山东医药２００８年第４８卷第４１期 论上无法恢复，目前亦无有效的治疗方法。因此临 效降低ＴＢＩ后神经细胞的凋亡程度，对继发性脑损 害有很好的保护作用。 ＦＳＤ是Ｒｈｏ激酶抑制剂，它通过抑制Ｒｈｏ激酶 床脑外伤的积极救治在于对继发性损害的防治。凋 亡是由一系列基因控制的主动过程，是迟发性神经 元死亡，对继发性脑损害病程起着至关重要的作用， 并直接影响伤者的预后。许多研究表明，继发性神 经细胞的死亡有１０％～５０％是神经细胞的凋亡；颅 脑损伤后细胞凋亡主要发生在对缺血敏感的海马、 活性，从而有效改善血管痉挛，保证脑血流供应；同 时抑制自由基的形成，促进轴突再生，保护神经元， 改善预后。有研究证实，ＦＳＤ可显著减少沙土鼠缺 血损伤模型的神经元死亡。我们研究证实，ＦＳＤ可 以有效降低ＴＢＩ后细胞凋亡率，这可能是ＦＳＤ发挥 脑保护作用的一个机制。 ［参考文献］ ［１］王国强，廖维宏，李芳，等．创伤性脑损伤诱导海马细胞凋亡模型 的建立［Ｊ］．第三军医大学学报，２０００，２２（９）：８２６￣２９． （收稿日期：２００８＿ｏ８．３１） 齿状回和大脑皮质的神经细胞。本研究显示，ＴＢＩ 组１ ｄ时凋亡率１０．８２％，３ ｄ时达高峰１１．３３％，７ ｄ 时显著下降；ＦＳＤ能有效降低ＴＢＩ后细胞凋亡率。 结合ＨＥ染色图片可以看出，细胞凋亡率越低的时 期，死亡细胞数量越少，存活细胞形态越趋于完整， 与周边细胞的排列也越趋于整齐。提示ＦＳＤ能有 ＵＣ—ＭＳＣ移植对ＭＲＬ／ｌｐｒ鼠脾脏和淋巴 ｃｏ４ ｃＤ去Ｆｏｘｐ３＋Ｔ细胞水平的影响 李荣良，黄诚，戴小丽 （盐城卫生职业技术学院，江苏盐城２２４００６） ［摘要］２４只ＭＲＬ／ｌｐｒ鼠随机分为３组，一次移植组于１８周龄时尾静脉输注脐带间充质干细胞（ＭＳＣ）悬液０．５ ｎ１１，－二次移植组分别于１８、１９、２Ｏ周龄时尾静脉输注脐带ＭＳＣ悬液０．５ ｍｌ，对照组于１８周龄时尾静脉输注生理盐水 ０．５ ｎ１ｌ。ＭＲＬ／Ｉｐｒ鼠输注脐带ＭＳＣ后，用流失细胞仪检测脾脏和淋巴结ｃｏ；ｃ聪Ｆｏｘｐ３ Ｔ细胞百分率。结果： ＭＲＬ／Ｉｐｒ鼠经一次或三次脐带ＭＳＣ移植后脾ｃｏ；ｃ Ｆｏｘｐ３ Ｔ细胞百分率均较对照组升高，但淋巴结ｃｏ；ｃｏ； Ｆｏｘｐ３ Ｔ细胞百分率均较对照组降低。认为异种ＭＳＣ移植可上调ＭＲｌＪｌｐｒ ｃｏ；ｃｏ；Ｆｏｘｐ３ Ｔ细胞水平，ｃｏ；ｃｏ； Ｆｏｘｐ３ Ｔ细胞水平上调可能是ＭＳＣ移植治疗系统性红斑狼疮有效的机制之一。 ［关键词］Ｔ淋巴细胞；Ｆｏｘｐ３；间质干细胞移植；红斑狼疮，系统性 ［中图分类号］Ｒ３９２．４ ［文献标识码］Ｂ ［文章编号］１００２—２６６Ｘ（２００８）４１－００２７￣２ 间充质干细胞（ＭＳＣ）是骨髓中除造血干细胞 组８只。一次移植组：体质量３１．４～４１．１ ｇ，于１８ （ＨＳＣ）外的另一类干细胞，其可通过直接接触和分 泌细胞因子等发挥免疫调节作用，ＭＳＣ的特性为其 异基因移植并在宿主体内发挥免疫调节作用提供了 依据。２００７年１２月～２００８年５月，我们采用脐带 周龄时尾静脉输注脐带ＭＳＣ悬液０．５ ｍｌ，细胞数１ ×１０。；三次移植组：体质量３３．０～４０．２ ｇ，分别于 １８、１９、２０周龄时尾静脉输注脐带ＭＳＣ悬液０．５ ｍｌ， 细胞数１×１０。／次；对照组：体质量３６．９～３８．０ ｇ，于 ＭＳＣ（ＵＣ—ＭＳＣ）输注ＭＲＬ／ｌｐｒ鼠后，检测和评估其 １８周龄时尾静脉输注生理盐水０．５ ｍｌ。 １．