葛根素的分离与鉴定

葛根素的分离与鉴定

崔颖,梁剑平,郭延生

1

1

2

(1.中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所中国农业科学院新兽药工程重点开放实验室,甘肃兰州730050;

2.甘肃农业大学动物医学院,甘肃兰州730070)

摘要 [目的]筛选出适于工业化生产葛根素的提取、分离、纯化工艺路线。[方法]用熔点、红外光谱、核磁氢谱和紫外分光光度法分析鉴定提取的葛根素精品。[结果]葛根素精品的熔点为327～328℃,与葛根素标准品的熔点基本相同;在薄层色谱上,精品与标准品的

r

斑点在紫外灯下均显蓝色荧光,Rf值均为0.31;精品的红外数据为IRUKB(cm-1):3398、1630、1584、1515、1443、1384、1257、1178、1118、Max1081、1041,标准品的红外数据为IRUM1631、1607、1514、1447、1396、1273、1210、1103、1059、1008;精品的核磁氢谱数据ax(cm):3370、

与文献报道相符;在250nm处测定精品的吸光度,由回归方程计算出精品的葛根素含量为97%,液-液萃取法的葛根素精品的产率为1.41%。[结论]液-液萃取法分离纯化葛根素成本低,操作简单,可用于工业化生产。关键词 野葛根;葛根素;提取;分离

中图分类号 Q946.91 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2009)13-05817-02

IsolationandIdentificationofPuerarinCUIYingetal (KeyLaboratoryofNewAnimalMedicineProject,LanzhouInstituteofAnimalHusbandryandVeterinaryPharmaceutics,ChineseA-cademyofAgricalturalSciences,Lanzhou,Gansu730050)Abstract [Objective]Thepurposeofthestudywastoscreenouttheprocessrouteofextracting,isolatingandpurifyingpuerarin,whichwassuitableforindustrialproduction.[Method]Theextractedandrefinedpuerarinwasanalyzedandidentifiedbymeltingpointmethod,infraredspectrophotometry,nuclearmagneticresonancehydrogen(NMR-H)spectroscopyandUVspectrophotometry.[Result]Themeltingpointofrefinedpuerarinwas327-328℃anditwasbasicallyidenticalwiththemeltingpointofstandardpuerarin.Onthinlayerspectrum,boththedotsofrefinedandstandardpuerarinshowed

Br

bluefluorescenceunderUV-lightlampandbothoftheirRfvalueswere0.31.TheinfrareddataofrefinedpuerarinwereIRUK(cm-1):3398,1630,Max1584,1515,1443,1384,1257,1178,1118,1081and1041andthatofstandardpuerarinwasIRUMax(cm):3370,1631,1607,1514,1447,1396,1273,1210,1103,1059and1008.TheNMR-Hdataofrefinedpuerarinaccordedwithliteraturereports.Theabsorbanceofrefinedpuerarinwasdetectedat250nm,thepuerarincontentoftherefinedwascalculatedtobe97%throughregressionequation.Theyieldrateofrefinedpuer-arinofliquid-liqiudextractionwas1.41%.[Conclusion]Isolationandpurificationofpuerarinbyliquid-liqiudextractionwascheapincost,simpletoop-erateandcouldbeusedinindustrialproduction.Keywords Puerarialobata;Puerarin;Extraction;Isolation

KBr

-1

KBr

-1

葛根素(Puerarin)存在于豆科葛属植物中,在野葛根

胶G(青岛海洋化工有限公司);乙醇、酸性三氧化二铝、氯仿、甲醇、正丁醇均为分析纯;羧甲基纤维素钠(CMC)。1.2 试验方法1.2.1 备用。1.2.2

薄层色谱分析。取适量薄层层析硅胶G,加入0.5%

的CMC溶液(1∶4)搅拌均匀,制备薄层板,自然晾干后,105℃活化1h,置干燥器中备用。展开剂为氯仿-甲醇(4∶1)。

在葛根总黄酮的提取过程中和葛根素的每一步分离纯化中,都用薄层层析法(TLC)进行跟踪检查,具体方法为:将标准溶液和样品溶液点于同一块薄层板上,用展开剂展开后置紫外灯下观察,葛根素显蓝色荧光斑点,Rf值为0.31。1.2.3

