一种低分子多肽的制备方法[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 108866136 A(43)申请公布日 2018.11.23

(21)申请号 201810867788.4(22)申请日 2018.08.01

(71)申请人 李文锦

地址 531599 广西壮族自治区百色市田东

县环城路小塘开发区田东县八闽农业综合开发有限公司(72)发明人 李文锦　(51)Int.Cl.

C12P 21/06(2006.01)C07K 1/30(2006.01)

权利要求书2页 说明书5页

CN 108866136 A()发明名称

一种低分子多肽的制备方法(57)摘要

本发明公开了一种低分子多肽的制备方法，该制备方法包括以下步骤：（1）前处理：羊胎盘去杂、水洗、晾干、剪切、冷冻、超微粉碎；（2）酶解：向浆液中加水，调pH至7.7~7.8，加胰蛋白酶和Protamex，升温至40~43℃反应，滤纸过滤后取滤液；（3）提取：向酶解液中加乙醇、氯化钠和硅藻土，调pH至6.4~6.6，在10~15℃下搅后压滤，取上清液；向粗提液中加乙醇、氯化钠、硅藻土和麸皮，调pH至6.8~7.0，在3~5℃下搅后压滤，取沉淀；取沉淀冷冻，于0~10℃下超微粉碎，加水，在10~15℃下搅后有机过滤膜过滤并取滤液，冷冻，即得；过程中控温、控量、控时等，获得低分子多肽。

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1.一种低分子多肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）前处理

取新鲜羊胎盘，去除筋膜和血管，水洗，于室温下晾1~2hr；剪切成块，于-30~-20℃下冷冻8~12hr，于0~10℃下超微粉碎得到浆液；（2）酶解

搅拌条件下，向浆液中加入水，加入0.8~1.1mol/l的碳酸钠水溶液调节体系pH至7.7~7.8，加入胰蛋白酶和Protamex，升温至40~43℃进行反应，至酶解完全，用滤纸过滤后取滤液，即为酶解液；

按质量计，浆液、水、胰蛋白酶和Protamex的用量比为1:4~6:0.2~0.4:0.1~0.2；（3）提取

向酶解液中加入乙醇、氯化钠和硅藻土，加入0.8~1.1mol/l的盐酸水溶液调节体系pH至6.4~6.6，在10~15℃下搅拌30~45min，在10~15℃下以1.6~2.0Kg/cm2的压力进行压滤，取上清液，即为粗提液；按质量计，酶解液、乙醇、氯化钠和硅藻土的用量比为1:0.08~0.12:0.04~0.06:0.05~0.08；

向粗提液中加入乙醇、氯化钠、硅藻土和麸皮，加入0.8~1.1mol/l的盐酸水溶液调节体系pH至6.8~7.0，在3~5℃下搅拌30~45min，在3~5℃下以1.6~2.0Kg/cm2的压力进行压滤，取沉淀；按质量计，粗提液、乙醇、氯化钠、硅藻土和麸皮的用量比为1:0.08~0.12:0.02~0.04:0.03~0.05:0.04~0.06；

取沉淀于-30~-20℃下冷冻8~12hr，于0~10℃下超微粉碎，加入水，在10~15℃下搅拌30

用0.45μm或0.22μm有机过滤膜过滤并取滤液，于-30~-20℃下冷冻8~12hr，即得；按

~45min，质量计，沉淀和水的用量比为1:2~3。

2.根据权利要求1所述的一种低分子多肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）前处理

取新鲜羊胎盘，去除筋膜和血管，水洗，于室温下晾1.5hr；剪切成块，于-25℃下冷冻10hr，于4℃下超微粉碎得到浆液；（2）酶解

搅拌条件下，向浆液中加入水，加入1.0mol/l的碳酸钠水溶液调节体系pH至7.8，加入胰蛋白酶和Protamex，升温至42℃进行反应，至酶解完全，用滤纸过滤后取滤液，即为酶解液；

