第２６卷第３期 ２００９年６月 ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００８－９６３２．２００９．０３．０７２ 生物学杂志 ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＹ ＶｏＩ＿２６ Ｎｏ．３ Ｊｕｎ，２００９ 冰冻切片技术在植物显微结构和组织化学中的应用 谢佩松，徐中根，韦存虚 （扬州大学生物科学与技术学院，江苏扬州 ２２５００９） 摘要：介绍了冰冻切片法研究植物显微结构和组织化学的一般程序。结果表明，冰冻切片过程简单有效且图版 清晰，在１ ｄ内可获得高质量图片，解决了利用普通石蜡切片观察植物样品需要进行脱水、浸透、包埋操作且耗时长 的问题，在植物显微结构和组织化学研究中具有广阔的应用前景。 关键词：冰冻切片；植物；显微结构；组化反应 中图分类号：Ｑ一３３６ 文献标识码：Ｂ 文章编号：１００８—９６３２（２００９｝０３—０ｏ７２一Ｏ３ 冰冻切片是利用低温使组织迅速冻结达到一定的 硬度进行切片的一种方法。与常规的石蜡切片相比， 冰冻切片因其不经过脱水和透明等步骤，具有快速、简 １．１．２仪器Ｌｅｉｃａ ＣＭ１１００冰冻切片机，Ｏｌｙｍｐｕｓ普 通光学显微镜及其附带的数码相机，Ｐｈｉｌｉｐｓ ＥＳＥＭ ＸＬ一 ３０环境扫描电子显微镜。 便、易操作等特点，在动物和人体的研究中已被广泛应 用，但在植物上的应用相对较少，仅在少数植物器官和 组织切片中有报道 。与动物细胞相比，植物细胞 有细胞壁和大液泡，含水量远大于相同体积的动物细 胞，冷冻后的植物样品比动物样品硬度大，难以切片和 １．１．３试剂Ｌｅｉｅａ ＯＣＴ冰冻包埋剂，普通胶水，ＦＡＡ 固定液，０．１％甲苯胺蓝水溶液，１％番红水溶液，０．５％ 固绿水溶液，２％间苯三酚（９５％乙醇配制），５０％盐酸， ５０％乙醇，７０％乙醇。 １．２试验方法与步骤 保持植物组织结构的完整性 ’ 。对于一个完整的植 Ｉ．２．１材料的固定、包埋和切片 将新鲜材料切成 物植株，不同部位的质地及含水量存在巨大差异，如何 改进冰冻切片技术，使之适用于不同质地的材料，是冰 冻切片技术在植物学研究应用中所面临的一个重要问 题。本文利用冰冻切片技术，对草本植物水稻和麦冬 ０．５ ｃｍ左右的小段，立即投人ＦＡＡ固定液中，抽气使 材料下沉，用前取出材料，用双蒸水清洗；或者直接将 新鲜材料放入双蒸水中１０ｍｉｎ，使水渗透到组织内’。 在一２０℃用ＯＣＴ包埋剂或普通胶水或双蒸水将样品 包埋并固定在样品托上，冷冻３０ｍｉｎ。调节切片厚度， 进行切片，切片时根据样品的硬度调节切片速度。 １．２．２贴片、染色和装片材料切片的贴片和染色按 两种方法进行：贴片后染色和染色后贴片。贴片后染 的根、茎和叶进行了冰冻切片，观察它们的显微结构和 木质素的显微化学定位，获得了高质量的图片，现将结 果报道如下，以期为冰冻切片技术在植物学研究中的 推广和应用提供参考作用。 １材料和方法 色即直接用载玻片与切片平行靠近，使切片以一定的 速度飞向载玻片且展开在玻片上，室温使切片自然干 １．１试验材料、仪器和试剂 １．１．１材料 试验材料选取草本植物麦冬和水稻。 麦冬［Ｏｐｈｉｏｐｏｇｏｎｊａｐｏｎｉｃｕｓ（Ｌ￡）Ｋｅｒ—Ｇａｗ１］人工种植 于扬州大学文汇路校区高大乔木下，作为林荫下的地 表绿化植物，选取生长良好的植株进行试验分析；水稻 燥并粘在载玻片上，然后再进行染色。染色后贴片即 用冷冻的毛笔或镊子将切片转移到盛有冷却双蒸水的 小器皿中，进行染色，然后将切片粘贴到载玻片上。切 片观察前用水或２０％甘油制成临时装片，也可以用指 品种中花１１（Ｊａｐｏｎｉｃａ ｖａｒｉｅｔｙ Ｚｈｏｎｇｈｕａ １Ｉ）按常规栽培 方法种植于扬州大学实验田，于灌浆期取水稻剑叶和 穗下第二茎节进行试验分析。 收稿日期：２００８—０８—１３；修回日期：２００９—０９—１２ 甲油在临时装片四周进行封固，短期保存。切片的观 察利用Ｏｌｙｍｐｕｓ光学显微镜，用其附带的数码相机进 行拍照。切片的甲苯胺蓝染色方法是，用０．１％甲苯 胺蓝水溶液染色２～３ｍｉｎ，双蒸水清洗后，制成临时装 作者简介：谢佩松（１９８２一），男，硕士，现在工作单位：中国科学 院上海神经科学研究所； 通讯作者：韦存虚，Ｅ—ｍａｉｌ：ｃｘｗｅｉ＠ｙｚｕ．ｅｄｕ．