黑曲霉2277菌株产纤维素酶最佳液体发酵条件的研究

—＝＝＝４４　食品研究与开发　科学研究　黑曲霉２２７７菌株产纤维素酶　武赞。卜可华。李平　。杜先锋　（安徽农业大学茶与食品科技学院，农业部茶叶生物化学与生物技术重点实验室，安徽合肥２３００３６）　摘要：对黑曲霉２２７７茵株产纤维素酶最佳液体培养条件进行了研究。结果表明，黑曲霉２２７７最适液体培养条件　为：稻草粉（碳源）６％，豆饼粉（氮源）１％，初始ｐＨ６，０～６，５，培养温度２８℃～３Ｏ℃，一级培养时间１２０　ｈ，二级培养时间　７６ｈ　４ｈ，接种量１Ｏ％，２５０ｍＬ三角瓶装液量７５ｍＬ，摇床转速１５０　ｒ／ａｒｉｎ。在最适培养条件下，以ＤＮＳ法对酶活进行定　量分析，测得发酵液中ＣＭＣ酶活达９２．１　Ｉ￣ｇ／ｍＬ・ｍｉｎ；以滤纸崩溃度对酶活进行定性分析，滤纸在９４ｈ内完全分解。　关键词：黑曲霉；纤维素酶；液体发酵条件　ＴＨＥ　ＯＩｙｒＩＭＡＬ　ＳＵＢＭＥＲＧＥＤ　ＦＥＲＭＥＮＴＡＴＩＯＮ　ＣＯＮＤＩ　ｎ０ＮＳ　ＦＯＲ　ＰＲＯＤＵＣＩＮＧ　ＣＥＩ　ＵＬＡＳＥ　ＢＹ　ＡＳＰＥＲＧＩＬＬＵＳ　ＮＩＧＥＲ　２２７７　ＷＵ　Ｙｕｎ，ＰＵ　Ｋｅ—ｈｕａ，ＬＩ　Ｐｉｎｇ’，ＤＵ　Ｘｉａｎ—ｆｅｎｇ　（Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｔｅａ　ａｎｄ　Ｆｏｏｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ａｎｈｕｉ　Ａｇｆｉｃｕｈｕｒｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈｅｆｅｉ　２３００３６。Ａｎｈｕｉ　Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｗａｓ　ｃａｒｒｉｅｄ　ｏｕｔ　ｂｙ　ｓｕｂｍｅｒｇｅｄ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　２２７７．Ｔｈｅ　ｅｆ．　ｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｃｏｎｄｉｉｔｏｎｓ　ｏｎ　ｃｅｌｈｌｏｓｅ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｗｅｒｅ　ｓｔｕｄｉｅｄ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍａｌ　ｃｏｎｄｉｉｔｏｎｓ　ｏｆ　ｓｕｂｍｅｒｇｅｄ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ　ｏｎ　ｗｅｒｅ：６％ｒｉｃｅ　ｓ眦１ｗ　ｐｏｗｄｅｒ　ｗａｓ　ｃａｒｂｏｎ　ｓｏｕｒｃｅ．１％ｂｅａｎ　ｃａｋｅ　ｍｅａｌ　ｗａｓ　ｎｉｔｒｏｇｅｎ　作者简介：武赞（１９８３一），女，硕士研究生，研究方向：功能性食品。　・通讯作者　化效果明显提高，加入ＢＨＴ后活性是原来的２．６２倍。　【７】郭建平，孙其荣，周全，等．葛根总黄酮不同提取工艺的探讨［Ｊ】，中　如何利用复合抗氧化剂既增效又降低成本减少毒　草药．１９９５．（２６）：３２２—３２６，　副作用是未来值得探讨的问题。　【８】李桂华，１寸黎敏，梁少华，等，甘草提取物抗氧化性能的研究【Ｊ】，郑　州粮食学院学报，１９９８．