按质量计，浆液、水、胰蛋白酶和Protamex的用量比为1:5:0.3:0.15；（3）提取

向酶解液中加入乙醇、氯化钠和硅藻土，加入1.0mol/l的盐酸水溶液调节体系pH至6.5，在12℃下搅拌40min，在12℃下以1.8Kg/cm2的压力进行压滤，取上清液，即为粗提液；按质量计，酶解液、乙醇、氯化钠和硅藻土的用量比为1:0.10:0.05:0.06；

向粗提液中加入乙醇、氯化钠、硅藻土和麸皮，加入1.0mol/l的盐酸水溶液调节体系pH至6.9，在4℃下搅拌40min，在4℃下以1.8Kg/cm2的压力进行压滤，取沉淀；按质量计，粗提液、乙醇、氯化钠、硅藻土和麸皮的用量比为1:0.10:0.03:0.04:0.05；

取沉淀于-25℃下冷冻10hr，于4℃下超微粉碎，加入水，在12℃下搅拌40min，用0.22μm有机过滤膜过滤并取滤液，于-25℃下冷冻10hr，即得；按质量计，沉淀和水的用量比为1:

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2.4。

3.根据权利要求1或2所述的一种低分子多肽的制备方法，其特征在于，步骤（3）的每步中添加的乙醇和水均经过预热处理，预热的温度与其搅拌反应的温度一致。

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一种低分子多肽的制备方法

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技术领域

[0001]本发明涉及一种低分子多肽的制备方法。

背景技术

[0002]胎盘富含孕育生命所必需的所有原始生命物质。目前，胎盘尤其是羊胎盘的药用和保健功效越来越受到人们的关注。就羊胎盘而言，其中含有丰富的蛋白质、17种氨基酸、14种微量元素、磷脂、脂多糖、维生素，还有与免疫功能和机体正常运转相关的多种活性多肽，其营养成分天然搭配的比例最接近人体的需求。《本草纲目》中即对羊胎盘的功效有所记载：″羊胎，母羊腹中的胎兽，性味甘温，具有益气补虚，温中暖下，调补肾虚、羸瘦之功效″。科学家经过大量实验证实，羊胎盘还具有养血安神、丰肌泽肤、延年益寿等功效，是大补元气的滋补强壮药。综上所述，胎盘的功能特性日益为人们所认识，客观上也提出了胎盘深加工的要求。由于胎盘中含有大量人体必需的活性物质，因此，从中提取功能性的多肽具有广阔的开发前景。

[0003]然而现有技术中制备的多肽中含有相当的高分子量多肽，不利于皮肤吸收，了其应用。

发明内容

[0004]本发明的目的是提供一种低分子多肽的制备方法，来获得低分子多肽。[0005]本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：[0006]一种低分子多肽的制备方法，包括以下步骤：[0007](1)前处理

[0008]取新鲜羊胎盘，去除筋膜和血管，水洗，于室温下晾1～2hr；剪切成块，于-30～-20℃下冷冻8～12hr，于0～10℃下超微粉碎得到浆液；[0009](2)酶解

[0010]搅拌条件下，向浆液中加入水，加入0.8～1.1mol/l的碳酸钠水溶液调节体系pH至7.7～7.8，加入胰蛋白酶和Protamex，升温至40～43℃进行反应，至酶解完全，用滤纸过滤后取滤液，即为酶解液；[0011]按质量计，浆液、水、胰蛋白酶和Protamex的用量比为1∶4～6∶0.2～0.4∶0.1～0.2；[0012](3)提取

[0013]向酶解液中加入乙醇、氯化钠和硅藻土，加入0.8～1.1mol/l的盐酸水溶液调节体系pH至6.4～6.6，在10～15℃下搅拌30～45min，在10～15℃下以1.6～2.0Kg/cm2的压力进行压滤，取上清液，即为粗提液；按质量计，酶解液、乙醇、氯化钠和硅藻土的用量比为1∶0.08～0.12∶0.04～0.06∶0.05～0.08；[0014]向粗提液中加入乙醇、氯化钠、硅藻土和麸皮，加入0.8～1.1mol/1的盐酸水溶液调节体系pH至6.8～7.0，在3～5℃下搅拌30～45min，在3～5℃下以1.6～2.0Kg/cm2的压力

