO4、K2HPO4、 3.2 实验设备

250ml三角瓶、150ml三角瓶、10ml移液管、1ml吸头、酒精灯、大烧杯、试管、量筒、高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、恒温培养箱、恒温振荡培养箱、分光光度计、电炉、水浴锅、离心机、漏斗、滤纸、培养皿。

4 实验步骤

（一）配制所需培养基及灭菌

1、按照以下配方配制所需的培养基 （1）、牛肉膏蛋白胨培养基（分离培养基）200mL：牛肉膏 0.5g、蛋白胨 1g、NaCl 0.5g、琼脂 1.5g、水 100ml、pH 7.2。 （2）、酪蛋白固体培养基(筛选培养基）200mL：葡萄糖1g、酪蛋白3g、NaCl 0.5g、琼脂 2.0g、水 100ml、pH 7.0～7.2。 （3）、酪蛋白液体培养基（产酶培养基）200mL：葡萄糖2g、蛋白胨2g、NaCl0.5g、 水 100ml，pH 7.0～7.2。

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（4）、将配制好的培养基放入高压蒸汽灭菌锅中经20min高压灭菌。 （二）分离与筛选 1、分离 （1）、采集土壤样品10g，用无菌水制备1:10土壤悬液100ml。 （2）、取8支试管，用无菌移液管吸取1mL菌悬液1mL，放入装有9mL无菌水的试管中吹吸数次混匀后即为10-1。再用无菌移液管吸取10-1的菌悬液1mL放入装有9mL无菌水的试管中，吹吸数次混匀即为l0-2稀释液。如此重复，可依次制成10-3--10-8的稀释度并编号1--6。 （3）、涂布平板：取编号1--6试管菌悬液0.1--0.2ml分别滴在牛肉膏蛋白胨培养基（分离培养基)表面的中央位置，用涂布棒涂布均匀并对应编号1--6。37℃恒温培养36h并记录生长情况。

2、筛选 （1）、对长出的单菌落进行编号，选择表面干燥、粗糙、不透明的菌落，挑取少许菌苔在酪蛋白固体培养基（筛选培养基）上进行划线接种，根据酪蛋白平板上的水解圈作初筛。

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（2）、选择水解圈直径与菌落直径比值大的菌，接入酪蛋白液体培养基(产酶培养基），37℃，140rpm摇床上震荡培养12h，将发酵液于5000rpm离心10min，取其上清液为酶液进行蛋白酶活力的测定。

（三）蛋白酶产生菌酶活力测定 1、蛋白质或多肽在275nm波段处具有最大吸收值，利用蛋白酶同酪蛋白底物反应前后在三氯乙酸中可溶物的紫外吸收增值，可表示蛋白酶活力高低。 2、绘制标准曲线：

项目 100ug/ml酪氨酸溶液（ml) 酪氨酸的浓度（ug/ml） PH8.0磷酸缓冲液（ml) 0.4mol/l三氯乙酸（ml) 0 0 0 6 5 1 0.1 10 5.9 5 2 0.2 20 5.8 5 3 0.3 30 5.7 5 4 0.4 40 5.6 5 5 0.5 50 5.5 5 6 0.6 60 5.4 5 测定步骤：取7支试管按上表加入试剂并混匀，40℃保温20分钟，用滤纸过滤，滤液用紫外分光光度计测定275nm的吸光值。将1--6号管所测得的光密度（OD）减去0号管所测得的光密度为净OD值。以此酪氨酸OD275数据绘制标准曲线。

3、测定蛋白酶活步骤：取5mL用pH8.0磷酸缓冲液制备的0.6%酪蛋白溶液于试管中，40℃预热2min后加入1:20以pH8.0磷酸缓冲液稀释的酶液1mL，40℃反应10min后，加5mL0.4mol/L三氯乙酸以终止反应，并沉淀残余底物，40℃保温20min使沉淀完全，用漏斗加滤纸过滤，滤液用紫外分光光度计测定275nm的吸光值。

