一种富铁酵母及其生产方法[发明专利]

[12]发明专利申请公布说明书

[21]申请号200810105973.6

[51]Int.CI.

C12N 1/18 (2006.01)C12R 1/865 (2006.01)

[43]公开日2009年11月11日[22]申请日2008.05.06[21]申请号200810105973.6

[71]申请人安琪酵母股份有限公司

地址443003湖北省宜昌市中南路24号[72]发明人俞学锋 李知洪 余明华 姚娟 张彦 夏

长虹

[11]公开号CN 101575579A

[74]专利代理机构北京路浩知识产权代理有限公司

代理人王朋飞

权利要求书 2 页 说明书 11 页

[54]发明名称

一种富铁酵母及其生产方法

[57]摘要

本发明提供了一种富铁酵母(Saccharomyces cerevisiae)Z2.1CCTCC M 205127。该菌株耐铁性能稳定，生长速率快，对铁的利用率高，含铁高，可以达到80000mg/kg，其中生物铁含量可达90％。

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权 利 要 求 书

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1、一种富铁酵母(Saccharomyces cerevisiae)Z2.1 CCTCC M205127。

2、权利要求1所述富铁酵母的生产方法，其包括：菌种活化、扩大培养和发酵培养。

3、如权利要求2所述的方法，其还包括在发酵培养后对培养物进行分离、干燥和包装。

4、如权利要求2或3所述的方法，其中菌种活化的方法是：将所述富铁酵母菌种接种到含糖量为5～25％、铁浓度为150～5000μg/ml、pH值为4～6.5的麦芽汁固体斜面上，在26～35℃培养24～48小时。

5、如权利要求2或3所述的方法，其中扩大培养包括： 一级液体种子培养：将活化的菌种接种1～4环到装有100～500ml的含糖量为5～25％、铁浓度为150～5000μg/ml、pH值为4～6.5的麦芽汁专用培养瓶中，在26～35℃培养24～48小时； 二级液体种子培养；将一级液体种子培养液接种到装有10～40L的含糖量为5～25％、铁浓度为150～5000μg/ml、pH值为4～6.5的卡氏培养瓶中，接种量为1％～10％，在26～35℃培养18～48小时；

发酵罐种子培养：将二级种子培养液接种到装有0.5～15m的含糖量为5～25％、铁浓度为150～5000μg/ml、补充适当的氮源和磷源、pH值为4～6.5的种子发酵罐中，接种量为1％～10％，在26～35℃培养18～48小时。

6、如权利要求5所述的方法，其特征在于，发酵罐发酵培养的方法是：将发酵罐种子培养液接种到1～300吨的含糖量为5～25％、铁浓度为150～5000μg/ml、补充适当的氮源和磷源、pH值为4～6.5的发酵罐中，接种量为5％～15％，所用的营养源采用流加方式，铁源采用流加方式加入，在26～35℃培养14～36小时。

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7、如权利要求5所述的方法，其还包括在二级发酵罐种子发酵培养，培养方法是：将发酵罐种子培养液接种到1～300吨的含糖量为5～25％、铁浓度为150～5000μg/ml、补充适当的氮源和磷源、pH值为4～6.5的发酵罐中，接种量为1％～10％，所用的营养源采用流加方式，铁源采用流加方式加入，在26～35℃培养14～36小时。 8、如权利要求7所述的方法，其特征在于，发酵罐发酵培养的方法是：将发酵罐种子培养液接种到1～300吨的含糖量为5～25％、铁浓度为150～5000μg/ml、补充适当的氮源和磷源、pH值为4～6.5的发酵罐中，接种量为5％～15％，所用的营养源采用流加方式，铁采用流加方式加入，在26～35℃培养14～36小时。