葛根总黄酮的提取。称取干燥野葛根饮片2000g于标准溶液的制备。精密称取葛根素标准品5mg于

25ml容量瓶中,加入95%乙醇使溶解并定容,冷藏保存,

(Puerarialobata)中含量较高[1]。野葛根在我国分布广泛,是中医临床常用的祛风解表药,具有降低血管阻力,改善心、脑血液循环,减慢心率,降低心肌耗氧量等作用。野葛根中主要含有大豆甙、大豆甙元、葛根素等多种异黄酮类化合物。葛根素已作为原料药在临床上广泛用于治疗心绞痛、高血压、心梗和视网膜阻塞等心脑血管疾病。近年来有异黄酮类化合物用于畜牧业的报道[2-3],研究发现,异黄酮类物质能显著促进动物生长,减少腹脂沉积,改善繁殖泌乳性能,提高免疫力。目前,关于葛根中提取分离葛根素的研究报道较多[4-6],但均有不完善之处,笔者根据葛根素的理化特性,研究筛选出一套成本低、操作简单、易于工业化生产的提取、分离、纯化工艺路线,所得产品经熔点、薄层色谱、红外光谱和核磁共振氢谱分析鉴定,其纯度较高,经紫外分光光度计测定,葛根素的含量为97%,产率为1.41%。1 材料与方法1.1 试验材料

1.1.1 仪器设备。紫外-可见分光光度计(HITACHI557);红外分光光度计(HITACHI220-50,美国DELL公司);核磁共振分析仪(MERCURY400BBP,美国);旋转蒸发仪(RE120);熔点仪。

1.1.2 药品试剂。野葛根(购自兰州佛慈制药厂,产地陕西);葛根素标准品(中国药品生物制品检定所);薄层层析硅

基金项目 甘肃省科技攻关项目(970614)。

作者简介 崔颖(1956-),女,河南渑池人,副研究员,从事新兽药的

研究工作。

收稿日期 2009-02-16

3颈圆底烧瓶中,一个瓶口连接空气冷凝管,一个瓶口插入温度计。加入95%乙醇2000ml,58～60℃水浴温浸29h,过滤,滤液备用,滤渣中再次加入1000ml95%乙醇,同样条件下进行第2次温浸,过滤,取少量滤液作TLC检查,结果发现仍有葛根素,因此,重复以上操作,至第7次时,TLC结果显示滤渣中已无葛根素。将前8次滤液合并,在旋转蒸发仪上减压浓缩为浸膏。1.2.4

葛根素的分离与纯化。

1.2.4.1 浸膏溶解。将浓缩得到的浸膏用400ml正丁醇和水饱和正丁醇交替振荡溶解1h,静置2h,吸取上清液。在溶解的过程中,正丁醇和水饱和正丁醇的量逐步递减并用TLC进行检测,TLC结果显示第17次上清液中已无葛根素。将前16次上清液合并后浓缩至原体积的一半,待用。

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Br-1

素标准品的红外数据为IRUK70、1631、1607、Max(cm):33

1.2.4.2 水和正丁醇的反复萃取。将溶解得到的上清液用水进行萃取,第1次所用水量为上清液体积的4倍;第2次为3.5倍;第3次为3倍;第4次为2.5倍;第5次以及第5次以后均为2倍。TLC跟踪检测,结果发现第11次水萃液中已无葛根素。合并前10次水萃液并浓缩至原体积的一半,再用正丁醇对浓缩后的水萃液进行萃取,所用正丁醇的体积第1次为水萃液的1/2;第2次为1/3;第3次为1/4,依次类推。TLC检测出第9次萃取液中已无葛根素。合并前8次萃取液,待用。

1.2.4.3 三氧化二铝柱脱色。将正丁醇萃取液通过酸性三氧化二铝柱脱色,减压浓缩,浓缩液静置后析出沉淀,抽滤,经自然干燥后得到粗品75g。

1.2.4.4 重结晶。取粗品75g,加入冰醋酸260ml,加热使溶解,冷却,静置,得到白色粒状精品28.2g。2 结果与分析2.1 结构鉴定

2.1.1 熔点测定。精品的熔点(mp)为327～328℃,与葛根素标准品作混合对照,mp不下降。

2.1.2 薄层色谱分析。精品与葛根素标准品的斑点在紫外灯下均显蓝色荧光,Rf值均为0.31。

2.1.3 红外光谱鉴定。用KBr压片法测定,扫描波长500～

Br-1

4000cm-1。精品的红外数据为IRUK1630、Max(cm):3398、

1514、1447、1396、1273、1210、1103、1059、1008。两者的数据基本一致,红外光谱吻合(图1)。

注:上图为标准品;下图为产品。

Note:Theabovecurvestandsforstandardsubstance;Thebelowcurve

standsforproduct.

