[实验目的]
1、掌握荧光光度计的基本原理及使用。
2、了解荧光分光光度计的构造和各组成部分的作用；
3、掌握分子荧光光度计分析物质的特征荧光光谱：激发光谱、发射光谱的测定方法。
[实验原理]
1、激发光谱与发射光谱
具有不饱和基团的基态分子经光照后，价电子跃迁产生荧光，是当电子从第一激发单重态的最低S1振动能级回到基态各振S0动能级所产生的光辐射。
激发光谱：是指发光的某一谱线或谱带的强度随激发光波长（或频率）变化的曲线。横坐标为激发光波长，纵坐标为发光相对强度。激发光谱反映不同波长的光激发材料产生发光的效果。即表示发光的某一谱线或谱带可以被什么波长的光激发、激发的本领是高还是低；也表示用不同波长的光激发材料时，使材料发出某一波长光的效率。
荧光为光致发光，合适的激发光波长需根据激发光谱确定——激发光谱是在固定荧光波长下，测量荧光体的荧光强度随激发波长变化的光谱；获得方法：先把第二单色器的波长固定，使测定的不em变，改变第一单色器波长，让不同波长的光照在荧光物质上，测定它的荧光强度，以为纵坐标I，ex为横坐标所
ex，实际上选波得图谱即荧光物质的激发光谱， 从曲线上找出长较长的高波长
峰。
发射光谱：是指发光的能量按波长或频率的分布。通常实验测量的是发光的相对能量。发射光谱中，横坐标为波长（或频率），纵坐标为发光相对强度。发射光谱常分为带谱和线谱，有时也会出现既有带谱、又有线谱的情况。发射光谱的获得方法：先把第一单色器的波长固定，使激发的不ex变，改变第二单色器波长，让不同波长的光扫描，测定它的发光强度，以为纵坐标I，em为横坐标得图谱即荧光物质的发射光谱，从曲线上找出最大的em。 2、荧光分光光度计
包括四个部分，即激发光源、样品池、双单色器系统、检测器。特殊点是有两个单色器，光源与检测器通常成直角。
单色器：选择激发光波长的第一单色器和选择发射光(测量)波长的第二单色器
光源：氙灯、高压汞灯、激光器(可见与紫外区) 检测器：光电倍增管
[仪器材料]
仪器：HORIBA Fluoromax-4荧光光谱仪
试剂：罗丹明B、2-萘酚、3,3'-Diethyloxadicarbocyanine iodide（碘化-3,3ˊ-二乙基氧杂二羰花青）浓度分别为40g/mg、30g/mg、20g/mg、10g/mg、以及未知浓度试样一份。
[实验步骤]
1、按照实验原理中的方法分别扫描得到罗丹明B、2-萘酚和碘化-3,3ˊ-二乙基氧杂二羰化青（选取最高浓度的标准样品）的分子荧光光谱，确定三者各自的激发波长和发射波ex长em。扫描确定未知溶液的和exem，根据图谱形状和激发、发射最大波长等信息确定未知溶液的物质种类。
2、在选定的激发波长和发ex射波长em下，测定不同浓度碘化-3,3ˊ-二乙基氧杂二羰化青标准溶液的相对荧光强度。
3、以相对荧光强度为纵坐标，以标准溶液的浓度为横坐标，绘制碘化-3,3ˊ-二乙基氧杂二羰化青的标准曲线。
4、依据碘化-3,3ˊ-二乙基氧杂二羰化青的标准曲线和未知溶液在和的相对
exem荧光强度（由步骤1已确定为羰化青溶液）推算出其浓度。
图一 分子荧光分析仪基本部件示意图
[实验结果及分析]
图二1 罗丹明B激发光谱 图三1 2-萘酚激发光谱 图四 罗丹明B分子结构
图二2 罗丹明B荧光光谱
图三2 2-萘酚荧光光谱
图五 2-萘酚分子结构
发射光谱与激发光谱没有直接关系，发射光谱波长一般比激发光谱波长要长。从荧光光谱上可得出罗丹明
B
的em(max)566nm，2-萘酚的
轭体系的芳环或杂环化合物，电子共轭程度越em(max)368nm。由于具有共
大，越易产生荧光；环越多，共轭程度越大，产生荧光波长越长，发射的荧光强度越强。分析两种物质分子结构可知，罗丹明B共轭程度更大，因此荧光波长更长，与实验值相符合。
表一 标准曲线法实验数据
浓度/g/mg 荧光强度 未知 14520 40 13440 30 11940 20 8640 10 4570
图六 标准曲线
（注：从曲线可以看出数据点（40，13440）严重偏离曲线，故舍去）
分析未知试样的激发光谱和荧光光谱可知其Em610nm，Ex579nm，查阅相关文献可知为3,3'-Diethyloxadicarbocyanine iodide（碘化-3,3ˊ-二乙基氧杂二羰花青），根据标准曲线可知未知样品浓度C36.7g/mg。
[实验小结]
1、从实验图上可以看出有许多尖峰属于误差，最大值应当选择平缓的置，避免尖峰位置。
2、在标准曲线上可以看到有一数据点严重偏离曲线，舍去，可能原因为实验时短暂，操作上的误差，选择激发波长位置的仓促性以及经验性等。
3、通过这次实验，掌握了分子荧光光度计的应用方法和工作原理，熟悉并掌握了利用分子荧光光度计进行定性分析的实验方法和原理。
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