9、如权利要求3所述的方法，其中分离采用叠片式分离机分离，再用真空转鼓过滤或者用板框压滤。

10、如权利要求3所述的方法，其中，干燥 a)采用60～140℃流化态干燥；或 b)采用100～180℃喷雾干燥；或

c)用0.3～0.6Mpa的蒸汽压力滚筒干燥；或 d)采用冷冻干燥法干燥。

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说 明 书

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一种富铁酵母及其生产方法

技术领域

本发明涉及一种微生物，具体地说涉及一种富铁酵母，本发明还涉及该菌种的选育方法以及使用这种菌种进行工业生产的方法。背景技术

铁是人体和动物维持生命和生长发育所必需的营养物质，是体内必不可少的一种微量元素，参与血液中氧的运输作用。铁的缺乏会引起人体及动物贫血以及其他症状。目前，市场上的补铁产品琳琅满目，品种繁多，但其铁源主要是无机盐，对胃的刺激很大，也不利于人体的吸收和利用。

酵母细胞能直接将铁吸收，转化为生物铁，可以提高铁的生物利用度，同时能消除对胃以及肠黏膜的刺激。以酵母为载体，将化学状态下的铁转化为生物状态的铁，是开发新的铁源，提高铁的生物利用度的有效措施。富铁酵母在预防和治疗人和动物缺铁性贫血及其他一些缺铁性疾病方面发挥着显著作用。此外富铁酵母还含有丰富的蛋白质、维生素等人体必需的营养物质。

近年来，尽管有些称作“富铁酵母”的产品，但这些产品存在着明显的缺陷和不足：

一是没有对酵母菌种进行筛选、育种和驯化，经常是用随机得到的酵母菌种进行发酵生产富铁酵母。由于不同菌种对铁富集效果的差异性很大，因此产品不稳定，不适合工业化生产。 二是没有对富铁酵母发酵培养基的铁离子浓度、培养条件进行优化，虽然培养的产物称为“富铁酵母”，但酵母细胞的含铁量低，生物量不高，即使能生产，生产成本也较高，不具备可行性。

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发明内容

本发明的目的在于针对上述不足提供一种铁含量较高的富铁酵母菌种以及利用该菌种进行工业生产的方法。

由于高浓度铁离子对酵母的生产有一定的抑制，一般的酵母很难在含有高浓度铁离子的条件下生长，即使有生长速率但对铁的利用率不高。因而本发明首先筛选出耐高铁的酵母，然后在高浓度铁的培养基中不断驯化，接着通过氯化锂诱变，选出铁含量高、生长速率快、对铁的利用率高的富铁酵母菌种，将其中优选的一株命名为Z2.1。该酵母菌株已经于2005年10月25日在中国典型培养物保藏中心(CCTCC，武汉大学，邮编430072)进行了生物保藏，分类命名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，保藏编号为CCTCCM 205127。

具体地说，通过如下方法选育菌种：

1)筛选耐高铁的酵母菌种：将不同的酵母菌种接种到不同浓度的含铁培养基中培养，挑选出耐铁菌种作为驯化菌种。 2)将耐铁菌种接种到氨基酸螯合铁浓度高的培养基中多次传代培养驯化。

3)将多次传代培养驯化的菌种接种到不同氯化锂剂量上诱变。 4)将诱变的酵母菌种再进行分离筛选，利用摇瓶和小型发酵罐进行发酵选出铁含量高、生长速率快、对铁的利用率高、耐高铁的酵母菌种，即为富铁酵母菌种。 5)筛选培养基配方

麦芽汁培养基含糖量5～25％，含铁(氨基酸螯合铁)浓度为150～4500μg/ml，pH值为4～6.5。 6)筛选培养条件

温度26～35℃，搅拌培养18～48小时。

在另一个方面中，本发明提供了生产上述富铁酵母产品的方法，包括菌种活化、扩大培养、发酵罐培养，发酵罐培养结束后对培养物进行分离、干燥、包装后即得成品。

其中，菌种活化可采用本领域技术人员熟知的常规方法进行，如采用斜面菌种培养活化。

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其中，扩大培养可包括一级液体种子培养、二级液体种子培养以及发酵罐种子培养。

其生产流程如下：斜面菌种培养→一级液体种子培养→二级液体种子培养→发酵罐种子培养→发酵罐培养→分离→干燥→包装。

具体地说可采用如下方法：

1)斜面菌种培养：将耐高铁的富铁酵母菌种接种到含糖量为5～25％、铁浓度为150～5000μg/ml、pH值为4～6.5的麦芽汁固体斜面上，在26～35℃培养24～48小时。