１９（１）：２８—３２．　【９】王松强，蓝丽华，梁瑞云，等．甘草有效成分分离及防霉实验研究　参考文献：　【Ｊ］冲国食品添加剂，２００１，１６（２）：２９—３２．　【１】李明．甘草的研究概况［Ｊ］．甘肃中医学院学报，２０００，１７（３）：５９．－６３．　【１０】许宗运，刘利林，李伟，等．七种植物提取物对猪油的抗氧化性能　【２】尤新．天然功能性添加剂一甘草甜和甘草抗氧化剂ｍ．中国食品　。　研究『Ｊ１．塔里木农垦大学学报，２００３，１５（４）：１－４．　添加剂，２００１，（５）：４—７．　【１１】凌美庭．天然食品添加剂手册［ＭＩ．北京：化学工业出版社，２００１：　【３】高发奎，张树蔚，杨晓辉，等．甘草废渣中抗菌抗氧化剂的提取及　６３４—６３５．　其化学组成ｍ．兰州大学学报，２００４，４０（４）：６４—６８．　【１２】周家华．食品添加剂【Ｍ】．北京：化学工业出版社，２００１：７５－７６．　［４］左锦静，陈复生．甘草抗氧化剂的研究进展［Ｊ］．粮油加工与食品　【１３】陆冰真，霍永信．薄层层析法在食品分析中的应用【Ｍ】．北京：北京　机械，２０Ｏ４，（８１：４４－４５．　大学出版社。１９９１：３６—３７．　［５１　Ｓｈｉｎ。－Ｙｏｕｎｇ　Ｊｕｎ，Ｐｙｏ－Ｊａｍ　Ｐａｒｋ，Ｗｏｎ。－Ｋｙｏ　ＪｕｎｇｒＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　【１４】凌关庭．抗氧化食品与健康【Ｍ】．北京：化学工业出版社，２００４：　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｎ　ａｎｔｉｏｘｉｄａｔｉｖｅ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｆｒｏｍ　ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　３４２—３４４．　ｈｕｄｒｏｔｙｓａｔｅｏｆｙｅｌｈ￣ｆｆｉｎ　ｓｏｌｅ（１ｉｍａｎｄａ　ａｓｐｅｒａ）ｆｒａｍｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ［Ｊ］．Ｅｕｒ　【１５】许安邦，林维宣，佟绍芳，等功能性食品【Ｍ］．北京：中国轻工业出　Ｆｏｏｄ　Ｒｅｓ　Ｔｅｃｈｎｏｌ，（２００４）２１９：２０－２６．　版社．１９９４：１　１８—１２３．　【６】陈复生，李红良．甘草中天然抗氧化剂的提取工艺研究【Ｊ］食品科　收稿日期：２００６—０８—０７　学，２００３，（２）：５０—５４．　维普资讯 http://www.cqvip.com

科学研究　食品研究与开发　２ｏＯ６．ＶｏＬ２７。ＮＯ．９　４５＝＝＝＿Ｉ　ｓｏｕｒｃｅ，ｔｈｅ　ｉｎｉｔｉａｌ　ｐＨ　ｏｆ　ｍｅｄｉｕｍ　ｗａｓ　６．０￣６．５，ｔｈｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｗａｓ　２８￣Ｃ￣３０℃，ｔｈｅ　ｉｆｒｓｔ　ｓｔａｇｅ　ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ　ｗａｓ　１２０　ｈ，ｔｈｅ　ｓｅｃｏｎｄ　ｓｔａｇｅ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ　ｗａｓ　７６　ｈ￣８４　ｈ，ｔｈｅ　ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ　ａｍｏｕｎｔ　ｗａｓ　１０％，７５ｍＬ　ｏｆ　ｍｅｄｉｕｍ　ｗａｓ　ｉｎ　ｅａｃｈ　ｌｆａｓｋ　ｏｆ　２５０　ｍＬ　ｓｉｚｅ，ｔｈｅ　ｓｈａｋｉｎｇ　ｓｐｅｅｄ　ｗａｓ　１５０　ｒ／ｍｉｎ．Ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅ　ａｂｏｖｅ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ｔｈｅ　ａｃｔｉｖｉ－　ｔｉｅｓ　ｏｆ　ＣＭＣａｓｅ　ｗａｓ　９２．１　ｕｇ／ｍＬ‘ｍｉｎ，ｔｈｅ　ｉｌｔｆｅｒ　ｐａｐｅｒ　ｗａｓ　ｄｅｐｏｓｅｄ　ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ　ｉｎ　９４　ｈ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ；ｃｅｌｌｕｌａｓｅ；ｓｕｂｍｅｒｇｅｄ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　纤维素酶是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总　称，真菌纤维素酶主要包括Ｂ一１，４一葡聚糖纤维二糖水　１．１．４相关溶液１７－８１　醋酸缓冲液（０．１　ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ４．８）；柠檬酸盐缓冲液　解酶即ｃ。酶、内切６－１，４一葡聚糖酶和外切Ｂ一１，４一葡　聚糖酶即Ｃ　酶、纤维二糖酶即Ｂ一葡萄糖苷酶３类组　分。不同来源的纤维素酶的分子特征和催化活性都不　尽相同【ｌ】。在真菌中产纤维素酶活力较高的有木霉、黑　曲霉、青霉等。利用纤维素酶可开发丰富的纤维素资　源。纤维素酶在纺织、酿造、造纸、食品、饲料、农产品加　工、石油开采、医药、资源再生等方面都有广泛的应用　前景　。　纤维素酶的生产方法有固体发酵法和液体发酵法　２种。固体发酵法存在培养条件难控制，易污染杂菌等　弊端。液体发酵法具有培养条件容易控制，不易染菌，生　产效率高等特点，因此对纤维素酶液体发酵条件的研　究很有现实意义。纤维素酶催化纤维素水解反应有效　ｐＨ范围一般在３．５　６．０之间，ｐＨ８以下稳定，大于９　时迅速失活；水解反应最适温度一般在４０℃一５５℃之　间，４０℃以下稳定性好，超过６０℃逐渐失活　。纤维素　酶对ｐＨ和温度的反应，随产生纤维素酶的菌种有所　差异。笔者以黑曲霉２２７７菌株为供试菌，试图探讨其　产生纤维素酶的最佳液体发酵培养条件，期望为筛选　高产纤维素酶菌株提供技术支撑。　１材料与方法　１．１材料　１．１．１供试菌株　黑曲霉２２７７，安徽农业大学茶与食品科技学院生　物技术实验室保藏。　１．１．２主要仪器　立式压力蒸汽灭菌器，电子天平，电热恒温水浴　锅，超净工作台，水夹套培养箱，全温振荡培养箱，台式　离心机。　１．１．３培养基（质量分数，％）　斜面培养基：马铃薯２０，葡萄糖２，琼脂２，ｐＨ自　然；种子培养基阎：麸皮２，葡萄糖３，（ＮＩＬ）２ＳＯ　０．１５，　ｐＨ５．５　６．０；发酵培养基阎：稻草粉（或ＣＭＣ、麸皮、葡萄　糖、蔗糖）６，豆饼粉（或尿素、碳酸铵、酵母膏、柠檬酸　铵）１，（ＮＨ４）＝Ｓ０４　０．