果糖及低聚果糖的分离纯化

目录

一、 除杂 .............................................................. 2 二、 脱色 .............................................................. 2

1. 活性炭脱色 ....................................................... 2 2. 新生态碳酸钙法脱色 .............................................. 2 3. 树脂脱色 ........................................................ 2

3. 1 LSA-8吸附树脂 ............................................. 2 3. 2 D318 树脂 ................................................... 2 4. 离子交换 ........................................................ 2 三、 提纯 .............................................................. 3

1. 分子量不同的糖的分离 ............................................ 3

1. 1纳滤分离 ................................................... 3 1. 2分级纳滤分离................................................ 3 1. 3柱层析凝胶分离.............................................. 4 2. 相同分子量的糖的分离 ............................................ 4

2. 1葡萄糖和果糖的分离 ......................................... 4

2. 1. 1化学试剂法 ............................................ 4 2. 1. 2吸附分离 .............................................. 4 2. 1. 3 GOD-CAT双酶法氧化 .................................. 5 2. 1. 4复盐法 ................................................ 5 2. 1. 5连续色谱分离(CSEP) ........................................................................ 5

3. 手性拆分 ........................................................ 6

3. 1分子印迹聚合物分离手性分子 ................................. 6

3. 1. 1功能单体的选择 ........................................ 6 3. 1. 2 M I P s 的制备 ......................................... 6 3. 2手性膜拆分法 ............................................... 7 3. 3优先结晶方法 ............................................... 7 3.4化学拆分法 .................................................. 8

3. 4. 1生成非对应异构体拆分法 ................................ 8 3. 4. 2生物化学拆分法 ........................................ 8

参考文献 ............................................................... 9

一、 除杂

1. 通过低温下冷冻和用乙醇-正己烷除去油脂和脂类物质； 2. 加入磷酸和氢氧化钙，絮凝沉淀出果胶；

3. 用盐析法、等电点法、溶剂沉淀法(sevage法)除去蛋口质； 4. 加淀粉酶除去淀粉；

5. 用阳离子聚丙烯酥胺吸附溶液中带负电荷的部分如蛋口质、多糖、蹂质、树胶、 淀粉和单宁等,最佳条件52°C, pH二6, CPAM添加量为0. 08%,絮凝时间3h. 二、 脱色 1 •活性炭脱色

通过极差最优化分析，确定出最佳影响因素pH＞脱色温度〉脱色时间〉活性炭 用量，最优化工艺条件为:活性炭用量1.4%,脱色温度70°C, pH值3. 8,脱色时 间50min. 后的低聚果糖溶液中低聚果糖含量，结果显示低聚果糖在脱 色前后并无损失. 2•新生态碳酸钙法脱色

在低聚果糖液中加入Ca(OH)：混合均匀后，再缓慢通入C0：来反应生成碳酸 钙，这时新生态碳酸钙便与低聚果糖液中的色素发生吸附作用，从而达到脱色的 效果.在原样液锤度:19°Bx透光率:92.31%, pH值:6.4电导率:26mV的条件下， 测试结果不如活性炭.⑴ 3•树脂脱色 3.1 LSA-8吸附树脂

在温度为70°C,pH为6的条件下用脱色2h,实验结果色素的吸附率高达92. 35%； (11) 3. 2 D318 树脂

树脂用量为低聚果糖样品溶液的3. 7%, pH二5. 2,脱色时间3h,脱色温度为52°C. 4. 离子交换

钟振声等选择了 D392大孔阴离子交换树脂对大豆低聚糖进行脱色，在与低聚糖 比为1:11的条件下，常温脱色3-4小时，色素的吸附率达86%. 1141

1:1

经试验验证的透光率为99. 7%,同时在实验过程中用高效液相色谱 方法检测活性炭脱色

三、提纯

低聚果糖溶液中非有效成分葡萄糖、果糖、蔗糖，其相对分子质量分别为 180,

180, 342；有效成分蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖的相对分子量分别为 504, 666, 828. 1. 分子■不同的糖的分离

1.1纳滤分离

最佳条件：跨膜压差为1.1 MPa,料液浓度为10 g/100 g,温度40°C,循 环流量6 L/min,

PH=6.