2)一级液体种子培养：将斜面的酵母菌种接种1～4环到装有100～500ml的含糖量为5～25％、铁浓度为150～5000μg/ml、pH值为4～6.5的麦芽汁专用培养瓶中，在26～35℃培养24～48小时。 3)二级液体种子培养；将一级液体种子培养液接种到装有10～40L的含糖(麦芽汁或糖蜜或麦芽汁和糖蜜的混合物)量为5～25％、铁浓度为150～5000μg/ml、pH值为4～6.5的卡氏培养瓶中，接种量为1％～10％，在26～35℃培养18～48小时。

4)发酵罐种子培养：将二级种子培养液接种到装有0.5～15m

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的含糖(麦芽汁或糖蜜或麦芽汁和糖蜜的混合物)量为5～25％、铁浓度为150～5000μg/ml、补充适当的氮源和磷源、pH值为4～6.5的种子发酵罐中，接种量为1％～10％，在26～35℃培养18～48小时。

5)发酵罐发酵培养：将发酵罐种子培养液接种到1～300吨的含糖(淀粉水解糖或糖蜜或淀粉水解糖和糖蜜的混合物)量为5～25％、铁浓度为150～5000μg/ml、补充适当的氮源和磷源、pH值为4～6.5的发酵罐中，接种量5％～15％，所用的营养源采用流加方式，铁采用流加方式加入，在26～35℃培养14～36小时。

6)分离：采用叠片式分离机分离再用真空转鼓过滤或者用板框压滤。

7)干燥：采用60～140℃流化态干燥，干燥的产品具有活性；采用100～180℃喷雾干燥或者用0.3～0.6Mpa的蒸汽压力滚筒干燥，

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干燥产品没有活性是粉状或小片状；也可以采用冷冻干燥法干燥。 8)包装：可以采用多种形式包装成为高铁含量的富铁酵母。铁含量达到2000～50000mg/kg。

在发酵罐种子培养和发酵罐发酵培养中需要添加适量的氮源和磷源，氮源选自硫酸氨、碳酸氢铵、氨水、磷酸氨、磷酸氢氨和磷酸氢二氨，或是这些物质的组合。磷源为选自磷酸、磷酸氨、磷酸氢氨和磷酸氢二氨，或是这些物质的组合。优选为磷酸氨、磷酸氢氨和磷酸氢二氨。优选氮源和磷源的使用量均为培养基重量的1～10％。铁源为选自硫酸亚铁、葡糖糖酸涯铁、乳酸亚铁、富马酸亚铁、氨基酸螯合铁或是这些物质的组合，使用量为培养基重量的1～10％。铁源优选氨基酸螯合铁，使用量为培养基重量的1～10％，从发酵开始至发酵14小时内流加完。

如果是连续的生产可以增加一级发酵罐二级种子发酵，发酵条件是：将发酵罐种子培养液接种到1～300吨的含糖(淀粉水解糖或糖蜜或淀粉水解糖和糖蜜的混合物)量为5～25％、铁(氨基酸螯合铁)浓度为150～5000μg/ml、补充适当的氮源和磷源、pH值为4～6.5的二级种子发酵罐中，所用的营养源采用流加方式，铁采用流加方式加入，在26～35℃培养14～36小时。然后再进行发酵罐发酵，或者用离心机或板框进行分离，在4～10℃储罐或冷库中保存，然后根据需要接种到发酵罐中再进行下一级培养。此时发酵罐发酵的条件优选为：发酵罐种子培养液接种到1～300吨的含糖量为5～25％、铁浓度为150～5000μg/ml、补充适当的氮源和磷源、pH值为4～6.5的发酵罐中，所用的营养源采用流加方式，铁采用流加方式加入，在26～35℃培养14～36小时。

