S-腺苷-L-甲硫氨酸对甲苯磺酸硫酸双盐的制备方法[发明专利]

*CN102321136A*

(10)申请公布号 CN 102321136 A(43)申请公布日 2012.01.18

(12)发明专利申请

(21)申请号 201110277200.8(22)申请日 2011.09.19

(71)申请人北京化工大学

地址100029 北京市朝阳区北三环东路15

号(72)发明人谭天伟 李晓楠 姚进孝 孙龙

王峥 王杰鹏(74)专利代理机构北京聿宏知识产权代理有限

公司 11372

代理人吴大建 张宇峰(51)Int.Cl.

C07H 19/167(2006.01)C07H 1/00(2006.01)

权利要求书 1 页 说明书 6 页

(54)发明名称

S-腺苷-L-甲硫氨酸对甲苯磺酸硫酸双盐的制备方法(57)摘要

本发明公开了一种S-腺苷-L-甲硫氨酸对甲苯磺酸硫酸双盐的制备方法。该方法包括将经菌体收集、酸热法细胞破碎、提取和分离纯化制得的S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)进行沉淀，调控硫酸根与对甲苯磺酸根比例，并经干燥制得高纯度SAM对甲苯磺酸硫酸双盐。本发明工艺路线简单，处理量大，产品回收率高为75％～80％，产品中活性成分所占比例大于90％，产品纯度高为96～98％，相应指标符合药典要求，且生产成本低，可实现工业化生产。

CN 102321136 ACN 102321136 ACN 102321141 A

权 利 要 求 书

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1.一种S-腺苷-L-甲硫氨酸对甲苯磺酸硫酸双盐的制备方法，包括：

步骤A，收集菌体；步骤B，提取SAM，制得SAM萃取液；步骤C，对SAM萃取液进行超滤，制得SAM滤液；步骤D，采用离子交换法对SAM滤液进行离子交换处理，制得SAM洗脱液；步骤E，对SAM洗脱液进行沉淀处理，制得SAM沉淀；步骤F，制备SAM对甲苯磺酸硫酸双盐溶液；步骤G，干燥SAM对甲苯磺酸硫酸双盐；其中，步骤B采用酸热法对步骤A所收集的菌体进行破碎及萃取，反应温度为30～60℃，反应时间控制在0.5～3h。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤B的反应温度为45～55℃。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤B中所述酸为硫酸溶液，其浓度为0.1～0.5M，用量为2～5L/kg湿菌体。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤D包括用离子交换树脂处理SAM滤液，使SAM吸附于离子交换树脂表面，然后用去离子水洗脱杂质，再用洗脱剂洗脱SAM，其中，所述离子交换树脂为大孔弱酸性离子交换树脂。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述离子交换树脂的交换容量为90～120g SAM/L树脂。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤D中所述SAM滤液的进料浓度为4～10g/L，进料速度为1～4BV/h，进料量为12～22.5BV。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤D中所述去离子水的流速为1～4BV/h，用量为4～6BV。

8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤D中所述洗脱剂为硫酸溶液，其浓度为0.05～0.25M，流速为1～4BV/h。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤F采用对甲苯磺酸/硫酸溶液将SAM沉淀溶解，制得SAM对甲苯磺酸硫酸双盐溶液，其中SAM/对甲苯磺酸/硫酸的比例为1∶1∶1.5～1∶3∶3。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述对甲苯磺酸/硫酸溶液的浓度为0.5M～2M。

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说 明 书

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S-腺苷-L-甲硫氨酸对甲苯磺酸硫酸双盐的制备方法

技术领域

[0001]