1131

物料初始浓度30g/L.操作压力0. 2Mpd、纯化15 倍.⑴1

1. 2分级纳滤分离

先将样品通过0.3微米的微滤膜，将其透过液作为分级纳滤的母液.⑴采用 全回流方式，对样品共进行两级纳滤膜分离处理和一次反渗透膜回收处理.第一 级纳滤膜分离，在0. 3MPa, 25°C,初始料液浓度为10倍稀释下，选用JN 1812-34 纳滤膜，对原始料液进行分离，之后三倍洗脱，截留蔗果五糖；第二级纳滤膜分 离,在0. 4MPa, 25°C下，选用DK1812C-47D纳滤膜，对一级纳滤的透过液进行 分离，截留蔗果三糖与蔗果四糖；经过两级纳滤和反渗透分离，可以将低聚果糖 溶液按其所含溶质的不同分为三部分，分别〉800部分为蔗果五糖、200^800部分 为低聚果糖和〈200部分为葡萄糖、果糖及部分蔗糖混合物.最后对二级透过液进 行反渗透膜过滤，回收其中的葡萄糖、果糖等成分和大量的水.工艺流程图如下:

-级纳滤 二圾縊

图44分级纳滤分离工艺图

Fig4-1 classification NF process chart

m

为了避免因膜污染而造成的实验误差，每处理完一次样品后，均用蒸懈水对 纳滤装置和纳滤膜进行3次清洗，每次清洗时间约为8min.如果长时间（大于一 周）应该先用浓度为2%的表面活性剂进行清洗，最后用蒸憎水冲洗至无泡沫为止. 将清洗干净的膜管保存在0. 5%的甲醛溶液或1%的亚硫酸氢钠溶液中，以防止长 霉长菌，损坏膜表面层.实验证明，冲洗时间和浸泡时间分别为60 min和90 min 时二者都可使膜的纯水透过通量恢复系数达到100%左右.【⑶ 1. 3柱层析凝胶分离

吸取一定量低聚果糖（过0.45微米的膜）均匀滴加在层析柱聚丙烯酥胺凝胶 表面，打开底部阀门，待低聚果糖刚好渗入凝胶时关闭阀门，用少量的脱气超纯 水洗下残留在柱壁上的糖液，打开阀门让洗脱液刚好渗入凝胶表面后关闭.接上 泵开始洗脱，同时将柱下端接在蒸发光散射检测器（N：流速为2.5L/min,温度为 100°C）上直接进行检测分析.⑴

在1. 6cm* 100cm的玻璃柱上最佳的层析条件:洗脱速度0 2 mL/min上样量 0. 5 ml_（样液质量浓度0. 4g/ml）、柱温40°C,以Megazlaae公司的标准品为对 照，经HPLC和MS分析，证明层析分离所得组分峰4峰、3和峰2分别是蔗果三 糖、蔗果四糖和蔗果五糖。而且经HPLC面积归一化法定量分析，证明分离产品 蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖蔗和果六糖的含量分别为99. 9%、99. 94%. 99. 33% 和 97.89%。5

2. 相同分子■的糖的分离

2.1葡萄糖和果糖的分离

2.1.1化学试剂法

取混合物少许于洁净的试管中，然后滴入澄清的石灰水，振荡，不久有沉淀 出现.化学反应式如下：

CGHI2O6（葡萄糖）+ Ca（0H）2-> CH2（）6・Ca（0H）2（葡萄糖化钙）

CeHi2Os （果糖）+ Ca （OH） 2+H：0 - C6H1:06*Ca（0H）2-H:0 l （果糖化钙） 把上述浊液进行过滤，取沉淀于盛有少量水的试管中，然后通入CO：, 乂有沉淀 出现. C02 + C6HJ）6・Ca（0H）2・H：0 - CaC03 I + CeHnOe + 2H：0 过滤后将滤液蒸发、结晶，即得果糖晶体.