本发明使用的耐高铁的富铁酵母菌种，耐铁性能稳定，生长速率快，对铁的利用率高，含铁高可以达到80000mg/kg。而现有技术生产的富铁酵母铁含量通常在1000mg/kg以下，最高才到2000mg/kg。此外，本发明生产的高铁含量的富铁酵母生物铁含量高，可以达到90％。

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具体实施方式

下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。除非特别指明，本发明中所用的实验方法和试剂均为本领域技术人员所公知的方法和试剂。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不能限制本发明的保护范围。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明精神和实质的前提下，对这些实施方案中的培养基组分、含量、培养条件、分离加工条件进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。 实施例1：本发明对酿酒酵母菌种的筛选

1)将酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌种接种到不同浓度的含铁培养基中，筛选能够在高铁培养基中生长的菌种。挑选出耐铁的菌种作为驯化的菌种。

2)将耐铁的菌种接种铁含量更高的培养基上进行培养，并逐渐提高培养基中铁的含量。然后在高氨基酸螯合铁浓度的培养基上多次传代培养。

3)将传代培养的酵母菌株再进行分离筛选，利用摇瓶和小型发酵罐进行发酵选出铁含量高、生长速率快、对铁的利用率高的耐高铁的富铁酵母菌种，即为耐高铁的富铁酵母菌种。经筛选得到一株铁含量高、生长速率快、对铁的利用率高的耐高铁的富铁酵母菌种，将其命名为Z2.1，并进行了保藏。 4)筛选培养基配方

麦芽汁培养基含糖量10％，含铁(氨基酸螯合铁)量150～5000μg/ml，pH值为5.5。 5)筛选培养条件

温度30℃，搅拌培养24小时。 实施例2：富铁酵母产品的生产

生产高铁含量富铁酵母的生产流程：斜面菌种培养→一级液体种子培养→二级液体种子培养→发酵罐种子培养→发酵罐培养→分离→干燥→包装。具体工艺如下：

1)斜面菌种培养：将耐高铁的富铁酵母菌种接种到含糖量为

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10％、铁(氨基酸螯合铁)浓度为150μg/ml、pH值为5.5的麦芽汁固体斜面上，在30℃，培养24小时。

2)一级液体种子培养：将斜面的酵母菌种接种2环到装有250ml的含糖量为10％、铁(氨基酸螯合铁)浓度为150μg/ml、pH值为5.5的麦芽汁专用培养瓶中，在30℃培养24小时。

3)二级液体种子培养；将一级液体种子培养液接种到装有25L的含糖(麦芽汁或糖蜜或麦芽汁和糖蜜的混合物)量为10％、铁(氨基酸螯合铁)浓度为150μg/ml、pH值为5.5的卡氏培养瓶中，在30℃培养24小时。

4)发酵罐种子培养：将二级种子培养液接种到装有8m的含糖(麦芽汁和糖蜜各半)量为20％、铁(氨基酸螯合铁)浓度为150μg/ml，加5％磷酸氢氨、pH值为5.5的种子发酵罐中，在30℃培养48小时。

5)发酵罐发酵培养：将发酵罐种子培养液接种到150吨的含糖(淀粉水解糖和糖蜜各半)量为20％、铁(氨基酸螯合铁)浓度为150μg/ml，加5％磷酸氢氨、pH值为5的发酵罐中，所用的营养源采用流加方式，铁采用流加方式加入，在30℃培养24小时。 6)分离：采用叠片式分离机分离再用真空转鼓过滤或者用板框压滤。

7)干燥：采用100℃流化态干燥，干燥的产品具有活性 8)包装：可以采用多种形式包装成为高铁含量的富铁酵母。铁含量达到2000mg/kg左右。 实施例3：富铁酵母产品的生产

生产高铁含量富铁酵母的生产流程：斜面菌种培养→一级液体种子培养→二级液体种子培养→发酵罐种子培养→发酵罐培养→分离→干燥→包装。具体工艺如下：

1)斜面菌种培养：将耐高铁的富铁酵母菌种接种到含糖量为

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10％、铁(氨基酸螯合铁)浓度为500μg/ml、pH值为5.5的麦芽汁固体斜面上，在30℃，培养24小时。