本发明涉及生物工程的生化分离领域，更具体地说，本发明涉及一种S-腺苷-L-甲硫氨酸对甲苯磺酸硫酸双盐的制备方法。

背景技术

[0002] S-腺苷-L-甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine，SAM，SAMe或AdoMet)是甲硫氨酸的有机四价硫形式(金属锍)的磺酰化合物，被称为“活性甲硫氨酸”，是广泛存在于生物体内的一种重要代谢中间体，1952年首先由Cantoni发现。SAM是双手性物质，具有2种异构体：(R，S)-SAM和(S，S)-SAM，只有(S，S)-SAM具有生物活性。在生物体内，SAM是由L-甲硫氨酸(L-Met)和三磷酸腺苷(ATP)经SAM合成酶(S-adenosylmethionine synthetase)催化合成。由于SAM含有一个能激活相邻碳原子的亲核攻击反应的高能锍原子，因而具有转甲基、转硫基、转氨丙基等作用。SAM参与了体内40多种生化反应，与蛋白质、核酸、神经递质、磷脂质和维生素的合成密切相关，并连接多胺和谷胱甘肽的转化。在欧洲，SAM已作为处方药广泛用于肝病、抑郁症、关节炎等疾病的治疗；在美国，已经成为一种畅销的保健品。我国有众多的肝炎、关节炎以及抑郁症患者，SAM的需求量也将不断增长，产品的市场开发前景广阔。

[0003] SAM分子由于高能锍离子的存在，表现出极端的不稳定性。无论是溶液或是干燥状态，室温或高于室温，中性或碱性条件下，均能生成不同的降解产物。SAM的失活反应可按照3种不同的机理进行，最主要的失活反应是通过氨基酸链上的羧基氧对γ-碳原子进行分子内亲核攻击，从而裂解形成5’-甲硫腺苷(5’-methylthioadenosine，MTA)和高丝氨酸内酯(homoserine)，随后内酯水解；其次是(S，S)-SAM自发消旋为非生物活性的(R，S)-SAM。此外，SAM进行水解，生成腺嘌呤(adenine)和S-戊糖甲硫氨酸(S-pentosylmethionine)。[0004] SAM硫酸盐和SAM盐酸盐在干燥、低温条件下，稳定性仍较差，因此只能被用于一般生化研究。US3954726，US4028183证实SAM的对甲苯磺酸硫酸双盐的稳定性比单纯的SAM盐酸盐、硫酸盐有很大的提高，在45℃干燥条件下，前者6个月后基本没有损失，而后两者6个月后全部损失；因此，临床上使用的SAM盐主要是SAM对甲苯磺酸硫酸双盐。目前有许多关于SAM双盐制备以及通过添加物来提高稳定性的报道。US3954726、US4057686虽然均能够制得较纯的SAM双盐，但由于需要价格较高的反应物，不适合工业化生产。EPA0141914虽然提供了一种适合工业化生产的SAM双盐制备方法，但其破碎用的乙酸乙酯有机溶剂不易回收，且需要对废菌丝体进行干燥，避免其上残留的有机溶剂挥发。此外，树脂的处理能力有限，相同处理量需要的树脂量较大，洗脱液需要经过另一种树脂处理，以吸附其中的杂质，步骤复杂。EPA1091001采用的破碎方式很环保，但其对设备要求严格。其选用的树脂有较高的交换容量，但其除杂能力有限，洗脱后需要选用树脂脱色。CN1907996其破碎需要用有机溶剂，回收困难；离子交换过程洗脱步骤复杂，耗水量大；需要过阴离子交换柱脱色浓缩；洗脱液产品浓度低，浓缩12倍后的浓度类似于本专利未浓缩的浓度。[0005] 姚进孝，等人，“热水提取酿酒酵母中S-腺苷-L-甲硫氨酸的研究，生物加工过程，

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说 明 书

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2008，6(1)，74～77”，采用热水法直接提取酿酒酵母胞内产物S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)，并对影响SAM抽提的反应条件进行了优化，得出的最佳实验条件为：每30g湿菌体加入热水100mL、硫酸浓度0.25mol/L、搅拌转速160r/min，反应温度70～76℃、反应时间10min。采用该方法SAM的抽提率可达90％以上。但是，SAM是一种热不稳定性物质，当溶液温度大于60℃时，SAM的降解速率迅速增大。当反应时间超过30min时，SAM严重降解，SAM的抽提率降低到50％以下。尤其是随着处理量增大，受热不均匀程度增加，升温和降温速度减小，导致菌体大量降解，SAM的抽提率降低，造成较大的SAM损失。因此，为降低SAM降解率，减小SAM的损失，SAM提取过程要求严格控制反应温度和反应时间，并要求系统具有较高的升温及降温速度，对设备和操作要求较高，成本较高，该方法仅限于实验室使用，不适于工业应用。