５，ＣａＣ１２　０．３，ｐＨ４￣６．５。　（０．０５　ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ４．６）；０．５％ＣＭＣ溶液；ＤＮＳ显色液。　１．２方法　１．２．１培养方法　斜面培养：将黑曲霉２２７７进行斜面培养，２８℃，　７２　ｈ；种子培养：２５０ｍＬ三角瓶装人种子培养基５０ｍＬ，　接人斜面孢子约１　ｃｍ。，转速１５０　ｒ／ｍｉｎ，３０℃下振荡培　养７２　ｈ一１６８　ｈ；发酵培养：按５％一２０％（ｖ／ｖ）接种量接　人发酵培养液，转速７５　ｒ／ｍｉｎ　１７５　ｒ／ｍｉｎ，２４℃　３６℃培　养２４　ｈ一１０８　ｈ，测定酶活。　１．２．２酶液制备　发酵液先由无菌纱布过滤，再经２　０００　ｒ／ｍｉｎ，１０　ｍｉｎ　离心，除去菌体及培养基残渣，上清液用缓冲液做适当　稀释。　１．２．３酶活测定　以羧甲基纤维素钠（ＣＭＣ）为底物。以还原糖生成量　表征内切葡聚糖酶的活力，即ＣＭＣ酶活；以滤纸为底　物，以其分解程度和速度表征纤维素酶系总的糖化能　力，即滤纸崩溃度。这２种方法是目前广泛采用的表示　纤维素酶活力的方法翻。　１．２．３．１羧甲基纤维素酶活测定　取２支试管，一支试管中加入０．５ｍＬ酶液和１．５ｍＬ　０．５％ＣＭＣ溶液，另一支对照管中加入２．０　ｍＬ　０．５％　ＣＭＣ溶液。５０℃水浴３０ｍｉｎ。加１．５ｍＬＤＮＳ试剂，沸水　浴１０　ｍｉｎ，显色测还原糖。活力单位规定：１　ｍＬ酶液１　ｍｉｎ水解生成１　ｇ葡萄糖的酶量为１个活力单位（Ｕ）。　ＣＭＣ酶活（￣ｇ／ｍＬ・ｍｉｎ）＝ＡＢｘｌ　０００１３０，Ａ表示从标准曲　线查得的葡萄糖毫克数，Ｂ表示酶液的稀释倍数。标准　曲线制作按参考文献ｔＴｌ进行。　１．２．３．２　滤纸崩溃的测定　在试管中加人醋酸缓冲液１　ｍＬ，酶液４　ｍＬ，１　ｃｍ￣　３　ｃｍ新华滤纸１条，摇匀，使滤纸全部浸入溶液中，然　后将试管放人４０℃恒温水浴中保温９６　ｈ，取出后观察　滤纸崩溃情况。以“＋”的多少来表示滤纸崩溃程度。“＋”　代表滤纸边缘膨胀，“＋＋”代表滤纸整齐膨胀并下弯，　“＋＋＋”代表滤纸不定形，“＋＋＋＋”代表全成糊状，“一”代　表滤纸无明显变化，“ｔ”代表崩溃速度较快。　维普资讯 http://www.cqvip.com

—＝＝＝４６　２ｏＯ６．ＶｏＬ２７　Ｎｏ．９　食品研究与开发　科学研究　２结果与讨论　２．１碳源对产酶活力的影响　纤维素酶是诱导酶，碳源对产酶能力有重要影响，　不同碳源对纤维素酶的合成有不同的诱导作用。在以　豆饼粉为氮源，２５０　ｍＬ三角瓶中加入５０　ｍＬ培养液，　１０％接种量接种，初始ｐＨ６．０，２９　ｏＣ，１５０　ｒ／ｍｉｎ摇瓶培　养９６　ｈ条件下试验了一系列碳源对产酶的影响，结果　见图１、表１。　从图１、表１可以看出：以稻草粉为碳源，ＣＭＣ酶　９Ｏ　８Ｏ　｛　７０　６５．２　６ｏ　５０　４０　３Ｏ　囊　２０　１０　６．４　１，　髓　０　．广．］．　兰　稻草粉　ＣＭＣ　麸皮　葡萄糖　蔗糖　碳源　图１　碳源对ＣＭＣａｓｅ的影响　衷１　碳源对滤纸分解度的影响　塑　塑茔　塾鏖　煎童塑　夔蕉　滤纸分解度　＋＋＋＋　＋＋ｔ　＋＋　＋　一　产量、滤纸分解度均最高，其次是ＣＭＣ、麸皮。以纤维　素原料为碳源其酶产量较高，说明纤维素原料是纤维　素酶良好的诱导剂，纤维素酶是诱导酶。