2)一级液体种子培养：将斜面的酵母菌种接种3环到装有100ml的含糖量为10％、铁(氨基酸螯合铁)浓度为500μg/ml、pH值为5.5的麦芽汁专用培养瓶中，在30℃培养24小时。

3)二级液体种子培养；将一级液体种子培养液接种到装有10L的含糖(麦芽汁或糖蜜或麦芽汁和糖蜜的混合物)量为10％、铁(氨基酸螯合铁)浓度为500μg/ml、pH值为5.5的卡氏培养瓶中，在30℃培养24小时。

4)发酵罐种子培养：将二级种子培养液接种到装有2m的含糖(糖蜜)量为5～25％、铁(氨基酸螯合铁)浓度为500μg/ml，加1～5％磷酸氢氨、pH值为5.5的种子发酵罐中，在28℃培养48小时。 5)发酵罐发酵培养：将发酵罐种子培养液接种到1～300吨的含糖(淀粉水解糖或糖蜜或淀粉水解糖和糖蜜的混合物)量为25％、铁(氨基酸螯合铁)浓度为500μg/ml、加1％磷酸氢氨、pH值为6.5的发酵罐中，所用的营养源采用流加方式，铁采用流加方式加入，在35℃培养36小时。

6)分离：采用叠片式分离机分离再用真空转鼓过滤或者用板框压滤。

7)干燥：采用60～140℃流化态干燥，干燥的产品具有活性；采用100～180℃喷粉干燥或者用0.3～0.6Mpa的蒸汽压力滚筒干燥，干燥产品没有活性是粉状或小片状；也可以采用冷冻干燥法干燥。 8)包装：可以采用多种形式的包装成为高铁含量的富铁酵母。铁含量达到6500mg/kg左右。 实施例4：富铁酵母产品的生产

生产高铁含量富铁酵母的生产流程：斜面菌种培养→一级液体种子培养→二级液体种子培养→发酵罐种子培养→发酵罐

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培养→分离→干燥→包装。具体工艺如下：

1)斜面菌种培养：将耐高铁的富铁酵母菌种接种到含糖量为10％、铁(氨基酸螯合铁)浓度为1000μg/ml、pH值为5.5的麦芽汁固体斜面上，在30℃，培养24小时。

2)一级液体种子培养：将斜面的酵母菌种接种1～4环到装有100～500ml的含糖量为10％、铁(氨基酸螯合铁)浓度为1000μg/ml、pH值为5.5的麦芽汁专用培养瓶中，在30℃培养24小时。 3)二级液体种子培养；将一级液体种子培养液接种到装有10～40L的含糖(麦芽汁)量为10％、铁(氨基酸螯合铁)浓度为1000μg/ml、pH值为5.5的卡氏培养瓶中，在30℃培养24小时。

4)发酵罐种子培养：将二级种子培养液接种到装有0.5～15m

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的含糖(麦芽汁和糖蜜各半)量为5～25％、铁(氨基酸螯合铁)浓度为1000μg/ml，加1～5％磷酸氢氨、pH值为4～6.5的种子发酵罐中，在26～35℃培养18～48小时。

5)发酵罐发酵培养：将发酵罐种子培养液接种到1～300吨的含糖(淀粉水解糖或糖蜜或淀粉水解糖和糖蜜的混合物)量为5～25％、铁(氨基酸螯合铁)浓度为1000μg/ml、加1～5％磷酸氢氨、pH值为4～6.5的发酵罐中，所用的营养源采用流加方式，铁采用流加方式加入，在26～35℃培养14～36小时。

6)分离：采用叠片式分离机分离再用真空转鼓过滤或者用板框压滤。

7)干燥：采用60～140℃流化态干燥，干燥的产品具有活性；采用100～180℃喷粉干燥或者用0.3～0.6Mpa的蒸汽压力滚筒干燥，干燥产品没有活性是粉状或小片状；也可以采用冷冻干燥法干燥。 8)包装：可以采用多种形式的包装成为高铁含量的富铁酵母。铁含量达到13800mg/kg左右。 实施例5：富铁酵母产品的生产