在上面滤出的葡萄糖化钙溶液中通入CO：,同样有沉淀出现. C02 + CeHi206・Ca（0H）2f CaC03 I + CcHiaOe + 2H20 过滤后将滤液蒸发、结晶，即得葡萄糖晶体.⑶ 2.1.2吸附分离

2. 1. 2. 1聚苯乙烯型强酸性阳离子交换树脂

吸附分离柱为一根直径为8 mm,长为400 mm带有恒温夹套的玻璃柱.柱内 填充经C屮离子交换后的聚苯乙烯型强酸性阳离子交换树脂，先吸取一定量的糖 液，从吸附柱上方以一定的速度滴入，待糖液加完后，继续用同样的速度加蒸憎 水将糖份洗脱，整个加入液体的速度控制在与吸附柱流出液的速度近乎相等为 宜，以保持液面位置及柱内液体流速恒定.在加完糖样同时开始在吸附柱下端收 集流出液.山】温度控制为(34. 8-35. 2),洗脱液为去离子水最佳分离条件为：进 样质量分数10.5%、进样体积5 ml,洗脱速率0. 282 mL/min,在分离时间达到 100 min左右时,流出液中果糖含量可达90%(干

基).⑸

2. 1.2.2模拟移动床(SMB)技术

SMB是一种利用色谱吸附分离原理进行液体操作的设备.它以逆流连续操作 方式，通过变换固定床吸附设备的物料进出口位置，产生相当于吸附剂连续向下 移动，而物料连续向上移动的效果•吸附塔内的吸附剂对果糖的滞留作用远大于 葡萄糖.当精制后的糖液进入装有吸附剂的吸附塔后，果糖被吸附，而葡萄糖不 被吸附，在解吸剂的作用下.葡萄糖与解吸剂先从吸附塔一端流出，而果糖与解 吸剂最后流出，除去解吸剂，得到果糖和葡萄糖，达到分离的LI的.为了连续高 效地分离，若干吸附塔吊联，各部分进、出料口接上管线通过分配系统，经多通 旋转分配阀定时同时向前逐一切换，以实现连续分离•经过SMB的分离操作后所 得产物的果糖含量高达90%.⑺ 2. 1.3 G0D-CAT双酶法氧化

在葡萄糖氧化酶的催化作用下把葡萄糖氧化生成荷萄糖酸和过氧化氢，形成 的过氧化氢被过氧化氢酶作用放出1/2 0=,供反应体系的需要.反应过程中，加 入氢氧化钙调整反应pH值，使产生的葡萄糖酸与钙离子结合生成葡萄糖酸钙， 再结晶，经过分离纯化即可制得葡萄糖酸钙.这样就可将水解液中的葡萄糖和果 糖分离.反应方程式如下：

仙心+O2+H2O—QH^Oy+HzO： H2O2—H2O+I/2O2

C6H|2O7+Ca (OH )2―Q(GH| 心)2 °H20

最佳工艺条件：反应温度35°C,pH5. 5,酶用量GOD 85u/g葡萄糖,CAT 1235u/g 葡萄糖，底物浓度20% (w/v),反应20h. 191 2. 1.4复盐法

混合糖液与氯化钙作用，生成果糖一 CaCL的复盐，或与RC1作用生成葡 萄糖-N&C1的复盐，然后使其自母液中分离. 2. 1.5连续色谱分离(CSEP)