[0006] 目前，需要开发一种适合工业化生产的、低损耗、低成本、高收率、高纯度的SAM对甲苯磺酸硫酸双盐的制备技术。发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术的不足，提供一种S-腺苷-L-甲

硫氨酸对甲苯磺酸硫酸双盐的制备方法。该方法用于制备SAM对甲苯磺酸硫酸双盐，处理量大，纯度高，收率高，成本低廉，并适于工业化生产。[0008] 为此，本发明提供了1.一种S-腺苷-L-甲硫氨酸对甲苯磺酸硫酸双盐的制备方法，包括：

[0009] 步骤A，收集菌体；[0010] 步骤B，提取SAM，制得SAM萃取液；[0011] 步骤C，对SAM萃取液进行超滤，制得SAM滤液；[0012] 步骤D，采用离子交换法对SAM滤液进行离子交换处理，制得SAM洗脱液；[0013] 步骤E，对SAM洗脱液进行沉淀处理，制得SAM沉淀；[0014] 步骤F，制备SAM对甲苯磺酸硫酸双盐溶液；[0015] 步骤G，干燥SAM对甲苯磺酸硫酸双盐；[0016] 其中，步骤B采用酸热法对步骤A所收集的菌体进行破碎及萃取，反应温度为30～60℃，反应时间控制在0.5～3h。步骤B的反应温度优选为45～55℃。[0017] 在本发明的一个实施例中，在制备SAM的发酵过程中，采用酿酒酵母高密度发酵，通过补加前体L-甲硫氨酸，使所得到的发酵液具有较高的富含SAM的菌体含量。步骤A，在4℃条件下，以6000rpm的转速将发酵液离心处理10min，收集菌体。[0018] 根据本发明方法，步骤B的反应过程中均质机的转速控制在300～10000rpm。步骤B中所述酸为硫酸溶液，其浓度为0.1～0.5M，用量为2～5L/kg湿菌体。采用冷水将细胞破碎液降温，并在4℃条件下，以6000rpm转速离心处理10min，收集上清液，得到SAM萃取液，SAM萃取液收率为85％～90％。[0019] 在本发明的一个实施例中，步骤C采用超滤膜对SAM萃取液进行超滤处理，以除去蛋白质等杂质。所述超滤膜为截留分子量为6000～10000的超滤膜。超滤步骤损失很少，SAM滤液收率大于98％。[0020] 根据本发明方法，步骤D包括用离子交换树脂处理SAM滤液，使SAM吸附于离子交

[0007]

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换树脂表面，然后用去离子水洗脱杂质，再用洗脱剂洗脱SAM，其中，所述离子交换树脂为大孔弱酸性离子交换树脂。所述离子交换树脂的交换容量为90～120g SAM/L树脂。[0021] 根据本发明方法，离子交换处理过程中通过15％～20％的NaOH将pH控制在4～7。该离子交换树脂对杂质吸附量少，除杂过程简单。[0022] 在本发明的一个实施例中，步骤D中所述SAM滤液的进料浓度为4～10g/L，进料速度为1～4BV/h(BV为柱体积)，进料量为12～22.5BV。所述去离子水的流速为1～4BV/h，用量为4～6BV。所述洗脱剂为硫酸溶液，其浓度为0.05～0.25M，流速为1～4BV/h。所制得的洗脱液中SAM浓度为22～35g/L，SAM洗脱液回收率为93～96％。[0023] 在本发明的另一个实施例中，步骤E将相当于洗脱液体积6～10倍的丙酮加入SAM洗脱液进行沉淀处理，静止陈化24h，滤去上清液，制得SAM沉淀。[0024] 根据本发明方法，步骤F采用对甲苯磺酸/硫酸溶液将SAM沉淀溶解，制得SAM对甲苯磺酸硫酸双盐溶液，其中SAM/对甲苯磺酸/硫酸的比例为1∶1∶1.5～1∶3∶3。所述对甲苯磺酸/硫酸溶液的浓度为0.5M～2M。[0025] 在本发明的一个实施例中，步骤G采用冷冻干燥或者真空干燥法，将SAM对甲苯磺酸硫酸双盐干燥，制得纯度为96～98wt％的SAM对甲苯磺酸硫酸双盐，产品为白色粉末。[0026] 本发明在30～60℃条件下，采用酸热法进行细胞破碎和SAM萃取，萃取过程对系统升温和降温速度要求不高，菌体处理量大，细胞破碎率和SAM提取率高，且所制得的萃取液中不含残留有机溶剂，使本发明所选树脂实现了对SAM较大的吸附容量和较强的吸附专一性。根据本发明方法所制得的洗脱液所含的SAM与硫酸根、对甲苯磺酸的配比可调控为符合成盐的比例，且杂质含量少、SAM浓度高，从而可以省略脱色除杂以及浓缩步骤，大大简化了分离过程。沉淀用的丙酮进行回收后可重复使用。本发明工艺路线简单，处理量大，产品回收率高达75％～80％，产品中活性成分(S，S)-SAM所占比例大于90％，产品纯度高达96～98％，相应指标符合药典要求，且生产成本低，可实现工业化生产。具体实施方式