以葡萄糖、蔗　糖作为碳源虽能促进菌体生长，但对酶有抑制作用，必　须在这些物质被耗尽后才有纤维素酶产生，这种现象　称作“葡萄糖效应”。所以本研究以稻草粉作为发酵液　碳源。　２．２氮源对产酶活力的影响　氮是组成核酸和蛋白质的重要元素，氮源是构成　微生物细胞物质或代谢产物中氮元素来源的营养物　质，所以氮源对微生物的生长发育有着重要的作用。在　以稻草粉为碳源，２５０　ｍＬ三角瓶中加入５０　ｍＬ培养　液，１０％接种量接种，初始ｐＨ６．０，２９　ｏＣ，１５０　ｒ／ｍｉｎ摇瓶　培养９６　ｈ条件下分别用５种不同氮源进行产酶试验，　结果见图２、表２。　乒　囊　髓　氮源　图２氮源对ＣＭＣａｓｅ的影响　表２氮源对滤纸分解度的影响　塑　垦墨　墼堡　星垡　童　盐燮墼壁　滤纸分解度　＋＋＋＋　＋＋＋＋ｔ　＋＋＋　＋　一　从图２、表２可以看出：不同氮源产酶活力大小顺　序为硝酸铵、尿素、豆饼粉、酵母膏、柠檬酸铵。硝酸铵　比其它氮源更有利于菌株产纤维素酶，可能有下面几　个方面的原因：①硝酸铵含氮量高，优化了培养基的碳　氮比；②硝态氮能刺激黑曲霉２２７７产纤维素酶；③当　以柠檬酸铵为氮源时，铵态氮被利用后，培养基的ｐＨ　下降，而硝酸铵作氮源时，培养基的ｐＨ先降后升，避免　了ｐＨ急剧升降，这有利于黑曲霉２２７７产纤维素酶。以　尿素为氮源，生长较好，酶活也较高，可能是菌体利用　尿素产生氨气，使ｐＨ值升高，更适合生长。用豆饼粉　作氮源时，对生长和产酶也都有明显的促进。因豆饼粉　比较廉价易得，所以本试验以豆饼粉作为发酵液氮源。　２．３培养基碳、氮源用量对酶活力的影响　以稻草粉为碳源、豆饼粉为氮源的摇瓶产酶试验　中，稻草粉、豆饼粉不同比例的组合对纤维素酶活性影　响较大，在２５０　ｍＬ三角瓶中加入５０　ｍＬ培养液，１０％　接种量接种，初试ｐＨ６．０，２９　ｏＣ，１５０　ｒ／ｍｉｎ摇瓶培养　９６　ｈ条件下，６种比例组合进行培养，结果见图３、表３。　１００　６４．　Ｚ　５６．　７５［ＤＣＭＣａｓｅ［　８Ｏ　．　３　茸　６Ｏ　墨４ｏ　２０　藿　ｏ　●　．　４＆ｌ　４＆２　６＆ｌ　６＆２　８＆ｌ　８＆２　注：稻草粉（％）＆豆饼粉（％）　图３培养基碳、氮源用量对ＣＭＣａｓｅ的影响　表３培养基碳、氮源用量对滤纸分解度的影响　些　丝　丝　鱼　鱼　鱼　丝　滤纸分解度　＋＋＋＋　＋＋＋ｆ　＋＋＋＋ｔ　＋＋＋　＋＋　＋　从图３、表３可以看出：当稻草粉６％、豆饼粉１％　时，滤纸分解度最高；当稻草粉４％，豆饼粉１％时，　ＣＭＣ酶活最高。滤纸分解度高低较能体现产酶菌株分　解纤维素能力的强弱，而且ＣＭＣ酶活性相差不大，因　此本试验选用６％稻草粉，１％豆饼粉作为发酵培养基　的用量。　２．４培养基起始ｐＨ值对酶活力的影响　ｐＨ值是菌种生长的化学因子，对微生物生长的影　响很大。在培养微生物时，ｐＨ值可以引起细胞膜电荷　变化，以及影响营养物离子化程度，从而影响微生物对　营养物的吸收Ｉ９】。在以稻草粉为碳源（６％），豆饼粉为氮　维普资讯 http://www.cqvip.com