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进行压滤，取沉淀；按质量计，粗提液、乙醇、氯化钠、硅藻土和麸皮的用量比为1∶0.08～0.12∶0.02～0.04∶0.03～0.05∶0.04～0.06；[0015]取沉淀于-30～-20℃下冷冻8～12hr，于0～10℃下超微粉碎，加入水，在10～15℃下搅拌30～45min，用0.45μm或0.22μm有机过滤膜过滤并取滤液，于-30～-20℃下冷冻8～12hr，即得；按质量计，沉淀和水的用量比为1∶2～3。[0016]进一步优选为：包括以下步骤：[0017](1)前处理

[0018]取新鲜羊胎盘，去除筋膜和血管，水洗，于室温下晾1.5hr；剪切成块，于-25℃下冷冻10hr，于4℃下超微粉碎得到浆液；[0019](2)酶解

[0020]搅拌条件下，向浆液中加入水，加入1.0mol/l的碳酸钠水溶液调节体系pH至7.8，加入胰蛋白酶和Protamex，升温至42℃进行反应，至酶解完全，用滤纸过滤后取滤液，即为酶解液；

[0021]按质量计，浆液、水、胰蛋白酶和Protamex的用量比为1∶5∶0.3∶0.15；[0022](3)提取

[0023]向酶解液中加入乙醇、氯化钠和硅藻土，加入1.0mol/l的盐酸水溶液调节体系pH至6.5，在12℃下搅拌40min，在12℃下以1.8Kg/cm2的压力进行压滤，取上清液，即为粗提液；按质量计，酶解液、乙醇、氯化钠和硅藻土的用量比为1∶0.10∶0.05∶0.06；[0024]向粗提液中加入乙醇、氯化钠、硅藻土和麸皮，加入1.0mol/l的盐酸水溶液调节体系pH至6.9，在4℃下搅拌40min，在4℃下以1.8Kg/cm2的压力进行压滤，取沉淀；按质量计，粗提液、乙醇、氯化钠、硅藻土和麸皮的用量比为1∶0.10∶0.03∶0.04∶0.05；[0025]取沉淀于-25℃下冷冻10hr，于4℃下超微粉碎，加入水，在12℃下搅拌40min，用0.22μm有机过滤膜过滤并取滤液，于-25℃下冷冻10hr，即得；按质量计，沉淀和水的用量比为1∶2.4。

[0026]进一步优选为：步骤(3)的每步中添加的乙醇和水均经过预热处理，预热的温度与其搅拌反应的温度一致。[0027]综上所述，本发明具有以下有益效果：通过化学生物的方法来获得低分子多肽，低分子多肽含量较高，有利于吸收，提高其在护肤品中的吸收和效果；相比现有技术中应用膜或色谱等方法来分离获得，本申请的方法成本更低，减少物质在膜或色谱等上的吸附造成设备需要经常更换的可能性。

具体实施方式

[0028]本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的保护范围内都受到专利法的保护。[0029]实施例1：一种低分子多肽的制备方法，包括以下步骤：[0030](1)前处理

[0031]取新鲜羊胎盘，去除筋膜和血管，水洗，于室温下晾1.5hr；剪切成块，于-25℃下冷冻10hr，于4℃下超微粉碎得到浆液；

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(2)酶解

[0033]搅拌条件下，向浆液中加入水，加入1.0mol/1的碳酸钠水溶液调节体系pH至7.8，加入胰蛋白酶和Protamex，升温至42℃进行反应，至酶解完全，用滤纸过滤后取滤液，即为酶解液；