[0027] 下面将结合实施例来详细说明本发明，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围。[0028] 实施例

[0029] 实施例1：

(1)在制备SAM的发酵过程中，采用酿酒酵母高密度发酵，通过补加前体L-甲硫

氨酸，使所得到的发酵液具有较高的富含SAM的菌体含量。发酵结束后，在4℃条件下，以6000rpm的转速将30L发酵液离心处理10min，得到约10kg湿菌体。[0031] (2)取8kg步骤(1)中所制得的湿菌体，加入24L50℃、0.1M H2SO4溶液，在50℃条件下，均质处理1h，均质器转速为500rpm。菌体破碎后用冷水降温，并在4℃条件下以6000rpm的转速离心处理10min去除菌体碎片，得到SAM萃取液，其产量、浓度及收率见表1。

[0032] (3)采用截留分子量为10000的超滤膜对步骤(2)所制得的SAM萃取液进行超滤处理，去除蛋白质类杂质，制得SAM滤液。

[0033] (4)用15％的NaOH溶液将步骤(3)所制得的SAM滤液的pH调节至5，送入柱体积

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约为1.9L的离子交换柱进行离子交换处理，其树脂的交换容量为110g/L树脂，SAM的进料浓度为7.2g/L，进料速度为1.5BV/h，进料量为15.3BV；进料结束后用6BV的去离子水洗脱杂质，去离子水的流速为4BV/h；最后用0.15M的H2SO4溶液作洗脱剂洗脱离子交换树脂表面所吸附的SAM，H2SO4溶液的流速为2BV/h，得到SAM洗脱液，其产量及浓度见表1。

[0034] (5)加入相当于步骤(4)所制得的SAM洗脱液7倍体积的丙酮对步骤(4)所制得的SAM洗脱液进行沉淀处理，静止陈化24h，滤去上清液，收集SAM沉淀。

[0035] (6)采用浓度为1M的对甲苯磺酸/硫酸溶液溶解步骤(5)中所制得的SAM沉淀，制得SAM对甲苯磺酸硫酸双盐溶液，其SAM/对甲苯磺酸/硫酸的比例为1∶1∶2。[0036] (7)将步骤(6)中所制得的浓缩SAM对甲苯磺酸硫酸双盐溶液进行冷冻干燥，得到白色粉末状SAM对甲苯磺酸硫酸双盐，其纯度、产量及SAM的总回收率见表1。[0037] 实施例2：

[0038] 实施例2与实施例1不同的是：

[0039] (2)取1kg步骤(1)中所制得的湿菌体，加入5L30℃、0.2M的H2SO4溶液，在30℃条件下，均质处理3h，均质器转速为300rpm，结果见表1。