图1 葛根素标准品与产品红外光谱图

Fig.1 IRofthestandardsubstanceandproductofpuerarin

2.1.4 核磁氢谱分析。将精品溶于氘代甲醇中,在Mercury400MHz核磁共振仪上测定氢谱,以四甲基硅烷为内标物,其核磁氢谱数据为1HNMR:δ:8.04(1H,d,J=9Hz;C5-H),6.98(1H,d,J=9Hz;C6-H),7.36(2H,d,J=9Hz;C2,6-H),6.98(2H,d,J=9Hz;C3,5-H),8.14(1H,s,C2-H),5.09(1H,d,J=10Hz;C1-H),与文献报道相符[7](图2)。

1584、1515、1443、1384、1257、1178、1118、1081、1041;葛根

图2 产品葛根素核磁共振氢谱Fig.2 1HNMRoftheproductpuerarin

1 综合以上mp、TLC、IR、HNMR的分析鉴定结果,可判断

型HITACHI紫外-可见分光光度计进行程序扫描(190～900nm),确定最大吸收峰的波长(λmax)为250nm。

2.2.2 标准曲线的制备。精密吸取标准溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml置于10ml容量瓶中,各加入1ml95%乙醇,用蒸馏水定容,摇匀。同时以1.0ml95%乙醇加水至10ml作空白对照,在250nm波长处测定吸光度。处理数据,得回归方程为:A=0.0658C+0.2469,r=0.9997。

2.2.3 含量测定。精密称取干燥至恒重的葛根素精品25mg于50ml容量瓶中,加入95%乙醇使溶解并定容,吸取1.0ml于25ml容量瓶中,加蒸馏水定容,摇匀。在250nm处测定吸光度,由回归方程计算出精品中葛根素的含量为97%。3 讨论

该精品为葛根素,其结构式见图3。

图3 葛根素化学结构式

Fig.3 Thechemicalstructuralformulaofpuerarin

(1)根据葛根素在正丁醇和水中溶解度都小且2种溶剂不相混溶的特点,笔者采用液-液萃取法分离纯化葛根素。正丁醇溶解葛根总黄酮浸膏后,用水进行多次萃取,使葛根素

(下转第5882页)

2.2 定量分析

2.2.1 吸收波长的确定。取“1.2.1”项下的标准溶液,用557

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全部溶进水相,脂溶性杂质被除去;同样,用正丁醇进行萃取时,葛根素又全部溶进有机相,水溶性杂质被除去。通过上述2次萃取过程,葛根素得到了分离纯化。该方法成本低(所用正丁醇和乙醇可大部分回收),操作简单。

(2)萃取过程分为2个阶段:第一阶段为水萃取,所用水量与上清液体积比(V水∶V有)逐级递减,即逐级提高萃取效率(E%=D/D+V水/V有,D为萃取常数[7])。这样有利于葛根素从上清液中萃出,因为葛根素在上清液中的含量随着萃取次数的增多而逐渐减少。第二阶段为正丁醇萃取,其V水∶V有也逐级递减,这一方面有利于提高葛根素的萃取率,另一方面使所用的正丁醇溶剂体积不至于过大,从而使葛根素在正丁醇中浓度较高,而有利于进一步的分离纯化。

(3)据文献报道[8]葛根提取液的TLC在紫外灯下显蓝色荧光斑点的是葛根素,提示笔者在探索提取、分离工艺时,采用薄层板上荧光斑点的消失作为终点的判断指标是可行的。

(4)近红外光谱分析技术具有快速、无污染、样品不需要预处理和同时检测多组分等优点。但它只能反映化合物的一些特征官能团,并不能准确地鉴定化合物。笔者进行了近红外光谱快速检测葛根素的研究,查阅有关文献[9]可

知:3398为-OH特征峰,1630为C=O特征峰,1584、1515、1443、1384四个吸收峰为芳香系统特征峰,1257、1178、1118三个吸收峰为C-O-C的特征峰。这符合葛根素的结构特点,再综合核磁图谱,可做出比较准确的判断。

(5)采用紫外分光光度法对产品中葛根素的含量及纯度进行了检测,所得产品葛根素的纯度为97%,用此方法从野葛根中提取、分离、纯化葛根素精品的产率为1.41%,该方法可用于工业化生产。参考文献

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