[0034]按质量计，浆液、水、胰蛋白酶和Protamex的用量比为1∶5∶0.3∶0.15；[0035](3)提取

[0036]向酶解液中加入乙醇、氯化钠和硅藻土，加入1.0mol/1的盐酸水溶液调节体系pH至6.5，在12℃下搅拌40min，在12℃下以1.8Kg/cm2的压力进行压滤，取上清液，即为粗提液；按质量计，酶解液、乙醇、氯化钠和硅藻土的用量比为1∶0.10∶0.05∶0.06；[0037]向粗提液中加入乙醇、氯化钠、硅藻土和麸皮，加入1.0mol/l的盐酸水溶液调节体系pH至6.9，在4℃下搅拌40min，在4℃下以1.8Kg/cm2的压力进行压滤，取沉淀；按质量计，粗提液、乙醇、氯化钠、硅藻土和麸皮的用量比为1∶0.10∶0.03∶0.04∶0.05；[0038]取沉淀于-25℃下冷冻10hr，于4℃下超微粉碎，加入水，在12℃下搅拌40min，用0.22μm有机过滤膜过滤并取滤液，于-25℃下冷冻10hr，即得；按质量计，沉淀和水的用量比为1∶2.4；

[0039]步骤(3)的每步中添加的乙醇和水均经过预热处理，预热的温度与其搅拌反应的温度一致。

[0040]实施例2：一种低分子多肽的制备方法，包括以下步骤：[0041](1)前处理

[0042]取新鲜羊胎盘，去除筋膜和血管，水洗，于室温下晾1hr；剪切成块，于-30℃下冷冻12hr，于0℃下超微粉碎得到浆液；[0043](2)酶解

[0044]搅拌条件下，向浆液中加入水，加入0.8mol/l的碳酸钠水溶液调节体系pH至7.7，加入胰蛋白酶和Protamex，升温至40℃进行反应，至酶解完全，用滤纸过滤后取滤液，即为酶解液；

[0045]按质量计，浆液、水、胰蛋白酶和Protamex的用量比为1∶4∶0.2∶0.1；[0046](3)提取

[0047]向酶解液中加入乙醇、氯化钠和硅藻土，加入0.8mol/l的盐酸水溶液调节体系pH至6.4，在10℃下搅拌45min，在10℃下以2.0Kg/cm2的压力进行压滤，取上清液，即为粗提液；按质量计，酶解液、乙醇、氯化钠和硅藻土的用量比为1∶0.08∶0.04∶0.05；[0048]向粗提液中加入乙醇、氯化钠、硅藻土和麸皮，加入0.8mol/l的盐酸水溶液调节体系pH至6.8，在3℃下搅拌45min，在3℃下以2.0Kg/cm2的压力进行压滤，取沉淀；按质量计，粗提液、乙醇、氯化钠、硅藻土和麸皮的用量比为1∶0.08∶0.02∶0.03∶0.04；[0049]取沉淀于-30℃下冷冻12hr，于0℃下超微粉碎，加入水，在10℃下搅拌45min，用0.45μm有机过滤膜过滤并取滤液，于-30℃下冷冻12hr，即得；按质量计，沉淀和水的用量比为1∶2；

[0050]步骤(3)的每步中添加的乙醇和水均经过预热处理，预热的温度与其搅拌反应的温度一致。

[0051]实施例3：一种低分子多肽的制备方法，包括以下步骤：

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(1)前处理

[0053]取新鲜羊胎盘，去除筋膜和血管，水洗，于室温下晾2hr；剪切成块，于-20℃下冷冻8hr，于10℃下超微粉碎得到浆液；[00](2)酶解

[0055]搅拌条件下，向浆液中加入水，加入1.1mol/l的碳酸钠水溶液调节体系pH至7.8，加入胰蛋白酶和Protamex，升温至43℃进行反应，至酶解完全，用滤纸过滤后取滤液，即为酶解液；