[0040] (3)采用截留分子量为6000的超滤膜对步骤(2)所制得的SAM萃取液进行超滤处理。

[0041] (4)用20％的NaOH溶液将步骤(3)所制得的SAM滤液的pH调节至7，送入柱体积约为0.3L的离子交换柱进行离子交换处理，其树脂的交换容量为90g/L树脂，SAM的进料浓度为4.0g/L，进料速度为4.0BV/h，进料量为22.5BV；去离子水的用量为5BV，流速为1BV/h；硫酸溶液的浓度为0.05M，流速为1BV/h，结果见表1。

[0042] (5)加入相当于步骤(4)所制得的SAM洗脱液6倍体积的丙酮对步骤(4)所制得的SAM洗脱液进行沉淀处理。

[0043] (6)采用浓度为0.5M的对甲苯磺酸/硫酸溶液溶解步骤(5)中所制得的SAM沉淀，制得SAM对甲苯磺酸硫酸双盐溶液，其SAM/对甲苯磺酸/硫酸的比例为1∶1∶1.5。[0044] (7)将步骤(6)中所制得的浓缩SAM对甲苯磺酸硫酸双盐溶液进行真空干燥，结果见表1。

[0045] 实施例3：

[0046] 实施例3与实施例1不同的是：

[0047] (2)取10kg步骤(1)中所制得的湿菌体，加入20L60℃、0.5M的H2SO4溶液，在60℃条件下，均质处理0.5h，均质器转速为600rpm，结果见表1。

[0048] (3)采用截留分子量为6000的超滤膜对步骤(2)所制得的SAM萃取液进行超滤处理。

[0049] (4)用20％的NaOH溶液将步骤(3)所制得的SAM滤液的pH调节至4，送入柱体积约为2.1L的离子交换柱进行离子交换处理，其树脂的交换容量为120g/L树脂，SAM的进料浓度为10.0g/L，进料速度为1.0BV/h，进料量为12.0BV；去离子水的用量为4BV，流速为2BV/h；硫酸溶液的浓度为0.25M，流速为4BV/h，结果见表1。

[0050] (5)加入相当于步骤(4)所制得的SAM洗脱液8倍体积的丙酮对步骤(4)所制得的SAM洗脱液进行沉淀处理。

[0051] (6)采用浓度为2.0M的对甲苯磺酸/硫酸溶液溶解步骤(5)中所制得的SAM沉

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淀，制得SAM对甲苯磺酸硫酸双盐溶液，其SAM/对甲苯磺酸/硫酸的比例为1∶3∶3。[0052] (7)将步骤(6)中所制得的浓缩SAM对甲苯磺酸硫酸双盐溶液进行真空干燥，结果见表1。

[0053] 实施例4：

[0054] 实施例4与实施例1不同的是：

[0055] (2)取5kg步骤(1)中所制得的湿菌体，加入20L45℃、0.2M H2SO4溶液，在45℃条件下，均质处理2h，均质器转速为500rpm。菌体破碎后用冷水降温，并在4℃条件下以6000rpm的转速离心处理10min去除菌体碎片，结果见表1。

[0056] (3)采用截留分子量为10000的超滤膜对步骤(2)所制得的SAM萃取液进行超滤处理，去除蛋白质类杂质，制得SAM滤液。

[0057] (4)用20％的NaOH溶液将步骤(3)所制得的SAM滤液的pH调节至6，送入柱体积约为1.3L的离子交换柱进行离子交换处理，其树脂的交换容量为100g/L树脂，SAM的进料浓度为5.8g/L，进料速度为2BV/h，进料量为17.3BV；进料结束后用6BV的去离子水洗脱杂质，去离子水的流速为3BV/h；最后用0.1M的H2SO4溶液作洗脱剂洗脱离子交换树脂表面所吸附的SAM，H2SO4溶液的流速为1.5BV/h，结果见表1。

[0058] (5)加入相当于步骤(4)所制得的SAM洗脱液6倍体积的丙酮对步骤(4)所制得的SAM洗脱液进行沉淀处理，静止陈化24h，滤去上清液，收集SAM沉淀。