ｃｎ。 片观察；番红，固绿染色方法是，在１％番红染液中染色 ２～３ ｒａｉｎ，双蒸水清洗后，０．５％固绿水溶液染色１ ｍｉｎ， 基金项目：国家自然科学基金资助项目（３０３００２１５） ７２ 双蒸水清洗后，制成临时装片观察；切片木质素的组化 反应采用Ｗｉｅｓｎｅｒ反应法，先在２％的间苯三酚溶液中 第２６卷第３期 ２００９年６月 生物学杂志 Ｊ０ＵＲＮＡＬ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＹ Ｖｏ１．２６ Ｎｏ．３ Ｊｕｎ，２００９ 孵育２ ｍｉｎ，再用５０％浓盐酸封片，然后观察。 １．２．３冰冻切片的亚显微结构观察 冰冻切片直接 粘贴到盖玻片上，干燥器中干燥，用双面胶带将盖玻片 粘在扫描电镜样品台上，离子溅射仪镀金膜，扫描电镜 下观察与拍照。 ２结果与讨论 透明后贴片再封片，均没有取得较好的观察效果，存在 的问题主要是切片四周组织与中央组织不在一平面 上，无法聚焦获得较好的图片。 使用冰冻切片法对水稻和麦冬根、茎和叶进行切 片，其组织结构均很完整，图版也很清晰（图１，２）。 ２．１ 样品处理与切片效果 ２．１．１ 样品固定与切片 比较了新鲜材料和ＦＡＡ固 定后材料的切片效果，结果表明，固定与不固定对切片 没有影响。ＦＡＡ固定的材料，在冰冻包埋前需要用双 蒸水清洗固定剂３次，否则很难切片。新鲜材料在冰 冻包埋前浸没在水中１０ｍｉｎ，切片效果比直接将材料 进行冰冻包埋好。 ２．１．２包埋剂与切片冰冻切片常用的包埋剂有水、 普通胶水和ＯＣＴ，比较分析了这三种包埋剂对冰冻切 片的影响，结果表明，用水做包埋剂，较难切出完整的 切片；ＯＣＴ包埋剂与普通胶水效果基本相同，都能切出 完整的切片，如果在冰冻前将材料浸没在ＯＣＴ或胶水 中，让ＯＣＴ或胶水充分渗透进组织中，切片效果更好。 ２．１．３切片厚度切片不可过厚，否则细胞重叠不易 观察；切片也不可过薄，否则切片不完整，根据试验，叶 片厚度以１０～１５ ｍ效果较好，而根和茎的厚度２０Ｉｘｍ 为宜。 ２．１．４贴片和染色 比较分析了贴片后染色和染色 后贴片的效果，结果表明，前者的优点是操作简单，切 片粘贴在玻片上可以进行滴染，也可以将玻片浸没在 染液中进行染色；缺点是如果切片粘得不牢，染色过程 中容易脱片，切片在自然干燥过程中，切片四周的组织 容易卷起，导致无法观察。染色后贴片的优点是在染 色后的切片制成临时装片时，切片四周组织不会卷起， 观察效果较好；缺点是操作复杂，染色过程中不小心会 将材料丢失，染色后将材料转移到载玻片上也比较麻 烦。根据实验结果，我们认为，叶片较薄，染色后贴片 较难，采取贴片后染色为好，茎和根染色后贴片较容 易，且切片较厚，采用染色后贴片较好。 ２．１．５封片冰冻切片制成临时装片，可以用水制成 水装片，也可以用２０％甘油制成临时装片，前者必须 在短时间内进行观察，后者可以保存１周，如果用指甲 油在四周进行封固，可以保存一段时间。无论是用水 进行封片还是用甘油，封片前务必保持材料湿润，否则 会有许多小气泡在材料中。我们也尝试将冰冻切片制 成永久制片，无论是贴片后脱水、透明、封片还是脱水、 图１水稻冰冻切片 Ｆｉｇ １ Ｒｉｃｅ ｃｒｙｏｓｅｃｔｉｏｎｉｎｇ Ａ：叶，未染色，×３０；Ｂ：叶，甲苯胺蓝染色，×１２０；Ｃ、Ｄ：茎，木质 素组化（Ｗｉｅｓｎｅｒ）反应，Ｃ×２０，Ｄ×８Ｏ Ａ：ｌｅａｆ，ｕｎｓｔａｉｎｉｎｇ，×３０；Ｂ：ｌｅａｆ，ｓｔａｉｎｉｎｇ ｗｉｔｈ ｔｏｌｕｉｄｉｎｅ ｂｌｕｅ； ×１２０；Ｃ，Ｄ：ｓｔｅｍ，Ｗｉｅｓｎｅｒ’Ｓ ｓｔａｉｎｉｎｇ，Ｃ×２０，Ｄ×８０ －翻 图２麦冬冰冻切片 Ｆｉｇ ２ Ｏｐｈｉｏｐｏｇｏｎ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ ｃｒｙｏｓｅｃｔｉｏｎｉｎｇ Ａ：根，甲苯胺蓝染色，×７０；Ｂ：茎，番红一固绿染色，×７０；Ｃ：根， 扫描电镜观察，×１４０ Ａ：ｒｏｏｔ，ｓｔａｉｎｉｎｇ ｗｉｔｈ ｔｏｌｕｉｄｉｎｅ ｂｌｕｅ，×７０；Ｂ：ｓｔｅｍ，ｓｔａｉｎｉｎｇ ｗｉｔｈ ｓａｆｒａｎｉｎｅ—ｆａｓｔ ｇｒｅｅｎ，×７０；Ｃ：ｒｏｏｔ，ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｗｉｔｈ ＳＥＭ，×１４０ ２．