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生产高铁含量富铁酵母的生产流程：斜面菌种培养→一级液体种子培养→二级液体种子培养→发酵罐种子培养→发酵罐培养→分离→干燥→包装。具体工艺如下：

1)斜面菌种培养：将耐高铁的富铁酵母菌种接种到含糖量为10％、铁(氨基酸螯合铁)浓度为5000μg/ml、pH值为5.5的麦芽汁固体斜面上，在30℃，培养24小时。

2)一级液体种子培养：将斜面的酵母菌种接种4环到装有250ml的含糖量为10％、铁(氨基酸螯合铁)浓度为5000μg/ml、pH值为5.5的麦芽汁专用培养瓶中，在30℃培养24小时。

3)二级液体种子培养；将一级液体种子培养液接种到装有25L的含糖(麦芽汁和糖蜜各半)量为10％、铁(氨基酸螯合铁)浓度为13000μg/ml、pH值为5.5的卡氏培养瓶中，在30℃培养24小时。 4)发酵罐种子培养：将二级种子培养液接种到装有10m的含糖(麦芽汁和糖蜜各半)量为20％、铁(氨基酸螯合铁)浓度为13000μg/ml，加5％磷酸氢氨、pH值为5.5的种子发酵罐中，在30℃培养48小时。

5)发酵罐发酵培养：将发酵罐种子培养液接种到150吨的含糖(淀粉水解糖或糖蜜或淀粉水解糖和糖蜜的混合物)量为20％、铁(氨基酸螯合铁)浓度为13000μg/ml、加5％磷酸氢氨、pH值为5.5的发酵罐中，所用的营养源采用流加方式，氨基酸螯合铁采用流加方式加入，在30℃培养36小时。

6)分离：采用叠片式分离机分离再用真空转鼓过滤或者用板框压滤。

7)干燥：采用60～140℃流化态干燥，干燥的产品具有活性；采用100～180℃喷粉干燥或者用0.3～0.6Mpa的蒸汽压力滚筒干燥，干燥产品没有活性是粉状或小片状；也可以采用冷冻干燥法干燥。 8)包装：可以采用多种形式的包装成为高铁含量的富铁酵母。

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铁含量达到82000mg/kg。 实例6：富铁酵母产品的生产

本实施例增加一级发酵罐种子培养，生产工艺为：斜面菌种培养→一级液体种子培养→二级液体种子培养→一级发酵罐种子培养→级发酵罐种子培养→发酵罐培养→分离→干燥→包装。所增加的一级发酵罐种子培养方法和发酵罐培养大致相同，其他工艺同实施例2，只是发酵罐发酵培养选择淀粉水解糖8％和糖蜜作碳源5％、氨水3％作氮源、磷酸氢氨2％作磷源，培养液中的铁含量为2000μg/ml，pH值为5.2，温度28～32℃鼓风培养26小时。

本实施例生产出来的高铁含量的富铁酵母铁含量达到25900mg/kg。

实施例7：富铁酵母产品的生产

本实施例的生产方法同实施例2，但在干燥过程中采用流化态干燥的方法干燥出具有活性的高铁含量的富铁酵母，干燥工艺是：进风温度120～140℃，出风温度70～100℃，干燥20～50分钟，水分小于7％。 生产工艺：

斜面菌种培养→一级液体种子培养→二级液体种子培养→发酵罐种子培养→发酵罐培养→分离→干燥→包装。 本实施例生产出来的高铁含量的富铁酵母的活细胞率达到80％以上。

综上所述，本发明的充分利用微生物遗传育种技术，微生物发酵技术，根据酵母菌对铁耐受的特性进行筛选出耐高铁的酵母菌种，再通过诱变技术选育出铁含量高、生长速率快、产率高、对铁的利用率高的耐高铁的富铁酵母菌种。针对该菌种制定的特定工艺生产出高铁含量的富铁酵母，特点是：耐铁性能稳定，生长速率快，对

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铁的利用率高；生物铁含量高，可以达到90％；该高铁含量的富铁酵母可以是活性也可是没有活性。具有更广阔的应用空间。

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