[0059] (6)采用浓度为1M的对甲苯磺酸/硫酸溶液溶解步骤(5)中所制得的SAM沉淀，制得SAM对甲苯磺酸硫酸双盐溶液，其SAM/对甲苯磺酸/硫酸的比例为1∶2∶2。[0060] (7)将步骤(6)中所制得的浓缩SAM对甲苯磺酸硫酸双盐溶液进行冷冻干燥，结果见表1。

[0061] 实施例5：

[0062] (2)取7kg步骤(1)中所制得的湿菌体，加入17L55℃、0.3M H2SO4溶液，在55℃条件下，均质处理1h，均质器转速为400rpm。菌体破碎后用冷水降温，并在4℃条件下以6000rpm的转速离心处理10min去除菌体碎片，结果见表1。

[0063] (3)采用截留分子量为6000的超滤膜对步骤(2)所制得的SAM萃取液进行超滤处理，去除蛋白质类杂质，制得SAM滤液。

[0064] (4)用15％的NaOH溶液将步骤(3)所制得的SAM滤液的pH调节至5，送入柱体积约为1.6L的离子交换柱进行离子交换处理，其树脂的交换容量为112g/L树脂，SAM的进料浓度为8.5g/L，进料速度为2.5BV/h，进料量为13.2BV；进料结束后用5BV的去离子水洗脱杂质，去离子水的流速为3BV/h；最后用0.2M的H2SO4溶液作洗脱剂洗脱离子交换树脂表面所吸附的SAM，H2SO4溶液的流速为2.5BV/h，结果见表1。

[0065] (5)加入相当于步骤(4)所制得的SAM洗脱液7倍体积的丙酮对步骤(4)所制得的SAM洗脱液进行沉淀处理，静止陈化24h，滤去上清液，收集SAM沉淀。

[0066] (6)采用浓度为1.5M的对甲苯磺酸/硫酸溶液溶解步骤(5)中所制得的SAM沉淀，制得SAM对甲苯磺酸硫酸双盐溶液，其SAM/对甲苯磺酸/硫酸的比例为1∶2∶3。[0067] (7)将步骤(6)中所制得的浓缩SAM对甲苯磺酸硫酸双盐溶液进行冷冻干燥，结果见表1。

[0068] 对比例1：

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对比例1与实施例1不同的是：

[0070] (2)取1kg步骤(1)中所制得的湿菌体，采用500ml、50％的乙酸乙酯水溶液处理40min，再加入2BV(1000ml)的0.4mol/L硫酸溶液处理90min，然后对菌体进行破碎及离心处理。其他反应条件与实施例1相同，结果见表1。以对比例1步骤(2)所获得的萃取液制备与实施例1相同配比、相同质量及纯度的SAM对甲苯磺酸硫酸双盐产品，相同树脂的用量需增加50wt％。

[0071] 从上述实施例和对比例及表1可以看出，根据本发明方法进行细胞破碎和SAM萃取，由于过程中没有使用乙酸乙酯类有机溶剂，所获得的SAM萃取液中没有残留有机溶剂，离子交换过程中不存在有机溶剂对于扩散的不良影响，树脂对目标产物SAM具有较大的吸附容量和较强的吸附专一性，由此树脂的单位处理量和树脂利用率都有较大提高，目标产品的收率和纯度也有较大提高，且制备成本降低。[0072] 对比例2：

[0073] 对比例2与实施例1不同的是：

[0074] (2)取1kg步骤(1)中所制得的湿菌体，采用3L70℃、0.1M H2SO4溶液，在70℃条件下，均质处理30min，其他反应条件与实施例1相同，结果见表1。从上述实施例和对比例及表1可以看出，在70℃条件下提取SAM，由于处理量较大，菌体受热不均匀，系统升温和降温不够迅速，即使反应时间为30min，也会造成大量SAM降解，从而降低SAM萃取液收率，并最终降低SAM的总回收率；根据本发明方法提取SAM，由于反应温度较低，菌体受热较均匀，对系统升温和降温速度要求不高，不会造成SAM的降解，即使反应时间延长至3h，处理量增大到10kg，仍能获得较高的细胞破碎率和SAM提取率，从而获得较高的SAM总回收率。[0076] 表1

[0075] [0077]

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