２样品的染色和组化反应 冰冻切片可以不经染色直接制成水装片进行观 察，操作简单，植物细胞的基本组织结构清晰，根、茎和 叶都能获得较好的观察效果，如水稻叶片横切，清晰显 示叶片的基本解剖结构：表皮、叶肉和叶脉（图１．Ａ）。 由于冰冻切片没有经过脱水过程，一般不需要特殊处 理就可以直接对材料进行染色和组织化学分析。在我 们的试验中，分别进行甲苯胺蓝单染，番红与固绿对 染，Ｗｉｅｓｎｅｒ反应等，均取得了较好的效果。如经甲苯 胺蓝染色，植物细胞的显微结构更加清晰显现（图１一 Ｂ，图２一Ａ）；如果染色时问掌握得好，效果更好，植物不 同的组织会被染成不同的颜色（图２．Ａ）。番红一固绿 ７３ 第２６卷第３期 ２００９年６月 生物学杂志 Ｊ０ＵＲＮＡＬ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＹ Ｖ０Ｌ ２６ Ｎｏ．３ Ｊｕｎ，２００９ 复染常用于植物细胞研究中，冰冻切片经番红一固绿复 染也可以获得反差分明的图片（图２一Ｂ）。与石蜡切片 片、染色、贴片到封片等每一步骤都精益求精。总之， 冰冻切片技术如果掌握得好，是进行草本植物细胞学 研究简便有效的方法。 参考文献： 相比，冰冻切片做组化反应效果更好。Ｗｉｅｓｎｅｒ反应法 可以显示木质素在植物细胞中的分布和含量，对冰冻 切片进行Ｗｉｅｓｎｅｒ反应，清晰显示了木质素在厚壁组织 ［１］木月惠，李寒冰，贺新强．高度木质化材料的冰冻切片技术【Ｊ］． 植物学通报，２００１，１８（１）：１１８—１２０． 和维管组织中存在，图片效果较好（图１一Ｃ、Ｄ）。 ２．３ 冰冻切片亚显微结构观察 冰冻切片一般较厚，所以普通光学显微镜下，高倍 无法获得清晰的图像。我们尝试用ＳＥＭ观察冰冻切 片，结果表明，效果非常好，尤其是对维管组织和厚壁 细胞（图２一Ｃ）。 ［２］万怡震，贺普超．葡萄浆果冰冻切片技术参数的研究［Ｊ］．西北 植物学报，２００１，２１（２）：３８２～３８６． ［３］陈 丹，赵洁．适合于植物花器官的冰冻切片技术［Ｊ］．武汉 植物学研究，２００５，２３（３）：２８５—２９０． ［４］刘剑锋，程云清，阎秀峰，等．植物冰冻切片技术的改进［Ｊ］． 南京林业大学学报（自然科学版），２００６，３０（３）：１２８～１３０． 冰冻切片制作过程中，常有许多因素影响其质量， 并进一步影响实验结果的观察和分析。因此，制作一 ［５］刘剑锋，阁秀峰，程云清，等．冰冻切片技术在高山红景天细胞 学研究中的应用［Ｊ］．东北林业大学学报，２００６，３４（４）：１１０． ［６］张新成，李志刚，李素丽，等．冰冻切片法在植物微管骨架研究 中的应用［Ｊ］．广西植物，２００８，２８（２）：１６４～１６６． 套高质量的冰冻切片对于确保实验结果的科学性、可 靠性是极其重要的，这就需要从材料切片前处理、切 Ｃｒｙｏ－ｓｅｃｔｉｏｎｉｎｇ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｉｎ ｐｌａｎｔ ＸＩＥ Ｐｅｉ—ｓｏｎｇ，ＸＵ Ｚｈｏｎｇ—ｇｅｎ，ＷＥＩ Ｃｕｎ—ｘｕ （Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏ—ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｅｈｎｏｌｏｇｙ，Ｙａｎｇｚｈｏｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙａｎｇｚｈｏｕ ２２５００９，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｇｅｎｅｒａｌ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｏｆ ｃｒｙｏ—ｓｅｃｔｉｏｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｗｅｒｅ ｄｅｔａｉｌｅｄ ｈｅｒｅ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｈｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｏｐｅｒａｔｉｎｇ ｐｒｏｃｅｓｓ ｗａｓ ｓｉｍｐｌｅ ａｎｄ ｅｆｉｃｉｆｅｎｔ，ａｎｄ ｃｌｅａｒ ｐｌａｔｅｓ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ａｃｑｕｉｒｅｄ ｗｉｔｈｉｎ ｏｎｅ ｄａｙ．