２试剂及仪器 试剂：低糖（ＬＧ）一ＤＭＥＭ培养 基，ＲＰＭＩ １６４０培养基，胎牛血清（ＦＢＳ），人淋巴细 胞分离液，人调节性Ｔ细胞染色试剂盒。破膜液： 脾脏和淋巴结ｃｏ；ＣＤ２；Ｆｏｘｐ３ Ｔ细胞的表达水 平，初步探讨异基因脐带血ＭＳＣ移植对系统性红斑 狼疮（ＳＬＥ）的治疗作用和可能的作用机制。 １材料与方法 １．１实验动物及分组ＭＲＬ／ｌｐｒ鼠２４只，雌性，１８ 将破膜浓缩液与破膜稀释液按１：３配比混匀，一个 样本（约１×１０。个细胞）用量为１ ｍｌ，需新鲜配制， 储存时间不超过１ ｄ。１×破膜缓冲液：将１０×破膜 缓冲液与去离子水按１：９配比混匀待用。仪器： ２７ 周龄，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，饲养 ＳＰＦ级动物房。全部ＭＲＬ／ｌｐｒ鼠随机分为３组，每 ＭＣＯ一１５ＡＣ型ＣＯ，恒温细胞培养箱，ＯＬＹＭＰＵＳ—ＣＫ２ 光学倒置显微镜，Ｌｅｇａｎｄ ＲＴ恒温离心机，ＦＡＣＳＣａｌｉ— ｂｕｒ型流式细胞仪。 １．３方法 １．３．１人脐带ＭＳＣ体外分离培养脐带来自产科 经自然分娩的健康捐赠者。将脐带标本切成ｌ～２ １１１１１１ 组织块，先后分别与０．０７５％Ⅱ型胶原酶和 ０．１２５％胰蛋白酶３７℃孵育３０ ｒａｉｎ。消化产物经 １００ ｐｊｎ滤器过滤后获得细胞悬液，离心后重悬于含 ５％ＦＢＳ的ＬＧ—ＤＭＥＭ培养基（其中补充１０ ｎｇ／ｍｌ 血管内皮生长 子、１０ ｎｇ／ｍｌ内皮生长因子、１００ Ｕ 青霉素／链霉素及２ ｍＭ Ｌ一谷氨酰胺），按Ｉ Ｘ １０。细 胞／ｃｍ 接种于２５ ｃｎｌ 培养瓶，置５％ＣＯ 、３７ ｏＣ培 养，７２ ｈ后换液，去掉非贴壁细胞，以后每３ ｄ换液１ 次，当细胞达到６０％～８０％融合时用０．２５ ｇ／Ｌ胰酶 消化，按１ Ｘ １０。细胞／ｃｍ 接种密度传代。 １．３．２ ｃｗ ＣＤ，：Ｆｏｘｐ３ Ｔ细胞检测单个核细胞 ２ Ｘ １０。经ＰＢＳ洗涤后平均分至两试管，分别作检测 管和同型对照管。均加入异硫氰荧光素标记的鼠抗 人ＣＤ ／异藻青蛋 Ｉ（ＡＰＣ）标记的鼠抗人ＣＤ Ｃｏｃｋｔａｉｌ抗体，４℃避光２０ ｒａｉｎ后ＰＢＳ洗涤，各加入 新鲜配制的破膜液１ ｍｌ，４℃避光６０ ｒａｉｎ后破膜缓 冲液洗涤，各加入正常鼠血清封闭１５ ｒａｉｎ，检测管加 人藻红蛋白（ＰＥ）标记的Ｆｏｘｐ３单克隆抗体，同型对 照管加入ＰＥ标记的鼠ｌｇＧ ２ ａ，４ ｃｃ避光３０ ｒａｉｎ后 破膜缓冲液洗涤，流式细胞仪检测。用同型对照确 定荧光阴性范嗣，根据细胞的前向角散射光和侧向 角散射光初步圈取淋巴细胞门，每份标本中测定淋 巴细胞门中１０ ０００个淋巴细胞中ＣＤ；ＣＤ，：Ｆｏｘｐ３ Ｔ细胞的百分牢。 １．３．３脐带ＭＳＣ的收集与移植ＭＲＬ／ｌｐｒ鼠待脐 带ＭＳＣ体外培养至ｌ Ｘ １０。后，０．２５ ｇ／Ｉ 胰酶消化 收集，经生理盐水洗两遍．加入０．５ ｍ１生理盐水中， 于ＳＰＦ级动物房中经尾静脉输注移植ＭＲＬ／Ｉｐｒ鼠。 １．４统计学方法采用ＳＰＳＳ １２．０统计软件，结果 以 ±Ｓ表示，各组问差异采用样本ｔ检验和配 对ｔ检验分析 检验水准 ：０．０５。 ２ 结果 脐带ＭＳＣ一次和ｊ次移植ＭＲＬ／ｌｐｒ鼠后脾脏 和淋巴结ＣＤ；ＣＤ，：Ｆｏｘｐ３ Ｔ细胞百分率ＭＲＬ／Ｉｐｒ 鼠经一次（２．５４％±１．Ｏ１％，ｎ＝８）和三次（３．３４％ ±１．９２％，ｎ＝８）脐带ＭＳＣ移植后脾脏ＣＤ４＋ＣＤ，： Ｆｏｘｐ３ Ｔ细胞百分率均较对照组（１．５６％± ２８ 山东医药２００８年第４８卷第４１期 ０．