科学研究　食品研究与开发　２００６　ＶｏＬ２７．ＮＯ．９　源（１％），２５０ｍＬ三角瓶中加入５０ｍＬ培养液，接种量　ｌ０％，１５０　ｒ／ｍｉｎ摇瓶培养９６　ｈ的条件下，培养基的初　始ｐＨ值用０．５　ｍｏｌ／Ｌ的ＨＡＣ或ＮａＨＣＯ　调节，研究起　始ｐＨ４．０￣６．５对黑曲霉２２７７菌株酶活的影响，结果见　图４、表４。　｛　●　甚　荟　溢　ｐＨ　图４培养基起始ｐＨ值对ＣＭＣａｓｅ的影响　表４培养基起始ｐＨ值对滤纸分解度的影响　塑塑２坚　：　：　：　鱼　垒：　滤纸　懈度　＋　＋＋　＋＋＋　＋＋＋ｔ　＋＋＋＋ｔ　＋＋＋＋　从图４、表４可以看出，该菌株在ｐＨ６．０—６．５时产　生的酶活力高且酶活稳定，初始ｐＨ值低于５．５时，酶　活力明显降低；而当ｐＨ值高于６．０时，菌株生长旺盛，　但滤纸崩溃度下降。　２．５培养温度对酶活力的影响　温度主要通过影响微生物细胞膜的流动性和生物　大分子的活性来影响微生物的生命活动。一方面，随着　温度的升高，细胞内酶反应速度加快，代谢和生长也相　应的加快；另一方面，随着温度进一步增高，生物活性　物质发生变性，细胞功能下降，甚至死亡。所以，每种微　生物都有一个最适宜生长的温度。同样，每种微生物都　有一个最适宜某种代谢产物产生的最适温度，黑曲霉　２２７７也不例外。以稻草粉（６％）为碳源，豆饼粉为氮源　（１％），２５０　ｍＬ三角瓶中加５０　ｍＬ发酵培养液，　ｐＨ６．０，１０％接种量接种，１５０　ｒ／ｍｉｎ摇瓶培养的条件下，　设定不同的温度，培养９６　ｈ，结果见图５、表５。　从图５、表５可以看出：菌株２２７７在２６℃生长相　甚　荟　溢　图５温度对ＣＭＣａｓｅ的影响　４７＝＝　－　裹５温度对滤纸分解度的影响　温度（℃）　２６　２８　３０　３２　滤纸分解度　＋　＋＋＋　＋＋＋ｔ　＋＋　对较慢、产酶活性较低；３０　ｏＣ以上的温度条件下菌株　生长迅速，但酶活力不高；２８　ｏＣ一３０　ｏＣ温度下酶活力　较高。　２．６一级培养时间和接种量对酶活力的影响　将经过不同时间培养的一级种子在冰箱冷藏后，　同时按ｌ０％接种量接人发酵培养基，培养条件同上，　结果见图６、表６。结果表明：一级种子培养时间为　１２０　ｈ，发酵培养后纤维素酶活力最高，说明在此一级　培养时间下，种子生命力最旺盛；不到１２０　ｈ，酶活很　低，说明此时种子还未发育成熟，生命力不强；１２０　ｈ后　的下滑曲线说明此后种子进入衰老期，生命力逐渐减　弱，导致接种发酵培养后酶活下降显著。　ｌ００　∞如舳加∞如∞∞９０　８０　‘ｌ　７０　。－２　６０　墨４５０。　培养时间（ｈ）　图６摇瓶一级种子培养时间对ＣＭＣａｓｅ的影响　裹６摇瓶一级种子培养时间对滤纸分解度的影响　二丝揸鲞堕　！　２　兰　塑　！　滤纸　｝懈度　＋＋　＋＋＋ｔ　＋＋＋　＋＋ｔ　＋　藿　接种量（％，培养ｉ２０　ｈ）　图７接种量对ＣＭＣａｓｅ的影响　表７接种量对滤纸分解度的影响　在一级培养１２０　ｈ后，按与发酵液体积的不同比　例接一级种子液，测定接种量对产酶的影响，结果见图　７、表７。结果表明：当产酶培养基的一级种接种量为　维普资讯 http://www.cqvip.com

＇＝＝　８　２００６．Ｖｏ１．２７．ＮＯ．９　食品研究与开：莨：　∞　∞　科学研究　１Ｏ％，培养７２　ｈ时，发酵液纤维素酶活性最高；当接种　见图１Ｏ、．表８。　∞如∞∞加ｍ　Ｏ　量小于１Ｏ％，可能因为菌种繁殖量较小，导致酶活较　低；当接种量大于１Ｏ％，随接种量的增加，酶活显著　降低，可能因为菌种开始生长繁殖较旺盛，较快地消　耗了培养液的营养物质，使其不能正常生长代谢，而　过早衰老。　２．７通气量对酶活力的影响　｛　毫　螽　髓　以稻草粉为碳源，豆饼粉为氮源，ｐＨ６．０，２９℃，转　液态发酵时间（ｈ）　速１５０　ｒ／ａｒｉｎ，培养９６　ｈ的条件下，用改变摇瓶装液量　和５０　ｍＬ装液量不变时改变摇床转速这２种方法，来　考察溶氧对该菌株产酶的影响，结果见图８、图９。　