Ｃｒｙｏ－ｓｅｃｔｉｏｎｉｎｇ ｓｏｌｖｅｄ ｔｈｅ ｐｒｏｂｌｅｍ ｏｆ ｐａｒａｆｆｉｎ ｓｅｃｔｉｏｎ ｔｈａｔ ｎｅｅｄｅｄ ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ，ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｍｂｅｄｍｅｎｔ ｂｅｆｏｒｅ ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ．Ｉｔ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ·＂，ｔｈａｔ ｔｈｅ ｃｒｙｏ—ｓｅｃｔｉｏｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｕｓｅｆｕｌ ｆｏｒ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｎｇ ｐｌａｎｔ ｍｉｃｒｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｃｒｙｏ—ｓｅｃｔｉｏｎｉｎｇ；ｐｌａｎｔ；ｍｉｃｒｏｓｔｒｕｅｔｕｒｅ；ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ （上接８０页）Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｓｉＲＮＡ—ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔ－ｂｅｔ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ Ｏｉｌ ＩＦＮ— ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＣＤ４ ａｎｄ ＣＤ８ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｓｕｂｓｅｔｓ ＷＡＮＧ Ｈｏｎｇ．ｔａｏ．ＧＥ Ｘｉａｏ．ｓｏｎｇ．ＬＩ Ｂａｉ—ｑｉｎｇ （１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｂｅｎｇｂｕ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ； ２．Ａｎｈｕｉ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ａｔ Ｂｅｎｇｂｕ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｂｅｎｇｂｕ ２３３０３０，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｓｉＲＮＡ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｆｏｒ ｔ－ｂｅｔ ０ｎ ＩＦＮ— ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＣＩＭ ａｎｄ ＣＤ８ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｓｕｂｓｅｔｓ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｂｙ ａｎｔｉ—ＣＤ３ｍＡｂ，ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ（ＰＢＭＣ）ｆｒｏｍ ｎｏｒｍａｌ ｈｕｍａｎ ｓｕｂｊｅｃｔｓ ｗｅｒｅ ｓｉｔｍｕｌａｔｅｄ ｔｌｌ ｎｔａｉ－ ＣＤ３ｍＡｂ ｔｏ ｇｅｎｅｒａｔｅ ａｎｔｉ—ＣＤ３ｍＡｂ ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ（ＣＤ３ＡＴ）ｗｈｉｃｈ ｗｅｒｅ ａｌｍｏｓｔ ｃｔ＇３Ｔ ｃｅｌｌｓ．