[0056]按质量计，浆液、水、胰蛋白酶和Protamex的用量比为1∶6∶0.4∶0.2；[0057](3)提取

[0058]向酶解液中加入乙醇、氯化钠和硅藻土，加入1.1mol/l的盐酸水溶液调节体系pH至6.6，在15℃下搅拌30min，在15℃下以1.6Kg/cm2的压力进行压滤，取上清液，即为粗提液；按质量计，酶解液、乙醇、氯化钠和硅藻土的用量比为1∶0.12∶0.06∶0.08；[0059]向粗提液中加入乙醇、氯化钠、硅藻土和麸皮，加入1.1mol/l的盐酸水溶液调节体系pH至7.0，在5℃下搅拌30min，在5℃下以1.6Kg/cm2的压力进行压滤，取沉淀；按质量计，粗提液、乙醇、氯化钠、硅藻土和麸皮的用量比为1∶0.12∶0.04∶0.05∶0.06；[0060]取沉淀于-20℃下冷冻8hr，于10℃下超微粉碎，加入水，在15℃下搅拌30min，用0.22μm有机过滤膜过滤并取滤液，于-20℃下冷冻8hr，即得；按质量计，沉淀和水的用量比为1∶3；

[0061]步骤(3)的每步中添加的乙醇和水均经过预热处理，预热的温度与其搅拌反应的温度一致。

[0062]性能表征[0063]1、凝胶层析法测定分子量[00]用0.1mol/l的Tris-HCl洗脱液平衡处理SphedexG-25凝胶柱后，在波长λ＝220nm的条件下，检测浓度为2mg/ml的标准物质：还原型古光甘肽(307Da)、缩宫素(1008Da)和胰高血糖素(3483Da)的凝胶色谱，根据标准物质分子量对数(lgMr)和洗脱体积(Ve)得到标准曲线和回归方程。取浓度为5mg/ml的测试样品在上述同样条件下进行分析，将样品的出峰体积和标准曲线进行比较，得到样品的分子量及其分布范围。用峰面积归一法确定不同分子量范围多肽的相对百分含量。平行试验3次，取平均值。[0065]测试结果如表1所示。表1显示，实施例1-3中分子量＞5000Da的含量均低于1.5％，分子量＜1000Da的含量均高于87％，明显优于化妆品对分子量低于1.5KDa的要求；其中实施例1为最佳。

[0066]表1凝胶层析法测定分子量结果

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2、体外抗氧化能力测定

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测定原理：二苯代苦味酰基自由基(DPPH，C18H12N5O6)是一种很稳定的以氮为中心

的自由基，若受试物能清除它，则提示受试物具有清除羟基自由基、烷自由基或过氧自由基等作用。DPPH乙醇水溶液呈深蓝色，在520nm有强吸收，用分光光度计可测定其吸光度，加入受试物后，因清除DPPH而引起吸光度减少。根据吸光度变化情况可评价受试物清除DPPH的能力。

[0070]样品测定：①向10ml试管中依次加入pH值6.88标准磷酸盐缓冲溶液4ml，0.1777mol/l DPPH溶液4ml，混匀；②再加入待测样品溶液，蒸馏水补充体积至10.00ml，充分混匀；③10min后在520nm处测定吸光度；每组样品重复测定三次，取平均值；④对DPPH自由基的清除率＝[1-(A1-A2)/A3]×100％；A1表示加待测样品反应后DPPH溶液吸光度；A2表示不加DPPH，只加待测样品和水的溶液吸光度；A3表示未加待测样品，只加DPPH及水的溶液的吸光度。平行试验3次，取平均值。[0071]结果如表2所示。表2显示，和酶解液相比，实施例1-3对DPPH自由基的清除率更高，其中实施例1为最佳。

[0072]表2体外抗氧化能力测定结果

[0073]

以上内容不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明，对于本发明所属技术领

域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明由所提交的权利要求书确定的专利保护范围。

[0074]

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