用泵向树脂柱进料,进料液浓度为50. 54 g/100g, pH值4.0,体积68ml,

CAT

吸附剂流向

再循环

慢流出产品 进料 快流出产品 洗脱剂

进料结束立即泵入去离子水，操作温度60 °C,进料、洗脱流速为7ml/min.收集 流出液.驻留时间为20min,在20min内进料340ml,洗脱水量735ml,洗脱回填 量535ml,再吸附区回填量495ml.山检测结果知，洗脱液(果糖产品)的纯度为 98.64%,果糖浓度39. 29%,葡萄糖产品中的葡萄糖纯度为98. 58%,果糖捉取收 率98. 35% •图中慢流出产品为果糖产品，快流出产品为葡萄糖产品，洗脱剂为 去离子水，吸附剂为树脂.⑺ 3. 手性拆分

31分子印迹聚合物分离手性分子

分子印迹技术主要在聚合过程中引入模板分子(包括原子、离子、分子、复合 物或分子、离子、大分子的聚集体)，通过模板分子与功能单体结合形成结合位 点，交联后将模板分子固定在聚合物中，随后除去部分或者全部模板分子，形成 孔穴，通过识别位点与分子印迹孔穴的共同作用来识别模板分子.采用该技术制 备的聚合物通常称为分子印迹聚合物(MIPs) . 131 3.1.1功能单体的选择

果糖中含有醇羟基，为弱酸性基团，易于与碱性功能单体形成氢键作用.因 此选择弱碱性的丙烯酥胺(AM)和2 —乙烯毗咙(2-VP)两种功能单体来制备MIPs. 利用'H NMR研究功能单体与模板分子通过氢键作用后醇疑基质子化学位移的变 化，确定分子上的醇疑基能够与功能单体发生氢键作用. 3. 1.2 M I P s的制备

在50mL的两口烧瓶中加入一定量的模板分子，再加入适量乙膳作为致孔剂. 加入一定比例的功能单体，超声通氮排氧，于冰水浴中预聚合8h.再加入EDMA 交联剂和引发剂•之后超声通氮气lOmin除氧，置于60°C水浴中聚合 12h.聚合反应后得到的白色固体经粉碎、研磨、过筛，取粒径为20 - 60微米之 间的颗粒，用丙酮沉降三次，除去过小的颗粒，于60°C下真空干燥后备用.

将真空干燥后的MIPs以干法添加到HPLC色谱柱中.装入MIPs的总量约为 0. 8g.以MIPs作为高效液相色谱固定相，拆分果糖的外消旋体.

分子印迹聚介物的制备过程如图1.4所示,

non-covatent

polymeriso

croesMinker

covalent wMication

9 0

lioand exchange

diwpl po^ymor tornptoto imeracttons remove tempi aw

assoaauai dissooabon

3.2手性膜拆分法

用于手性拆分的支撑液膜是将膜液（溶剂和手性选择剂）通过毛细管力吸附 在多孔固体膜（液体的支撑膜）的孔道中，这种液膜也可称为浸渍式液膜。

在支撑液膜（SLM）中，具有手性选择能力的载体溶解于一定的液体溶剂之中, 通过与某个对映异构体特异性的结合，将其从上相运输到下相，从而实现手性分 离.分离果糖的D,L构型，可尝试酒石酸等手性选择剂。Hadik等用基于多孔聚 丙烯中空纤维膜的支撑液膜研究了 D, L乳酸的拆分.作为手性选择剂的N-3, □ 一二硝基苯屮酰基-L-丙氨酸-辛酯溶解在疏水的液膜（屮苯）中，整个溶液固定在 多孔聚丙烯中空纤维膜的孔中，最终将D,L-乳酸分开

也叫接种结晶拆分法，在饱和或过饱和的外消旋体溶液中加入一个对映异构 体的晶利使该对映异构体稍稍过量因而造成不对称环境，这样旋光性与该晶种 相同的异构体就会从溶液中结晶出来.\"\"对于不生成外消旋混合物的化合物，将 其转化成盐，接种结晶拆分法工艺简单，成本较低LI,效果较好;但通常只能间 歇生产，一次收率较低。“龄