螽　髓　Ｍ　ｌＩ＾　图８不同装液■对ＣＭＣａｓｅ的影响　～　甚　囊　髓　转速（ｒ／ｒａｉｎ）　图９不同转速对ＣＭＣａｓｅ的影响　从图８、图９可以看出：装液量７５　ｍＬ，转速　１５０　ｒ／ｒａｉｎ酶活最高。装液量过多或过少，产酶量均较　低。前者由于通气量不足，后者由于通气量充足而发酵　液较少，营养物质较快消耗，但未达到产酶高峰。摇床　转速较低时，通气量不够，生长较慢，产酶量低。当摇床　转速过快时，菌丝球小而密，产酶量也不高，可能是因　为菌丝断裂过度，培养基中的营养主要被菌体用于自　身的生长所致。　２．８发酵时间对酶活力的影响　在以上最适条件下，当培养７２　ｈ时ＣＭＣ酶活达　到最大值，当培养８４　ｈ时滤纸分解度达到最高，综合　酶的２种活力水平，最适发酵周期为７６　ｈ　８４　ｈ，结果　图１０发酵产酶曲线图　表８发酵时间对滤纸分解度的影响　查叁　！　！丝　６ｏ　７２　８４　９６　ｌＯ８　滤纸分解度　＋　３结论　对黑曲霉菌株２２７７液体发酵培养条件的研究表　明：以６％稻草粉为碳源，１％豆饼粉为氮源，配以Ｏ．５％　ＫＨ：ＰＯ　，Ｏ．３％ＣａＣＩ：溶液作为摇瓶发酵的培养液，可　以得到相对较高的纤维素酶活性。利用上述培养液，　在培养温度２８℃一３Ｏ℃，初始ｐＨ　６．０—６．５，摇床１５０　ｒ／ａｒｉｎ　条件下，培养７６　ｈ墙４　ｈ，产酶活力最高，ＣＭＣ酶活为　９２．１　咖Ｌ・ｒａｉｎ，滤纸９４ｈ内完全分解。但最终酶活比　预期值要低，这可能由于ＤＮＳ试剂放置时间较长以及　测酶活过程中受环境温度的影响等原因所致。因此，酶　活测定的最佳方法还需进一步探讨。　参考文献：　【１】张树政，孟广震，等．酶学研究技术【Ｍ】．北京：科学出版社，１９８７：　１３２—１３３．　【２】湘尺孝亮．酶应用手册【ｌ岫．上海：上海科学技术出版社，１９８９：２１５￣　２６５，２６７￣２７０．　【３】田中三男．纤维素酶资源的再利用叨．应用微生物，１９８１，２（１）：１￣７．　［４】Ｖｅｇａ－Ｅｓｔｒａｄａ　Ｊ，ｅｔ　ａ１．Ｍｏｎｔｅｓ－Ｈｏｒｃａｓｉｔａｓ　Ｃ．Ｄｒａｗ－ｆｉｌｌ　ｂａｔｃｈ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｍｏｄｅ　ｆｏｒ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｘｙｌａｎ聃ｅｓ　ｂｙ　ＣｅＨｕｌｏｍｏｎａｓ　ｌｆａｖｉｇｅｎａ　Ｏｎ　ａｕｇａｒ　ｃａｎｅ　ｂａｇａｓｓｅ．，Ａｐｐｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ１．２００２　Ｍａｒ：５８（４）：４３５￣　４３８．　【５】梁霆，王遂，等．纤维素酶液体深层发酵条件的研究叨．生物技术，　１９９７，７（６）：２２—２６．　【６］舒远才，张运强，等．纤维素酶的液体发酵［Ｊ】．纤维素科学与技术，　１９９４，２（３）：８３—８７．　【７】战广琴，钱万英．生物化学实验【Ｍ】．北京：中国农业大学出版社，　２００１：５—８．　【８】蒋传英．工具酶的活力测赳　．上海：上海科学技术出版社，１９８２：　７９～８１．　【９】王成华，孙纳新，等．里氏木霉９１—３纤维素酶产生条件的研究【Ｊ】．　食品与发酵工业，１９９６，（５）：１￣５．　收稿日期：２００６－０８—０７