另外以先加三氯乙酸使酶失活、后加酪蛋白的试管，按上述同样步骤测定吸光度，作为空白对照。 （四）产酶条件优化

1、碳源对产酶的影响：在基础培养基中其他成分不变，选用3种浓度为1%的不同的碳源，分别为乳糖、蔗糖、葡萄糖，37℃、140 rpm摇床上培养12h，测其酶活。

2、氮源对产酶的影响：在基础培养基中加入最优碳源，氮源改用3种浓度为1.5%的不同的氮源，分别是尿素、硫酸铵、蛋白胨，其他成分不变，37℃、140 rpm摇床上培养12h，测其酶活。

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3、pH值对产酶的影响：在基础培养基中加入最优碳源、氮源，选用3种不同的pH，分别是pH 6、pH 7、pH8，其他成分不变，37℃、140 rpm摇床上培养12h，测其酶活。

4、MgSO4对产酶的影响：在基础培养基中加入最优碳源、氮源，采用最优pH值,MgSO4浓度改用为0.2g/L、0.3g/L、0.4g/L，其他成分不变，37℃、140 rpm摇床上培养12h，测其酶活。

5 实验结果与分析

1、实验测得0-6号管的吸光度（OD275），第一次测得分别为：0.004、 0.022、0.040、0.052、0.066、0.082、 0.094；第2次测得分别为：0.002、0.018、0.032、 0.052、0.064、0.078、0.096。

管号 吸光度 第一次 第二次 平均值 0 0.004 0.002 0.003 1 0.022 0.018 0.020 2 0.040 0.032 0.036 3 0.052 0.052 0.052 4 0.066 0.064 0.065 5 6 0.082 0.094 0.078 0.096 0.080 0.095 酪氨酸OD275标准曲线

0.120 0.100 0.080 0.060 0.040 0.020 0.000 0 10 20 30 40 50 60 y = 0.0015x +0.003吸光度OD275酪氨酸的浓度（ug/ml）

对初始产酶培养基经过24h的发酵培养后所得到的蛋白酶液测取酶活力，空白对照组与实验组的吸光度分别为0.003与0.058。

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2、蛋白酶活力计算公式：

蛋白酶活力（u/mL）= (A×N×4)/10

式中：A ——由样品测得OD值，查标准曲线得相当的酪氨酸微克数； 4 ——4毫升反应液取出1mL测定（即4倍）； N ——酶液稀释的倍数，本实验为20倍; 10——反应10min.

根据公式求得酶活力为308.8u/ml.

3、蛋白酶产生菌的培养条件优化采用正交试验方法，共进行了9组实验，接入蛋白酶产生菌后放入摇床，在37℃、100r/min下培养24h后进行酶活检测，检测及分析结果如下表：

组号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 空白组吸光值 0.005 0.009 0.000 0.004 0.004 0.006 0.009 0.001 0.000 实验组吸光度 0.083 0.042 0.024 0.079 0.035 0.035 0.078 0.052 0.031 4、将实验组吸光度减去空白组吸光度即为净吸光度，由酶活标准曲线公式：y = 0.0015x +0.003，即可得相当的酪氨酸微克数，再由蛋白酶活力计算公式可得每组的酶活力值。计算结果如下正交实验表：

编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 K1 K2 K3 k1 k2 k3 极差R 主次顺序 碳源（1%） 氮源（1.5%） MgSO4（g/L） 葡萄糖 蛋白胨 0.2 葡萄糖 硫酸铵 0.3 葡萄糖 尿素 0.4 蔗糖 蛋白胨 0.3 蔗糖 硫酸铵 0.4 蔗糖 尿素 0.2 乳糖 蛋白胨 0.4 乳糖 硫酸铵 0.2 乳糖 尿素 0.3 672.0 1136.0 794.7 672.0 757.0 224.0 224.0 252.3 28.3 565.3 693.3 400.0 613.3 378.7 264.9 188.4 231.1 133.3 204.4 245.4 60.5 氮源>MgSO4>碳源>PH值 6

PH 6 7 8 8 6 7 7 8 6 698.6 650.7 752.0 232.9 216.9 241.7 24.8 酶活力 400.0 160.0 112.0 384.0 149.3 138.7 352.0 256.0 149.3 《发酵工程综合实验》实验报告

