RFLP技术

遗传分析的根本方法是DNA水平的分析，可分为两种方法：直接对DNA全部碱基序列的分析和DNA部分碱基序列的分析。从原理上可分为两类：直接测序，主要是分析一些特定基因或DNA片段的核苷酸序列；另一类是检测基因组的一批识别位点，如性片段长度多态性（Restriction fragment length polymorphism, RFLP）分析，DNA指纹分析和随机扩增多态DNA（Random Amplified Polymophism DNA）技术等

RFLP技术是用特定的方法将核（n）DNA,叶绿体（cp）DNA,线粒体（mt）DNA或总DNA，cDNA（用特定基因克隆片段作为探针来检测生物基因组），MHC（主要相容性复合体）提取出来，用性内切酶消化后，直接或间接地得出酶切片段在长度和数量上的差异。

性片段长度多态性（Restriction fragment length polymorphism, RFLP） 是指用性内切酶消化不同基因型的DNA后产生的酶切片段在长度和数量上的差异。它的分子基础是核苷酸序列出现碱基代替或插入／缺失及倒位分子重排事件，而导致性切点或获得。在遗传多态性研究中，常用于RFLP 分析的DNA分子主要有：cpDNA、mtDNA、Rdna，单拷贝基因以及变相基因等。

方法是将上述DNA之一，用性酶切消化，电泳印迹，再用DNA探针杂交，从而得到与探针同源的DNA序列酶切后在长度上的差异。对于特定基因和DNA片段而言，还可采用PCR技术将目的DNA扩增至百万倍后直接酶切观察，使方法更为简便，节省和安全。

随机扩增多态DNA（Random Amplified Polymophism DNA，RAPD）技术是1990年出现的一项新技术，该技术通过PCR进行DNA扩增，所用引物是G＋C含量为50～70％的单个随机引物，这些引物在一定的退火条件下能与基因组DNA的互补序列配对，启动DNA的合成。该技术具有以下特点：（1）无需预先知道受试有机体基因组的序列，因而能用于所有的生物体；（2）绝大多数标记为孟德尔遗传；（3）能迅速提供重建系统发育史所有的大量的遗传标志；（4）只需极少的基因组，无需借助于有伤害的同位素；（5）耗费的人力物力少。

RFLP即性片段多态性分析，是ሆ᭐⠇ῗอ㚄重要技术。随着PCR技术的发展，目前在特定物种材料的研究中出现了基于PCR技术上的RFLP技术，与传统的RFLP技术相比，PCR－RFLP具有无需标志，灵敏度高，成本低，可重复性强的特点。该技术是建立于生物体的某些基因两端具有高度保守性而中间部分为高度可变性区，利用两端的保守区为引物，可扩增出特异片段，这些片段的中间部分存在不同序列，因此用一定的性内切酶处理这些片段，经电泳分析可得不同的酶切图谱，表现出RFLP的特征。利用这种酶切图谱可定性鉴定某一基因，如利用该方法可在不同微生物菌株中寻找Bt杀虫基因，也可用于鉴定白血病N－ras突变基因。这种方法给研究人员提高了仅需要1～2对通用即鉴定出一个类群的已知基因，又能鉴定未知基因，从而为已知基因的鉴定和未知基因的发现提高有效手段。

仪器及试剂：同酶切及RT－PCR试验

操作：

1：PCR操作

Buffer 10ul

20mM MgCl2 6ul

10mM dNTP 2ul

10mM Primer3’和5’ 各2ul

DNA模板 0.1～2ng

Taq 酶 5u

加水至100ul 混匀，加50ul矿物油

94oC 1分钟 ； 50 oC 1分钟 ； 72 oC 30秒 32循环 延伸15分钟

2： 电泳检测扩增反应产物。

3： 氯仿抽提，乙醇沉淀。

4： 酶切 20 ul 反应体系，37 oC 1小时

5： 电泳分析。

RAPD技术

RAPD技术操作：

1：仪器

PCR仪 离心机 取液器 电泳仪 电泳槽 紫外观测仪

2：试剂：RAPD试剂盒

随机引物 taq酶 d NTP Taq酶缓冲液 无菌水 石腊油 电泳试剂

3：操作：

1） 基因组DNA提取见试验一

2） 取0.5mlEpppondef 管，加入Taq酶缓冲液，100uM的d NTP，引物15ng，基因组模板DNA20ng ,0.75单位的taq酶 ，加水至20 ul，再加入30 ul石腊油，离心后，进行PCR扩增。

PCR扩增参数：

94oC变形 15秒

36oC 退火 30秒

72oC 延伸 45秒

46个循环，结束后，72oC延时4分钟

3）扩增产物与电泳上样液混匀，1.5％Agrose胶电泳分析。