3 4化学拆分法

3. 4. 1生成非对应异构体拆分法

该法利用手性试剂与外消旋体反应，生成两个非对映异构体，再利用它们物 理性质（如溶解度、蒸汽压、吸收系统等）的不同，将其拆分，最后再把这两个非 对映异构体分别复原为原来的对映体。通常拆分碱性物质用酸性拆分剂，拆分酸 性物质用碱性拆分剂。5）常用的拆分剂有嗅化樟脑磺酸、Q-苯基乙胺、酒石酸 等。Yamada S.等用嗅化樟脑磺酸作为拆分剂，对DL — P — HPG进行拆分，多次 循环D-HPG的最终收率可达92%。此法反应步骤长、收率低，通常拆分剂价格 昂贵，关键是选择好拆分剂，使其达到使用周期长、回收容易的LI的。 3. 4. 2生物化学拆分法

某些微生物和霉菌在外消旋体的稀溶液中生长时，破坏其中一种对映体的速 度比另一种快。例如酵母在DL -氨基酸中，易与L 一对映体反应而剩下D 一对 映体，从而达到拆分的LI的。生物化学拆分法可用完整的微生物细胞或从微生物 中提取酶作为生物催化剂。生物催化剂的区域立体选择性强、反应条件温和、操 作简便、成本较低、公害少，且能够完成一些化学方法难以完成的反应。但是生 物拆分法也有菌种筛选困难、酶制剂不易保存、产物后处理工作量大以及通常只 能得到一种对映体等缺点。

Yokozeki等以醛为原料，经Bucherer：反应合成DL — 5 —对疑基苯乙内酥 服,然后用恶臭假单胞菌的二氢喘唳酶催化选择性水解为N —氨屮酥一 D — HPG, 再经化学或酶法脱氨屮酰基得D-HPC,收率达92 %o I1S,

参考文献

【1】武金良.高纯低聚果糖分离纯化技术的研究［D］.广西大学，2008.

【2】张涛，江波.发酵法生成高纯度低聚糖［J］.无锡轻工大学学报，2002, 21(3). ［3］ 孙洪登.分离葡萄糖和果糖混合物的实验［J］.化学教学，1995(4). ［4］ 李秀琴，杨星惠，安素欣.低聚果糖的纯化方法［J］.河北化工,2003(1) 【5】刘佐才，侯平然.果糖与葡萄糖的分离［J］.北京理工大学学报，2001, 21(6). 【6】袁文辉，关建郁，叶振华.连续环状色谱分离果糖-葡萄糖的研究［J］.华南理 工大学学报，1999, 27(10)

［7］ 熊结青.连续式色谱分离系统分离果糖的应用研究［D］.天津大学,2008 ［8］ 佟飞.联蔡酚与氨基酸及其衍生物分子印迹聚合物的制备及手性分离［D］. 哈尔滨工程大学，2011.

【9】郑喜群，王文侠，刘晓兰,鲁莉.酶法分离葡萄糖和果糖的研究［J］.中国甜 菜糖业，2001, (2).

【10】黃蓿,杨立荣，吴坚平.手性拆分技术的工业应用［J1.化工进展，2002, 21(6). 【11】谢锐,褚良银，曲剑波.手性拆分膜的研究与应用新进展［J］.现代化工, 2004, 24 (4).

【12】任烽.应用纳滤技术纯化雪莲果中低聚果糖的研究［D］.北京中西药大学, 2009.

［13］翁桂华.应用膜技术制备高纯度低聚糖［D］.江南大学，2009.

【14】游懿•雪莲果低聚果糖提取分离及分析研究［D］.长沙理工大学，2011. 【15】沈树宝•吸附分离果糖和葡萄糖的基础研究［J］.南京化工学院学报, 1990, 12(2).

【16】林纯，章伟光.手性分子识别与分离研究进展［J1.华南师范大学学报, 2014, 46(3).

【17】王涛，黄广君.聚丙烯酥胺凝胶柱分离制备低聚果糖单组分［J］.广西大学 学报，2010, 35(3).

【18】任国宾，詹予忠.手性拆分技术进展［J］.河南化工，2002, (1).