ＣＩＭ’ａｎｄ ＣＤ８ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｅｙｔｅｓ ｂｙ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ｗｅｒｅ ｓｏｒｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｎｔｉ·ＣＤ４ ｏｒ ＣＤ８ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒｏｍ ＣＤ３ＡＴ．Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔ－ｂｅｔ ｇｅｎｅ ｍＲＮＡ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ＲＴ－ＰＣＲ ａｓｓａｙ．Ｔｈｅ ｃｈａｎｇｅ ｏｆ ＩＦＮ· ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｗａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ｍｅｔｈｏｄ．Ａｆｔｅｒ ｔｒａｎｓｆｅｅｔｉｏｎ，ｔｈｅ ｍＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ ｏｆ ｔ－ｂｅｔ ｇｅｎｅ ｉｎ ＣＩＭ ａｎｄ ＣＤ８ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｗｅｒｅ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ＲＴ—ＰＣＲ ａｓｓａｙ．Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｅｙｔｏｋｉｎｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｗａｓ ａｓｓａｙｅｄ ｂｙ ｌｆｏｗ ｅｙｔｏｍｅｔｒｙ．Ｔｈｅ ＩＦＮ一 ｃｅｌｌｓ ｉｎ ＣＩＭ Ｔ ｃｅｌｌｓ（５０．２０％±５．９１％）ｗｅｒｅ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｉｎ ｔｈｏｓｅ ｔｒａｎｓｆｅｅｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔ－ｂｅｔ ｓｉＲＮＡ （１８．４６％４－６．８６％），ｗｈｅｒｅａｓｔｈｅＩＦＮ一 ｃｅｉｌｓｉｎＣＤ８ Ｔ ｃｅｌｌｓ（７４．１８％±９．３３％）ｗｅｒｅ ｕｎｃｈａｎｇｅｄｉｎｔｈｏｓｅ ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐｓ（７６．５１％４－６．４９％）．Ｒｅｓｕｌｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｔｒｇｅａｔｉｎｇ ｔ－ｂｅｔ ｃｏｕｌｄ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ ｉｎｈｉｂｉｔ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔ－ｂｅｔ ｍＲＮＡ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ１ｅｖｅｌｓ ｏｆｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ ｏｎ￡ｌ１ｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆＩＦＮ， ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ＣＩＭ ａｎｄ ＣＤ８ Ｔｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｍａｄｅ． 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