最优水平 最优组合 葡萄糖 蛋白胨 0.2 6 葡萄糖+蛋白胨+0.2g/L的MgSO4+PH6 6 总结与思考

在这次实验中，我们在确定了选题之后，通过网络查找各种文献，最终确定了实验方案，然后开始实验，并最终实验成功。在实验过程中小组成员都很好的完成了自己的实验分工，并且大家团结配合，尽力使实验已最短的时间完成。

由于这次实验只有一周的时间，再加上步骤比较多，所以我们做的非常小心，因为如果其中一步出现错误的话，那么即使重新开始实验，时间也会来不及。在第一天，由于实验药品还没有全部找到，因此我们首先寻找整理实验所需要的器材，并上报试验所需各种药品。之后清理所要用到的试管，培养皿。为接下来的实验做好准备。

首先我们需要配置培养基，这一步没有什么大的问题，实验顺利完成。但是在菌悬的稀释处可能出现了问题，导致在后续挑选菌落的时候发现只有一个培养基中出现了菌落。由于培养基是同次配置，问题只可能出现在菌落稀释或涂布过程中。加下来我们进行平板划线并筛选所需菌种。之后的实验步骤没有出现什么问题。测定酶活是实验最繁琐的步骤，药品的称量和离心过程出现的问题总是让我们担心实验是不是已经失败了。还好实验都能够顺利进行，最终在测完吸光度后，我们完成了整个实验。

这次实验是我们自己设计的，因此和以往的实验有很大的不同。实验中遇到的各种问题，都只能通过自己分析原因和提出解决办法。因此我觉得这次实验对我有很大的提高。自己设计实验也对自己有更高的要求，要对实验原理有很深的理解。要能懂得每一步的原理和作用才能在出现问题后分析出正确的原因并尝试提出解决办法。我觉得这就是我最大的收获。

参考文献

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[1]孙剑秋,刘井权,臧威,等．制酱用蛋白酶产生菌的分离和鉴定[J]．中国酿造，2005-6-20，17(1)：84～86．

[2]于宏伟，栗志丹，郝姗姗，等.蛋白酶的筛选及酶学性质研究[J].农产品加工·学刊，2006,68～70.

[3]晏爱芬,余丽.1株蛋白酶产生菌的分离及生理特征研究[M]．安徽农业科学，2011-3-1：153～167．

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[5]杨旭,屈小玄,郭庆贺,等 . 牛奶中蛋白酶活力测定的方法比较[J]. 中国乳品工业 , 2014-6-25,270(1):78～86.

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附表 姓名 课程名称 实验名称 发酵工程综合实验 蛋白酶产生菌的分离筛选及培养优化 小组成员 制备培养基及接种、观察记录培养基菌落生长情况、酪氨酸OD275标准曲线的测定及蛋白酶产生菌的培养条件优化正交试验 采集土壤、培养基配制、倒平板及平板划线实验分工 接种 培养基菌落生长情况记录、配制实验所需试剂、超净工作台准备及实验台卫生打扫 酪氨酸OD275标准曲线的测定、蛋白酶产生菌的培养条件的优化实验、清洗培养基 成绩 201321060238 学号 201321060228 201321060224 201321060218 实验日2015.12.7--实验地A-13 303实验室 期 2015.12.13 点 我觉得在这次实验中我很好的完成了自己的任务，并且由于步骤比较繁琐，自也锻炼了自己实验的耐心。这次实验也是我认识到理解实验步骤的重要性。我对我以后的其他实验有很大帮助。 评价 教 师 1. 实验报告内容（60分）： （1）实验目的、材料、原理、内容及步骤记录： □清晰、重点突出，依据正确(20~18) □较清晰、依据正确(17~15)□合格(14~12)□不合格(12~0) （2）实验数据（现象）及结果记录、处理： □清晰、正确(20~18)□较清晰、正确(17~15)□合格(14~12) □不合格(12~0) （3）实验结果分析及讨论： 9

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评 阅 □结果详实；结论清晰；讨论合理(20~18) □结果正确(17~15) □合格(14~12) □不合格(12~0) 2.实验态度及出勤情况（20分） □优秀(20~18) □好(17~15) □合格(14~12) □不合格(12~0) 3.实验总结（20分） □优秀(20~18) □好(17~15) □合格(14~12) □不合格(12~0) 教师签名：年月日

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