４７％，ｎ＝８）高（Ｐ＜０．０５），但淋巴结ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３ Ｔ细胞百分率（一次移植组：０．８１％±０．５９％，ｎ＝７； 二三次移植组：０．９９％±０．５８％，ｎ＝５）均较对照组 （２．２０％±０．６３％，ｎ＝８）低（Ｐ＜０．０１），一次和三次 移植组问比较无统计学意义。 ３讨论 ＳＬＥ不仅存存Ｔ、Ｂ淋巴细胞异常，还存在ＨＳＣ 和ＭＳＣ缺陷，即ｓＩ Ｅ是干细胞病。Ｔｒｅｇ是一类具有 主动免疫调节功能的Ｔ细胞群，在维持自身免疫耐 受中起重要作用，Ｔｒｅｇ缺陷可引起ＳＬＥ等多种自身 免疫病。Ｔｒｅｇ表型有ＣＤ 、Ｆｏｘｐ３、糖皮质激素诱导 的肿瘤坏死因子受体、细胞毒Ｔ淋巴细胞相关抗原一 ４等。Ｔｒｅｇ通过以下途径发挥免疫抑制作用：①抑 制自然杀伤细胞和细胞毒性Ｔ细胞的细胞毒作用； ②抑制单核细胞和树突状细胞的吞噬和抗原递呈功 能；③抑制ＣＤ；、ＣＤｓ Ｔ淋巴细胞增殖和产生细胞 因子；④抑制Ｂ淋巴细胞产生自身抗体。 ＭＳＣ具有以下特点：①来源广泛；②具有自我 更新和多向分化潜能；③体外易扩增传代并保持稳 定的表型和多向分化潜能；④无主要组织相容性复 合体（ＭＨＣ）性；⑤无免疫原性；⑥具有造血支 持和免疫调节作用；⑦诱导免疫耐受。近年来ＭＳＣ 移植主要用于ＧＶＨＤ的防治，取得了较好疗效。Ｌｉ 等¨用不同品系小鼠ＭＳＣ与脾细胞其移植较单独 脾细胞移植后受者鼠脾脏中ＣＤａ＊ｃＤ Ｔｒｅｇ水平和 Ｔｒｅｇ／ＣＤ；Ｔ细胞比值均高，平均存活期延长，ＧＶＨＤ 发生率降低，表明ＭＳＣ移植可通过上调脾细胞中 Ｔｒｅｇ水平发挥免疫抑制作用。我们的研究发现， ＭＰｄＪｌｐｒ鼠经一次机ｊ次脐带ＭＳＣ移植后脾脏ＣＤ； ｃＤ Ｆｏｘｐ３ Ｔ细胞百分率均较对照组高，但淋巴结 ＣＤ４＋ｃＤ Ｆｏｘｐ３ Ｔ细胞百分率均较对照组低，一次 和 次移植组间比无差异。表明异种ＭＳＣ移植也 能上调睥脏中Ｔｒｅｇ水平，此作用无时问和剂量依赖 性。脾脏中Ｔｒｅｇ水平上调可能是ＭＳＣ发挥免疫抑 制作用的途径之一，而淋巴结中Ｔｒｅｇ水平下调是否 与ＭＳＣ动员淋巴结中Ｔｒｅｇ迁移有关有待进一步研 究。 ［参考文献］ １］¨Ｈ，Ｇｕｏ ＺＫ，“ＸＳ，ｅｔ ａ１．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎｄ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｅ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｒａｓｐｌｅｎｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃ。ｙｔｅｓ ａｆｆｅｃｔｅｄ ｂｙ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ａ ｍｕｒｉｎｅ ａｌｌｏｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅ ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ｍｏｄｅｌ：Ｊ］ Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ， ２００７，１６（１）：８５－９５． （收稿日期：２００８－０８．１３）
